ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ УСТОЙЧИВОСТИ ОРОФАРИНГЕАЛЬНЫХ СТРЕПТОКОККОВ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ СРЕДСТВАМ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ И БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

doi: 10.17116/terarkh201587851-57

© Коллектив авторов, 2015

Генетические детерминанты устойчивости орофарингеальных стрептококков к антибактериальным средствам у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких и больных

С.В. ФЕДОСЕНКО1, Л.М. ОГОРОДОВА1, Е.Н. ИЛЬИНА2, М.Е. СЕНИНА3, Е.С. ЛИСИЦИНА3, М.А. КАРНАУШКИНА4, Е.С. КОСТРЮКОВА2 5, В.М. ГОВОРУН25, И.А. ДЕЕВ1, Е.С. КУЛИКОВ1, Н.А. КИРИЛЛОВА1

ЧГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Томск, Россия; 2ФГБУН «НИИ физико-химической медицины» ФМБА России, Москва, Россия; 3ООО «Научно-производственная фирма «Литех», Москва, Россия; 4ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, Москва, Россия; 5ГБОУ ВПО «Казанский (Приволжский) Федеральный Университет» Минобрнауки России, Казань, Россия

Genetic determinants of antibiotic resistance in oropharyngeal streptococci in patients with chronic obstructive pulmonary disease and in those with asthma

S.V. FEDOSENKO1, L.M. OGORODOVA1, E.N. ILYINA2, M.E. SENINA3, E.S. LISITSINA3, M.A. KARNAUSHKINA4, E.S. KOSTRYUKOVA2, 5, V.M. GOVORUN2, 5, I.A. DEEV1, E.S. KULIKOV1, N.A. KIRILLOVA1

'Siberian State Medical University, Ministry of Health of Russia, Tomsk, Russia; 2Research Institute of Physicochemical Medicine, Federal Biomedical Agency of Russia, Moscow, Russia; 3Lytech Co., LTD, Moscow, Russia; 4A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, Ministry of Health of Russia, Moscow, Russia; 5Kazan Federal (Volga Region) University, Ministry of Education of Science of Russia, Kazan, Moscow

Цель исследования. Видовая идентификация орофарингеальных стрептококков и анализ генетических детерминант устойчивости к антибактериальным препаратам (АБП) у больных бронхиальной астмой (БА) и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ).

Материалы и методы. С помощью экспериментальной диагностической панели «Стрептопол+» (OOO «НПФ «Литех») по принципу мультиплексной полимеразной реакции в реальном времени выполнен анализ представленности генов устойчивости в АБП (mef и ermB) и исследован видовой состав стрептококков, изолированных из образцов орофарингеальных мазков 89 пациентов со стабильным течением ХОБЛ по сравнению с образцами 51 больного БА.

Результаты. В стабильный период заболевания Streptococcus рneumoniaе в орофарингеальных мазках определялся у 7,8% пациентов с БА и 6,74% больных ХОБЛ, общей чертой для которых является склонность к тяжелому течению заболевания и наличию повторяющихся эпизодов обострения с потребностью в назначении АБП. В 42,9% случаев в орофарингеальных мазках у больных БА и ХОБЛ в отсутствие обострений обнаружен S. pyogenus. Гены mef обнаружены у 100% пациентов с БА и ХОБЛ в орофарингеальных мазках, в то время как ген ermB встречался у 91% больных ХОБЛ и у 82,4% пациентов с БА. У больных ХОБЛ выявлена прямая корреляция степени представленности гена ermB с выраженностью продукции мокроты и индексом курения. Гены mef и ermB напрямую коррелировали с частотой обострений у больных ХОБЛ. Заключение. Идентифицированные стрептококки служат резервуаром генетических детерминант устойчивости к АБП — генов mef и ermB, кодирующих механизмы устойчивости к лекарственным препаратам стрептококков к воздействию макролидов. Уровень представленности указанных генов прямо коррелирует с частотой обострений и количеством эпизодов приема АБП.

Ключевые слова: ХОБЛ, бронхиальная астма, стрептококки, устойчивость к антибактериальным препаратам, гены, mef, ermB.

Aim. To identify oropharyngeal Streptococcus species and to analyze the genetic determinants of antibiotic resistance in patients with asthma and in those with chronic obstructive pulmonary disease (COPD).

Materials and methods. An experimental diagnostic Streptopol+ (Lytech Co. LTD) panel based on a multiplex real-time PCR was applied to investigate the representation of antimicrobial resistance genes (mef and ermB) and the species composition of streptococci isolated from oropharyngeal swab samples from 89 patients with stable COPD and from 51 patients with asthma. Results. In the stable disease period, the oropharyngeal swabs were found to contain Streptococcus pneumoniae in 7.8% of the patients with asthma and in 6.74% of those with COPD; the common feature of these groups was a tendency towards a severe disease course and recurrent exacerbations requiring antibiotics. S. pyogenus was detected in 42.9% of the oropharyngeal swabs from COPD and asthma patients without exacerbations. The oropharyngeal swabs showed the mef gene in 100% of the patients with asthma and in 100% of those with COPD; the ermB gene was encountered in 91% of the patients with COPD and in 82.4% of those with asthma. The COPD patients displayed a direct correlation between the representation of the ermB gene and sputum production and smoking index. The mef and ermB genes were directly correlated with the frequency of exacerbations in patients with COPD. Conclusion. The identified streptococci are a reservoir of antimicrobial resistance genetic determinants - the mef and ermB genes encoding the mechanisms of streptococcal macrolide resistance. The representation of the above genes directly correlates with the frequency of exacerbations and the number of antimicrobial drug uses.

Keywords: chronic obstructive pulmonary disease, asthma, streptococci, antimicrobial resistance, genes, mef, ermB.

й астмой

Резюме

АБП — антибактериальные препараты

АБТ — антибактериальная терапия

БА — бронхиальная астма

ГКС — глюкокортикостероиды

ИГКС — ингаляционные ГКС

КДБА — короткодействующие |32-агонисты

ОФВ1 — объем форсированного выдоха за 1-ю секунду

ПЦР — полимеразная цепная реакция

СГКС — системные ГКС

ТШХ — тест с 6-минутной ходьбой

ФЖЕЛ — форсированная жизненная емкость легких

ХОБЛ — хроническая обструктивная болезнь легких

шМЯС — Модифицированная шкала оценки нарушения

дыхания

SatО2 — насыщение артериальной крови кислородом

Выраженные вентиляционные нарушения у больных хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) и бронхиальной астмой (БА) представляют сильный фактор риска бактериальной контаминации дыхательных путей.

Streptococcus pneumoniae — один из наиболее часто выявляемых микроорганизмов, идентифицируемых в дыхательных путях пациентов с ХОБЛ даже в стабильный период без эпизодов обострений и антибиотикотерапии за предшествующие 12 мес [1]. D. Garcha и соавт. [2] указывают на то, что более выраженная контаминация дыхательных путей S. pneumoniae наряду с Haemophilus influenzae и Moraxella catarrhalis вне обострения ассоциирована с более выраженным ограничением скорости воздушного потока — со значительным уменьшением объема форсированного выдоха за 1-ю секунду — ОФВ1 (r=—0,299; p=0,033). Наиболее частой причиной обострений ХОБЛ служит трансформация бактериальной контаминации в инфекционный процесс, что связывают с усугублением

Сведения об авторах:

Огородова Людмила Михайловна — д.м.н., проф., чл.-корр. РАН, зав. каф. факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета ГБОУ ВПО СибГМУ, зам. министра науки и образования Российской Федерации; e-mail: lm-ogorodova@mail.

Ильина Елена Николаевна — д.б.н., e-mail: ilinaen@gmail.com Сенина Мария Евгеньевна — н.с., ООО «НПФ «Литех»; e-mail: senina_maria@mail.ru

Лисицына Евгения Сергеевна — н.с., ООО «НПФ «Литех»; e-mail: lisitsinaes@gmail.com

Карнаушкина Мария Александровна — к.м.н., асс. каф. пульмонологии факультета последипломного образования МГМСУ им. А.И. Евдокимова; e-mail: kar3745@yandex.ru127473 Кострюкова Елена Сергеевна — к.б.н., зав. лаб. постгеномных исследований в биологии ФГБУН «НИИ физико-химической медицины», с.н.с. научно-исследовательской лаб. Омиксные технологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) Федерального университета, e-mail: el-es@yandex.ru

Говорун Вадим Маркович — д.б.н., проф., чл.-корр. РАН, зам. дир. по научной работе ФГБУН «НИИ физико-химической медицины» ФМБА России, г.н.с. научно-исследовательской лаб. Омиксные технологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) Федерального университета, e-mail: govorun@hotmail.ru

Деев Иван Анатольевич — д.м.н., доц. каф. факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета ГБОУ ВПО СибГМУ, e-mail: ivandeyev@yandex.ru

Куликов Евгений Сергеевич — к.м.н., доц. каф. общей врачебной практики и поликлинической терапии ГБОУ ВПО СибГМУ; email: evgeny.s.kulikov@gmail.com

Кириллова Наталья Александровна — к.м.н., асс. каф. общей врачебной практики и поликлинической терапии ГБОУ ВПО СибГМУ, e-mail: kirillova@gmail.com

обструкции бронхов, ухудшением течения и дальнейшим прогрессированием заболевания [3].

Роль микроорганизмов в патогенезе БА неясна. По результатам бактериологического исследования мазков слизистой оболочки гипофарингеальной области от 321 ребенка в возрасте 1 мес у 21% детей обнаружены S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, при этом колонизация одним или несколькими из этих микроорганизмов в значительной степени ассоциирована как с наличием стойких сухих хрипов у детей первых 5 лет жизни, так и с распространенностью диагностированной БА [4]. Часто бактериальная инфекция дыхательных путей обсуждается как фактор, провоцирующий обострения БА и/или служащий причиной сохранения симптомов заболевания. В ряде исследований показано наличие связи между хронической бактериальной инфекцией дыхательных путей и тяжестью БА, а также между бактериальными инфекциями и обострениями болезни [5]. Кроме того, с контаминацией бронхиального дерева S. pneumoniaе, H. influenzae, Klebsiella pneumonia и M. catarrhalis связывают ряд случаев отсутствие достижения контроля БА на фоне базисной терапии [6].

В связи с неоднозначностью вклада бактериальной инфекции в развитие БА, относительно низкой частоты развития зависимых от инфекции обострений БА и отсутствием убедительных данных, подтверждающих рациональность применения антибактериальных препаратов (АБП) при БА, их место в лечении пациентов данной категории остается ограниченным. В отличие от БА целесообразность антибиотикотерапии обострения ХОБЛ более очевидна при наличии соответствующих критериев бактериальной инфекции. Так, назначение антибиотиков широкого спектра действия на фоне обострения ХОБЛ показано при сочетании усиливающихся одышки и кашля с отделением вязкой, увеличивающейся в объеме мокроты, особенно при изменении ее цвета — появлении признаков гнойной мокроты [7].

Следует отметить, что рекомендации по эмпирической антибактериальной терапии (АБТ) учитывают значение пневмококковой инфекции в развитии обострений ХОБЛ и предполагают назначение антибиотиков, обладающих в том числе антипневмококковой активностью (ß-лактамные антибиотики, макролиды и респираторные фторхинолоны). При этом применение респираторных фторхинолонов показано при осложненном обострении ХОБЛ, что обусловлено наличием так называемых моди-

Контактная информация:

Федосенко Сергей Вячеславович — к.м.н., докторант каф. госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГБОУ ВПО СибГМУ; e-mail: s-fedosenko@mail.ru

фицируемых факторов риска формирования резистентности микроорганизмов. Для пневмококков такими факторами служат возраст пациента старше 65 лет, терапия ß-лактамами в течение последних 3 мес, алкоголизм, им-муносупрессия (включая терапию глюкокортикостерои-дами — ГКС), наличие нескольких сопутствующих заболеваний [7]. В настоящее время устойчивые к макролидам и пенициллинам стрептококки встречаются в Европе примерно в 30% случаев [8], в России — в 5,6% [9].

Ввиду того что сложно морфологически отличить S. pneumoniae от других а-гемолитических (или «зеленящих») стрептококков при исследовании образцов из респираторного тракта культуральными методами [10], в последние годы предложены генетические тесты для достижения корректной видовой идентификации S. pneumoniae, в том числе непосредственно в клиническом материале [11, 12]. Кроме того, описаны генетические механизмы формирования устойчивости стрептококков к макролидам. Первый вариант реализуется за счет приобретения гена ermB (erythromycin-resistance methylase), что приводит к фенотипической устойчивости к эритромицину, кларитромицину, азитромицину и к клиндамицину [13]. Другой путь связан с приобретением генов mef, кодирующих зависимые от АТФ белки, активно выводящие антибиотики из бактериальной клетки. Наличие генов mef приводит к слабой устойчивости к макролидам, и микроорганизм остается чувствительным к клиндамицину [14]. При этом резервуаром генетических детерминант устойчивости считаются непатогенные S. mitis и S. oralis.

Целью данного исследования явились оценка результатов видовой идентификации и анализ генетических детерминант устойчивости к АБП стрептококков, изолированных из образцов орофарингеальных мазков пациентов со стабильным течением ХОБЛ по сравнению с аналогичными образцами от больных БА с помощью экспериментальной диагностической панели «Стрептопол+» (OOO «НПФ «Литех»).

Материалы и методы

Методом случайной выборки в исследование включены 140 мужчин и женщин. Среди них 89 пациентов, страдающих ХОБЛ (средний возраст 58,03+8,6 года), и 51 больной БА (средний возраст 51,6+12,3 года). Все пациенты на момент включения в исследование характеризовались стабильным течением, длительностью болезни не менее 12 мес без эпизодов обострений на протяжении предшествующих 4 нед и системной антибиотикотера-пии в течение 12 нед до момента включения. По результатам скринингового обследования в исследование включили 64 пациента со стабильной ХОБЛ средней степени тяжести (по классификации GOLD, 2010), 33 пациента со стабильной ХОБЛ тяжелого и очень тяжелого течения (по классификации GOLD, 2010), 23 пациента с легкой контролируемой и частично контролируемой БА и 28 больных БА тяжелого неконтролируемого течения.

У участников исследования взяты орофарингеальные мазки с помощью стерильной палочки с ватным тампоном на конце, помещаемой в пробирку. Экстракцию ДНК выполняли с использованием набора FastDNA SPIN Kit for Soil («MPBIO», США) согласно протоколу, оптимизированному сотрудниками National Heart and Lung Institute (Лондон, Великобритания) для повышения выхода ДНК. Выделение ДНК выполнено на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО Сиб-ГМУ Минздрава России (Томск, Россия). Выделенную ДНК хранили при температуре —20 °С до проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Видовая идентификация стрептококков и анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости выполнены с использованием экспериментального набора «Стрептопол+» производства OOO «НПФ «Литех» (Москва, Россия) согласно протоколу производителя.

Диагностическая тест-система «Стрептопол+» реализует принцип количественной ПЦР с регистрацией сигнала в реальном времени и включает два триплексных набора: 1) Streptococcus spp. (FAM)/S. pyogenus (HEX)/S. agalacticae (ROX); 2) S. pneumoniae (FAM)/M/ (HEX)/&m (ROX).

В каждом тестируемом образце выполнена амплификация внутреннего контроля (детектируемого по каналу Cy5), что свидетельствует об адекватности проведенных процедур пробопод-готовки и отсутствии ингибирования ПЦР.

Статистический анализ выполнен с использованием программы Statistica 10.0. Поиск признаков, по которым различаются группы образцов, проведен при помощи теста Манна—Уитни, анализ корреляционных связей — по методу Спирмена.

Результаты

В целом группа больных БА отличалась от пациентов с ХОБЛ меньшими индексом курения, количеством эпизодов обострений и курсов антибиотикотерапии в течение года. Пациенты с БА характеризовались менее выраженным кашлем и продукцией мокроты, однако демонстрировали более частое применение системных ГКС (СГКС) на протяжении предшествующих 12 мес и короткодействующих ß2-агонистов (КДБА) в сутки, а также более высокие уровни ОФВ1 до и после бронходилатационного теста (табл. 1).

У пациентов с ХОБЛ средней степени тяжести по сравнению с больными ХОБЛ тяжелого и очень тяжелого течения отмечались меньшая частота обострений и госпитализаций за предшествующий год, более редкие эпизоды приема СГКС, менее выраженная суточная потребность в КДБА и тяжесть одышки по Модифицированной шкале оценки нарушения дыхания (mMRC), более высокая толерантность к физической нагрузке по результатам теста с 6-минутной ходьбой (ТШХ) и большее насыщение артериальной крови кислородом (Sat02) до нагрузки и после нее, а также более высокий ОФВ1 до бронходилатации в стандартной пробе с сальбутамолом и после нее (табл. 2).

Схожие закономерности наблюдались и в группе больных БА. У пациентов с менее выраженной тяжестью заболевания в отличие от больных тяжелой неконтролируемой БА наблюдались относительно редкие эпизоды обострения. На протяжении предшествующих 12 мес пациенты с легкой персистирующей БА не госпитализировались по поводу обострения, большинство из них не нуждалось в применении СГКС. Данная группа больных отличалась сопоставимо более редкой среднесуточной потребностью в применении КДБА, лучшими оценками по шкале mMRC и ACT-тесту, их реже беспокоили кашель и отделение мокроты. Пациенты с легкой контролируемой и частично контролируемой БА в отличие от тяжелых больных демонстрировали лучшую переносимость физической нагрузки в ТШХ, большее насыщение артериальной крови кислородом, а также более высокие ОФВ1 и форсированную жизненную емкость легких (ФЖЕЛ) до стандартного теста с сальбутамолом и после него (табл. 3).

Образцы тотальной ДНК, изолированной из орофа-рингеальных мазков больных ХОБЛ (n=89) и БА (n=51), протестированы с помощью экспериментальной диагно-

Таблица 1. Анамнестические и клинико-функциональные характеристики обследованных больных

Показатель Пациенты с БА (п=52) Пациенты с ХОБЛ (п=89) р

Число обострений за 12 мес 1,27+0,98 2,16+1,58 0,00036

Курсы СГКС за 12 мес 0,55+0,76 0,24+0,59 0,0064

Курсы АБТ за 12 мес 0,31+0,78 1,69+1,48 <0,000001

Потребность в КДБА, доза/сут 3,69+3,46 1,94+2,6 0,00072

Индекс курения, пачка/год 2,65+4,54 58,04+33,19 <0,000001

Кашель, баллы 1,2+0,85 1,98+0,79 <0,000001

Мокрота, баллы 0,53+0,64 1,51+0,75 <0,000001

Претестовый ОФВ1, % 73,14+18,43 56,53+14,14 <0,000001

Послетестовый ОфВ.,%^ 78,84+15,57 63,61+15,16 <0,000001

Примечание. Здесь и в табл. 2—4: данные представлены в виде М+m, где М — среднее и m — стандартное отклонение.

Таблица 2. Анамнестические и клинико-функциональные характеристики групп больных ХОБЛ

Показатель ХОБЛ II степени тяжести ХОБЛ Ш—1У степени тяжести р

Число обострений за 12 мес 1,81 + 1,2 2,61+1,7 0,017

Число госпитализаций за 12 мес 0,12+0,3 0,54+0,7 0,0002

Курсы СКС за 12 мес 0,12+0,45 0,45+0,7 0,008

Потребность в КДБА, доза/сут 1,1+1,3 3,64+0,6 0,000001

Оценка по шкале шМЯС, баллы 0,97+0,44 2,48+0,8 <0,000001

Пройденный путь в ТШХ, м 477,5+178 303,6+139 0,000004

SatО до теста, % 97,5+1,23 95,82+1,16 <0,000001

SatO после теста, % 96,97+1,65 94,24+1,6 <0,000001

ОФВ1, л пре 1,9+0,57 1,08+0,36 0,00007

ОФВР % пре 64+9,7 41,57+8,6 <0,000001

ОФВ1, л пост 2,14+0,59 1,31+0,55 0,0003

ОФВ,, % пост 71,34+9,97 48,14+11,5 <0,000001

Таблица 3. Анамнестические и клинико-функциональные характеристики групп больных БА

Показатель Легкая контролируемая и частично контролируемая БА Тяжелая неконтролируемая БА р

Частота обострений за 12 мес 0,65+0,71 1,75+0,87 0,000008

Частота госпитализаций за 12 мес 0 0,43+0,5 0,00017

Курсы СКС за 12 мес 0,13+0,34 0,89+0,83 0,00015

Потребность в КДБА, доза/сут 1,09+1,56 5,82+3,11 <0,000001

Оценка по шкале шМЯС, баллы 0,69+0,63 2,64+0,78 <0,000001

АСТ, баллы 21+3,16 13,59+3,53 <0,000001

Кашель, баллы 0,69+0,82 1,61+0,62 0,000044

Мокрота, баллы 0,22+0,51 0,78+0,63 0,0011

Пройденный путь в ТШХ, м 368,48+70,98 226,25+50,27 <0,000001

SatО2 до теста, % 96,91+0,42 95,89+1,13 0,00016

SatO2 после теста, % 96,91+0,29 95,68+1,49 0,00029

Претестовый ОФВ1, л 2,43+0,77 1,88+0,75 0,014

Претестовый ОФВ1, % 84,07+15,28 63,84+15,71 0,000032

Претестовый ФЖЕЛ, % 98,74+18,93 74,11+14,41 0,007

Послетестовый ОфВ.%^ 87,79+11,56 73,47+15,35 0,0035

стической панели «Стрептопол+» (ООО «НПФ «Литех»). Достоверно стрептококки определялись в 83 (93,3%) из 89 образцах от пациентов с ХОБЛ и в 50 (98%) из 51 образцах от пациентов с БА. У одного пациента с ХОБЛ стрептококки в мазке не обнаружены, 6 образцов (5 от пациентов с ХОБЛ и 1 от больного БА) попали в так называемую серую зону, характерную для низких титров ДНК.

Гены mef обнаружены у всех пациентов с ХОБЛ. Ген ermB в проанализированной группе больных ХОБЛ встречался реже, чем mef, и обнаружен в 81 (91%) образце, из которых в 28 (31,3%) результат его идентификации расценен как слабоположительный. Вероятно, наличие генов устойчивости орофарингеальной микробиоты у больных ХОБЛ может быть связано с высокой частотой зависимых

от инфекционного процесса обострений, ассоциированных с применением АБП в группе пациентов с ХОБЛ. Так, только 6 из всей группы обследованных больных ХОБЛ характеризовались отсутствием обострений на протяжении предшествующих 12 мес. Эти пациенты относились к группе больных ХОБЛ средней степени тяжести (степень II по классификации GOLD, 2010) со слабо выраженными (<2 баллов по шкале mMRC) или выраженными (>2 балла по шкале mMRC) симптомами заболевания и низким риском развития обострений (типы А и В по классификации GOLD, 2011). Следует отметить, что у 5 из них стрептококки орофарингеальных мазков также отличались отсутствием гена ermB. В целом в группе больных ХОБЛ средней степени тяжести частота обострений составила 1,81±1,2 за год, а у пациентов с тяжелым и очень тяжелым течением — 2,6±1,7 за год. При этом данные группы больных характеризовались статистически значимыми различиями по частоте обострений (p=0,017). У 34 (38,2%) обследованных пациентов с ХОБЛ за предшествующий год зарегистрировано по 1 эпизоду обострения, у 19 (21,35%) — по 2 эпизода, у 14 (15,73%) на протяжении года развилось 3 эпизода обострения ХОБЛ и у 16 (17,97%) — 4 эпизода и более. Следует отметить, что частота курсовой терапии АБП по поводу респираторных инфекций в группе обследованных больных ХОБЛ существенно варьировала — от 0 у пациентов с ХОБЛ средней степени тяжести до 5—6 эпизодов у больных тяжелого и очень тяжелого течения заболевания (средняя частота 1,69+1,48 эпизода в год).

У пациентов с БА ген mef также обнаружен во всех образцах, 2 из которых оценены как слабоположительные по содержанию данного гена. В группе пациентов с БА гены ermB встречались несколько реже, чем в образцах больных ХОБЛ, — в 42 (82,4%) из 51; из них слабоположительный результат идентификации гена определен для 21 (41,2%). Следует отметить, что группа пациентов с БА, в образцах мазков которых отсутствовали гены ermB, не характеризовалась единообразием по тяжести заболевания и количеству обострений за прошедший год, однако всем этим больным не проводилась антибиотикотерапия на протяжении предшествующих 12 мес. В то же время статистически значимые различия по представленности гена ermB между группами образцов орофарингеальных мазков от больных БА и ХОБЛ, а также внутри группы пациентов с БА не выявлены.

С целью оценки уровня представленности генов mef и ermB в образцах выполнен анализ количественных данных по циклам выхода сигнала амплификации данных генов. Косвенно величина, обратная значению цикла выхода, отражает степень представленности анализируемых генетических детерминант устойчивости. При проведении корреляционного анализа в обобщенной группе образцов мазков ротоглотки у больных БА и ХОБЛ отмечена прямая связь между уровнем представленности генов mef и ermB (r=0,55; p=1,54E—11). Схожий характер корреляции сохранялся и при изолированном анализе по группе ХОБЛ (r=0,55; р=3,09Е—08), а также в группе больных БА (r=0,58; р=0,000088).

Кроме того, выполнен корреляционный анализ по Спирмену между уровнем представленности генов mef и ermB (по значениям циклов выхода сигнала амплификации данных генов) и некоторыми клинико-функциональ-

ными характеристиками. Так, в группе больных ХОБЛ высокая представленность гена ermB в образце соотносилась с более высоким индексом курения и статистически значимо коррелировала с более частыми обострениями ХОБЛ у пациентов, увеличением частоты приема АБП и более выраженной продукцией мокроты (табл. 4).

Схожие результаты у пациентов с ХОБЛ получены при анализе представленности гена mef — высокая представленность этого гена статистически значимо ассоциировалась с частыми эпизодами обострения ХОБЛ и большим числом курсов АБТ за предшествующие 12 мес (см. табл. 4).

В группе больных БА выявлена прямая корреляция между представленностью гена ermB и частотой антибио-тикотерапии за предшествующий год (r=0,37; р=0,037).

С целью анализа ассоциации наличия стрептококков в образцах орофарингеальных мазков у больных БА и ХОБЛ с клиническими признаками посчитана безразмерная величина (AQ), отражающая разность между пороговыми значениями накопления сигнала от ДНК человека и от ДНК стрептококков. Опосредованно эта величина характеризует степень бактериального обсеменения. Для исследованной выборки («=140) полученные значения варьировали от -7,34 до 19,9. Анализ частот распределения позволил отнести 34 (24,3%) из 140 образцов в группу с низким обсеменением, 92 (65,7%) — в группу с высоким бактериальным обсеменением, 14 (10%) — в «серую» зону. При проведении корреляционного анализа в обобщенной группе больных БА и ХОБЛ выявлено, что уровень обсе-мененности стрептококками орофарингеальных мазков прямо коррелирует с представленностью генов mef (r=0,51; p=6,04E—10) и ermB (r=0,29; p=0,001). При изолированном анализе в группе БА значение AQ также прямо коррелировало с представленностью генов mef (r=0,57; p=0,000019) и ermB (r=0,57; p=0,0001); у пациентов с ХОБЛ большее значение AQ в образцах соотносилось с более высокой представленностью гена mef (r=0,45; р=0,000009).

По данным видовой идентификации в группе больных ХОБЛ S. pneumoniae достоверно определялся в 2 образцах, еще в 4 (6,74%) наблюдался слабоположительный сигнал. Во всех этих образцах имелись гены mef. Гены ermB обнаруживались в 5 (83,3%) образцах из 6. У 2 пациентов в данной группе заболевание характеризовалось тяжелым течением, высоким риском развития обострения (2 эпизода и более за 12 мес) и потребностью в применении антибиотиков один эпизод или более в год. Так, у одного из этих больных на протяжении 12 мес зарегистрированы 6 эпизодов обострения ХОБЛ, ассоциированных с назначением АБТ. При этом в 2 случаях обострения у данного больного использовались макролидные антибиотики (азитромицин и кларитромицин). Еще у 2 пациентов из группы ХОБЛ с выявленным S. pneumoniae зарегистрирована средняя степень тяжести по спирометрической классификации GOLD (2010), высокий риск развития обострения (2 и 4 эпизода обострения) и один эпизод назначения АБТ за предшествующие 12 мес. У 2 пациентов со средней степенью тяжести ХОБЛ риск обострений определен как низкий и назначения АБТ за 12 мес не бы-

Среди пациентов с БА S. pneumoniae определялся в 4 (7,8%) образцах, однако в низких (слабоположительных)

Таблица 4. Анализ корреляционных связей между представленностью генов те^ и егтВ с клинико-анамнестическими характеристиками больных ХОБЛ

Представленность гена в образце Клинико-анамнестический признак n r Р

mef Частота обострений 88 0,25 0,018

mef Частота курсов АБТ 88 0,27 0,010

ermB Частота обострений 87 0,30 0,0045

ermB Частота курсов АБТ 87 0,49 0,000002

ermB Продукция мокроты 87 0,30 0,0045

ermB Индекс курения 87 0,32 0,0022

Примечание. n — число исследованных образцов и пациентов; r — коэффициент корреляции.

титрах. Следует отметить, что эти пациенты с БА относились к группе частично контролируемой и неконтролируемой БА и перенесли на протяжении предшествующих 12 мес минимум по 1 эпизоду обострения заболевания. При этом у 2 пациентов в качестве базисной терапии использовались ингаляционные ГКС (ИГКС) в низких дозах; еще 2 пациента получали фиксированные комбинации ИГКС и пролонгированных в2-агонистов. Во всех случаях обнаружение ДНК 5. рneumoniaе в образцах мазков больных БА, как и в образцах пациентов с ХОБЛ, сопровождалось выявлением генов те/ и егтВ, предопределяющих устойчивость к макролидам.

Низкие титры (слабоположительный сигнал) 5. pyoge-пш зафиксированы у 60 (42,9%) из совокупной выборки образцов, 5. agalacticae не обнаружено, что закономерно при исследовании биологических проб со слизистых оболочек верхних дыхательных путей.

Большинство стрептококков, выявленных в орофа-рингеальных мазках больных БА и пациентов с ХОБЛ, представлены зеленящими стрептококками группы mitis.

Обсуждение

Согласно результатам видовой идентификации микроорганизмов, изолированных из образцов орофаринге-альных мазков, микробиотический пейзаж дыхательных путей у пациентов со стабильным течением ХОБЛ и больных БА вне обострения характеризуется рядом особенностей. Так, стрептококки, являясь одним из наиболее типичных представителей бактерий-контаминантов слизистой оболочки дыхательных путей у больных БА и ХОБЛ, в большинстве случаев представлены зеленящими стрептококками группы тШз. В стабильный период заболевания 5. рпеитотае в орофарингеальных мазках определяется лишь у 7,8% пациентов с БА и у 6,74% больных ХОБЛ, общей чертой для которых является склонность к тяжелому течению заболевания и наличию повторяющихся эпизодов обострения с потребностью в назначении АБП. В 42,9% случаев в орофарингеальных мазках у больных БА и ХОБЛ в отсутствие обострений обнаруживается 5. pyogenus. При этом статистически значимых различий по частоте его выявления между группами больных нет.

Идентифицированные стрептококки являются резервуаром генетических детерминант устойчивости к АБП — генов те/и егтВ, которые кодируют механизмы устойчивости стрептококков к воздействию макролидных антибиотиков, а гены егтВ также ответственны за развитие

невосприимчивости стрептококков и стафилококков к линкозамидам и стрептограминам. Степень представленности этих генов в мазках различается между пациентами и прямо коррелирует с выраженностью обсемененности образца стрептококками, при этом уровни их представленности находятся в прямой зависимости друг от друга. Следует отметить, что гены mef обнаружены у 100% пациентов с БА и ХОБЛ в орофарингеальных мазках, в то время как ген ermB встречался у 91% больных ХОБЛ и у 82,4% пациентов с БА. Примечательно, что образцы мазков без гена ermB принадлежали больным ХОБЛ, характеризовавшимся низким риском обострений (по классификации GOLD, 2011), а также пациентам с БА и ХОБЛ, не получавшим на протяжении предшествующих 12 мес антибио-тикотерапию. Вероятно, высокая распространенность генов устойчивости стрептококков дыхательных путей к макролидным антибиотикам в популяции пациентов с хроническими бронхообструктивными заболеваниями, относящихся к группе высокого риска развития эпизодов респираторных инфекций, обусловлена частым, порой бесконтрольным, применением АБП широкого спектра действия, среди которых современные макролиды — одна из наиболее клинически востребованных групп.

Традиционно настороженность медицинского сообщества вызывает рост резистентности микроорганизмов на фоне нерационального применения противомикроб-ных лекарственных средств. Результаты анализа генов антибиотикорезистентности mef и ermB в образцах орофа-рингеальных мазков у больных ХОБЛ и БА также подтверждают, что представленность указанных генов прямо коррелирует с частотой эпизодов приема АБП.

Важно, что представленность указанных генов в образцах орофарингеальных мазков соотносится с некоторыми клинико-анамнестическими особенностями течения заболевания у больных ХОБЛ. Так, выявлена прямая корреляция представленности гена ermB с выраженностью продукции мокроты и индексом курения при ХОБЛ; гены mef и ermB напрямую коррелирует с частотой обострений у больных ХОБЛ.

Заключение

Приобретение на фоне повторяющихся эпизодов противомикробной терапии пациентом с ХОБЛ контами-нантной микробиоты дыхательных путей, характеризующейся сниженной чувствительностью к антибиотикам широкого спектра действия, благоприятствует дальней-

шей бактериальной колонизации респираторного тракта и препятствует эффективной эрадикации возбудителя. Это может обусловливать увеличение частоты обострений и более тяжелое течение болезни, снижая эффективность базисной терапии.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №НК 13-04-01854 и федеральной целевой программы

«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014—2020 годы» (ГК №14.604.21.0075, уникальный идентификатор КРМЕР160414Х0075), с использованием оборудования Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского Федерального (Приволжского) Университета (ГК №14.594.21.0003, уникальный идентификатор КРМЕР!59414Х0003).

ЛИТЕРАТУРА

1. Cabrera-Rubio R, Garcia-Núñez M, Setó L, Antó JM, Moya A, Monsó E, Mira A. Microbiome diversity in the bronchial tracts of patients with chronic obstructive pulmonary disease. J Clin Microbiol. 2012;50(11):3562-3568.

doi:10.1128/JCM.00767-12.

2. Garcha DS, Thurston SJ, Patel AR, Mackay AJ, Goldring JJ, Donaldson GC, McHugh TD, Wedzicha JA. Changes in prevalence and load of airway bacteria using quantitative PCR in stable and exacerbated COPD. Thorax. 2012;67(12):1075-1080.

doi:10.1128/JCM.00767-12.

3. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease [Electronic resource]. Update 2011. Mode of access: http://www.goldcopd.com/Guide-lineItem.asp?intId=989.

4. Bisgaard H, Hermansen MN, Bonnelykke K, Stokholm J, Baty F, Skytt NL, Aniscenko J, Kebadze T, Johnston SL. Association of bacteria and viruses with wheezy episodes in young children: prospective birth cohort study. BMJ. 2010;341:4978. doi:http://dx.doi.org/10.1136/bmj.c4978.

5. Hilty M, Burke C, Pedro H, Cardenas P, Bush A, Bossley C, Da-vies J, Ervine A, Poulter L, Pachter L, Moffatt MF, Cookson WO. Disordered microbial communities in asthmatic airways. PLoS One. 2010;5(1):e8578. doi:10.1371/journal.pone.0008578.

6. Чучалин А.Г., Авдеев С.Н., Архипов В.В., Бабак С.Л. Рациональная фармакотерапия заболеваний органов дыхания: Руководство для практикующих врачей. М.: Литтерра; 2004:874.

7. Пульмонология. Национальное руководство. Под ред. акад. РАМН Чучалина А.Г. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2013:768.

8. Reinert RR, Ringelstein A, van der Linden M, Cil MY, Al-Lah-ham A, Schmitz FJ. Molecular Epidemiology of Macrolide-Re-sistant Streptococcus pneumoniae Isolates in Europe. J Clin Microbiol. 2005;43:1294-1300.

9. Страчунский Л.С., Кречикова О.И., Решедько Г.К. Чувствительность к антибиотикам пневмококков, выделенных от здоровых детей из организованных коллективов. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 1999; 1(1):31-39.

10. Facklam R. What happed to the streptococci: overview of taxo-nomic and nomenclature changes. Clin Microbiol Rev. 2002;15:613-630.

11. Corless CE, Guiver M, Borrow R, Edwards-Jones V, Fox AJ, Kaczmarski EB. Simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, and Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-time PCR. J Clin Microbiol. 2001;39:1553-1558.

12. McAvin JC, Reilly PA, Lohman KL. Sensitive and specific method for rapid identification of Streptococcus pneumoniae using real-time fluorescence PCR. J Clin Microbiol. 2001;39:3446-3451.

13. Farrell DJ, Morrissey I, Bakker S, Morrissey I, Bakker S, Morris L, Buckridge S, Felmingham D. Molecular Epidemiology of Mul-tiresistant Streptococcus pneumoniae with Both ermB- and mef(A)-Mediated Macrolide Resistance. J Clin Microbiol. 2004; 42:764-768.

14. Reinert RR, Ringelstein A, van der Linden M. Molecular Epidemiology of Macrolide-Resistant Streptococcus pneumoniae Isolates in Europe. J Clin Microbiology. 2005;43:1294-1300.

Поступила 23.12.2014