CC BY
11
УДК 577.24
Генетическая вариабельность основной помпы множественной лекарственной устойчивости AcrAB-TolC определяет резистентность грамотрицательных бактерий к SkQ1
П. A. Назаров1,2*, Е. A. Котова1, В. П. Скулачев1,3, Ю. Н. Антоненко1
1НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992 Россия 2Митотех, Москва, 119991 Россия
3НИИ митоинженерии, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
Москва, 119991 Россия
*E-mail: nazarovpa@gmail.com
Поступила в редакцию 16.10.2019
Принята к печати 18.11.2019
DOI: 10.32607/20758251-2019-11-4-93-98
РЕФЕРАТ Новый антибиотик SkQ1, действующий на бактериальную биоэнергетику, очень эффективен против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Однако некоторые грамотрицательные бактерии, такие, как Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae, проявляют к нему высокую устойчивость, причем у различных грамотрицательных бактерий эта устойчивость определяется идентичностью аминокислотных последовательностей белка-транспортера AcrB и соответствующего белка из E. coli. SkQ1 откачивается из клеток E. coli с помощью основной помпы множественной лекарственной устойчивости AcrAB-TolC. Нами показано, что устойчивость E. coli к SkQ1, в отличие от устойчивости к хлорамфениколу, не зависит от малого вспомогательного белка помпы - AcrZ.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА SkQ1, AcrZ, помпа AcrAB-TolC, множественная лекарственная устойчивость.
ВВЕДЕНИЕ
SkQ1 - пластохинон, конъюгированный с децилтри-фенилфосфонием, - является представителем нового класса антибиотиков, которые влияют непосредственно на бактериальную биоэнергетику. Благодаря способности подавлять рост широкого спектра грамотрицательных и грамположительных бактерий SkQ1 может найти применение в медицине и сельском хозяйстве, поэтому важным представляется изучение его влияния на микробные экосистемы и развитие устойчивости к нему. Нами показано [1, 2], что устойчивость бактерии Escherichia coli к SkQ1 обусловлена наличием специфической помпы множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) AcrAB-TolC (рис. 1), определяющей резистентность к широкому спектру антибиотиков, поверхностно-активных веществ, солей желчных кислот, красителей и малых органических молекул [3]. Однако в нашей работе [1] не были проанализированы все TolC-зависимые помпы, а именно предполагаемая TolC-зависимая помпа EmrKY-TolC и EntS, а также белок AcrZ. Известно,
что состоящий из 49 аминокислотных остатков небольшой вспомогательный белок внутренней мембраны AcrZ (он же YbhT) связывается с комплексом AcrAB-TolC, в состав которого входят белки AcrA, AcrB и TolC, и повышает способность помпы откачивать из клетки определенные классы субстратов, такие, как тетрациклин, пуромицин и хлорамфени-кол [4].
Бактерии обладают генетической пластичностью, что позволяет им реагировать на широкий спектр экологических угроз, таких, как антибиотики. Бактерии используют две основные генетические стратегии выживания: (1) приобретение детерминант устойчивости посредством горизонтального переноса гена и (2) мутации, связанные с мишенями антибиотиков [5]. Аминокислотные последовательности белков AcrA, AcrB и TolC идентичны у лабораторных субштаммов В и К-12 E. coli [6]. Ранее мы показали, что удаление любого из белков AcrA, AcrB или TolC приводит к полной потере устойчивости к SkQ1 [1]. Расстояние между оперонами TolC и AcrB в хромо-
Грамотрицательные бактерии
ЛПС
НМ,
ПГ
Грамположительные бактерии
Цитоплазма
ПГ
ОХхХООООООСХХЮООООСШХОООООО
Цитоплазма
Рис. 1. Схема клеточной стенки бактерий (ЛПС -липополисахариды, НМ - наружная мембрана, ПГ -пептидогликановый слой) и антибактериальное действие SkQ1 в отношении грамположитель-ных и грамотрица-тельных бактерий. Чувствительность грамотрицательных бактерий к SkQ1 зависит от структуры белков-компонентов помпы АсгАВ-То1С
МИК, мкг/мл МИК, мкг/мл
Escherichia coli 19 Bacillus subtilis 0.6-1.2
Rhodobacter sphaeroides 0.6-1.2 Staphylococcus aureus 0.6-1.2
Photobacterium phosphoreum 0.6-1.2
соме E. coli составляет около 175 т.п.н. [7], таким образом, вероятность приобретения устойчивости, опосредованной помпой AcrAB-TolC, через межвидовой горизонтальный перенос генов очень мала.
На сегодняшний день устойчивость, опосредованная помпой МЛУ, представляет собой единственный известный механизм резистентности к SkQ1, а AcrAB-TolC является единственным известным насосом, удаляющим SkQ1 из клетки. На основании данных о способности малого белка AcrZ регулировать устойчивость к таким антибиотикам, как тетрациклин, пуромицин и хлорамфеникол [4], можно предположить, что устойчивость к SkQ1 также модулируется AcrZ. С другой стороны, резистентность к SkQ1 могла бы модулироваться локальными и глобальными регуляторами транскрипции, а также посредством посттранскрипционной и посттрансляционной регуляции [8].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использованы стандартные лабораторные штаммы E. coli, штаммы MG1655 и W3110 (F-lambda-IN (rrnD-rrE) 1 rph-1). Штаммы E. coli MC1061, DH5a и BL21(DE3) предоставлены С.С. Соколовым (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ), штамм E. coli JM109 - Л.А. Новиковой (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ), штамм E. coli
GR70N получен от Ю.В. Берцовой (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ), штамм E. coli XL1-Blue приобретен у компании «Евроген» (Москва, Россия).
Делеционные штаммы E. coli ECK0751 (лишенные гена acrZ), ECK0584 (лишенные гена entS), ECK2363 (лишенные гена emrY), ECK2364 (лишенные гена emrK) любезно предоставлены H. Niki (National Institute of Genetics, Япония) [9].
Staphylococcus aureus получен из коллекции микроорганизмов МГУ им. М.В. Ломоносова (№ 144). Photobacterium phosphoreum предоставлен А.Д. Исмаиловым (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ). Rhodobacter sphaeroides получен от G. Klug (Institute for Microbiology and Molecular Biology at Justus-Liebig-University of Giessen, Германия).
Бактериальные клетки выращивали при 37°С в среде LB или Мюллера-Хинтона при частоте встряхивания 140 об / мин как описано в [1].
Исследование устойчивости к SkQ1 осуществляли методом двойных разведений в жидкой питательной среде с использованием панелей собственного производства согласно рекомендациям Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI). Для исследования была использована жидкая среда Мюллера-Хинтона (HIMEDIA, Мумбай, Индия). Панель концентраций готовили в 96-луночном микротитро-
Таблица 1. Восприимчивость бактерий к SkQ1: измерения минимальной ингибирующей концентрации (МИК). Сравнение активности SkQ1 с различными антибиотиками по отношению к Staphylococcus aureus в одинаковых условиях
Бактерия Антибиотик МИК, мкг/мл Источник
Штаммы E. coli
W3110 SkQ1 19 [1]
MG1655 SkQ1 19 Данная работа
JM109 SkQ1 19 «
BL21(DE3) SkQ1 19 «
XL1-Blue SkQ1 19 «
DH5a SkQ1 19 «
MC1061 SkQ1 19 «
GR70N SkQ1 19 «
E. coli MG1655 делеционные штаммы
AcrD, AcrE, AcrF, MacA, MacB, MdtA, MdtB, MdtC, MdtE, MdtF, EmrA, EmrB SkQ1 19 [1]
AcrZ, EmrK, EmrY, EntS SkQ1 19 Данная работа
AcrA, AcrB, TolC SkQ1 0.6-1.2 [1]
R. sphaeroides SkQ1 0.6-1.2 Данная работа
P. phosphoreum SkQ1 0.6-1.2 «
K. pneumoniae SkQ1 >19 «
SkQ1 0.6-1.2 Данная работа, [1]
Канамицин 2.5 Данная работа
« 3.1 [10]
S. aureus Хлорамфеникол 5 Данная работа
« 3.1 [10]
Ампициллин 2.5 Данная работа
« 1.6 [10]
Стрептомицин 6.3 [10]
Полимиксин В 100 [10]
вальном планшете в объеме 200 мкл. Бактериальную суспензию (50 мкл) в среде Мюллера-Хинтона добавляли к каждой лунке для получения 250 мкл суспензии (5 х 105 КОЕ/мл). Полученную суспензию инкубировали при 37°С в течение 20 ч [1].
Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли как самую низкую концентрацию, которая полностью ингибировала рост бактерий. Рост бактерий наблюдали визуально наряду с измерениями °д,20 т.
Для биоинформатического анализа мы использовали поисковый инструмент BLASTp (NCBI, https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov), базу данных STRING v.10.5 (EMBL, http: //string.embl.de/) и базу данных BioCyc из коллекции баз данных Pathway/Genome (PGDBs, https://biocyc.org/) BioCyc.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Мы сравнили устойчивость различных лабораторных штаммов E. coli и выяснили, что все эти штаммы устойчивы к SkQ1 (табл. 1). Это объясняется, по-видимому, идентичностью первичной структуры белков AcrA, AcrB и TolC у всех изученных нами штаммов [6].
Ранее [1] нами было показано, что грамотрица-тельные бактерии P. phosphoreum и R. sphaeroides, в отличие от штаммов E. coli, не обладают устойчивостью к SkQ1. Из данных, приведенных в табл. 2, следует, что аминокислотная последовательность белков этих бактерий, аннотированных как AcrB, довольно сильно отличается от последовательности белка AcrB из E. coli. Уровень их идентичности с белком AcrB E. coli составляет 65 и 33% соответственно, что и определяет, по-видимому, чувствительность этих бактерий к SkQ1. Отметим, что белок AcrD, удаление которого не влияет на чувствительность к SkQ1, на 66% идентичен последовательности белка AcrB, что сравнимо с белками AcrB из P. phosphoreum и R. sphaeroides. Таким образом, для резистентности бактерий к SkQ1 требуется большее сходство аминокислотной последовательности их белка AcrB с последовательностью белка AcrB из E. coli. Чтобы проверить это заключение, мы проанализировали первичную структуру белка AcrB другой грамотрицательной бактерии Klebsiella pneumoniae, которая оказалась на 91.5% идентичной структуре белка AcrB из E. coli. Это дало нам основание предположить наличие резистентности к SkQ1 у K. pneumoniae, что и было подтверждено экспериментально (табл. 1 и 2).
Анализ антибактериальной активности SkQ1 по отношению к делеционным мутантам E. coli по белкам EmrK, EmrY и EntS (рис. 2) показал, что минимальные ингибирующие концентрации SkQ1 были такими же, как определенные нами для штамма дикого типа E. coli (табл. 1).
Чтобы проверить роль белка AcrZ в устойчивости E. coli к SkQ1, мы сравнили устойчивость штаммов дикого типа E. coli MG1655 и штаммов с делеци-ей белков AcrZ и AcrB. Если белок AcrZ участвует в функционировании помпы МЛУ AcrAB-TolC с формированием комплекса AcrABZ-TolC, то для удаления SkQ1 устойчивость делеционного мутанта по белку AcrZ должна быть выше устойчивости му-
Таблица 2. Сравнение последовательностей гена acrB из различных штаммов грамотрицательных бактерий с acrB из штамма E. coli
Бактерия Идентификационный номер Покрытие, % Идентичность, % Устойчивость к SkQ1
E. coli MG1655 NP 414995.1 100 100 ДА
E. coli W3110 BAE76241.1 100 100 ДА
E. coli AcrB* NP 416965.1* 99 66 НЕТ
E. coli BL21(DE3) CAQ30935.1 100 100 ДА
E. coli DH5a KGA88788.1 100 100 ДА
R. sphaeroides ANS33442.1 97 33 НЕТ
P. phosphoreum CEO37741.1 98 65 НЕТ
K. pneumoniae CDO13174.1 99 91.5 ДА
Примечание. В случае делеционного мутанта E. coli MG1655 по белку AcrB, обозначенного звездочкой, сравнение проводили с последовательностью белка AcrD. Идентичность аминокислотной последовательности определяли как процент идентичных аминокислотных остатков в соответствующих положениях в выровненных последовательностях. Покрытие определяли как процент выровненной последовательности белка AcrB. Отсутствие (НЕТ) и наличие (ДА) устойчивости к SkQ1 определяли по отношению к E. coli, где МИК SkQ1, сравнимая с МИК SkQ1 для E. coli, служила критерием устойчивости.
танта с делецией белка AcrB, но ниже, чем у белка дикого типа. Если белок AcrZ не участвует в функционировании помпы AcrAB-TolC, то устойчивость мутанта с делецией белка AcrZ должна быть такой же, как у штамма дикого типа, и выше, чем в случае делеции белка AcrB. В качестве положительного контроля в этих опытах использовали хлорамфени-кол [10], удаление которого из клетки усиливается под действием белка AcrZ [4]. Влияние белка AcrZ на устойчивость к SkQ1 и хлорамфениколу определяли одновременно, чтобы исключить зависимость получаемых результатов от условий эксперимента.
В наших экспериментах делеционный мутант по белку AcrZ обладал такой же устойчивостью к SkQ1, как и штаммы дикого типа E. coli (рис. 3), тогда как три штамма E. coli (WT, AAcrZ и AAcrB) показали разные уровни устойчивости к хлорамфе-николу (рис. 3) как описано ранее [4]. Согласно [4], связывание AcrZ с AcrB может вызывать конформа-ционные изменения в его периплазматическом домене, что влияет на распознавание и захват субстратов с низкой гидрофобностью. Поскольку SkQ1 является высокогидрофобным соединением (logP = 4.11) [11, 12], его распознавание помпой может не регулироваться связыванием AcrZ с AcrB.
Анализ делеционных мутантов показал, что помпа EmrKY-TolC не принимает участие в откачке SkQ1 из бактериальной клетки. Удаление гена entS также не влияло на откачку SkQ1 из бактериальной клетки. Таким образом, подтвердилось наше заключение о том, что AcrAB-TolC является единственной помпой, откачивающей SkQ1.
Q
О
0.6 0.50.40.3 0.20.1 -0.0
I безSkQ1 |2 мкМ SkQ1 15 мкМ SkQ1 110 мкМ SkQ1 Т
WT TolC EmrK EmrY EntS
Рис. 2. Токсичность SkQ1 в отношении E. coli MG1655 и его делеционных мутантов ATolC (положительный контроль), AEmrK, AEmrY и AEntS. SkQ1 (2-10 мкМ) добавляли к бактериальным культурам (1-5 х 105 клеток / мл), помещенным в 96-луночные планшеты. Плотность клеток определяли по поглощению при 620 нм. После этого бактерии растили в течение 20 ч при 37°С и снова измеряли плотность клеток. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение, по меньшей мере, для трех экспериментов
Другим возможным модулятором устойчивости к SkQ1 могла бы быть 6S РНК, регулятор сигма-70-зависимой транскрипции генов [13]. Наши предварительные исследования не выявили различий в устойчивости к SkQ1 между делеционным мутан-
0.6
E. coli WT
0.6
E. coli AAcrZ
контроль 1.5 мкг/мл SkQ1 3 мкг/мл SkQ1 6 мкг/мл SkQ1 12 мкг/мл SkQ1 24 мкг/мл SkQ1
контроль 1.5 мкг/мл SkQ1 3 мкг/мл SkQ1 6 мкг/мл SkQ1 12 мкг/мл SkQ1 24 мкг/мл SkQ1
0.6 0.5 0.4
E. coli AAcrB
0.7 0.6 0.5
10 15 Время, ч
E. coli WT
20
25
10
15
20
25
контроль . 0.5 мкг/мл ХФ - 1 мкг/мл ХФ 2 мкг/мл ХФ 4 мкг/мл ХФ 8 мкг/мл ХФ
^i-i-*"4"11 '
0.8т
Время, ч E. coli AAcrZ
0.8
Время, ч E. coli AAcrB
0.6
контроль 0.5 мкг/мл ХФ
1 мкг/мл ХФ
2 мкг/мл ХФ 4 мкг/мл ХФ
0.6
0.4
0.2
0.4
0.2
контроль 0.5 мкг/мл ХФ
1 мкг/мл ХФ
2 мкг/мл ХФ
10
Время, ч
15
20
10
Время, ч
20
10
Время, ч
15
20
Рис. 3. Влияние SkQ1 (верхняя панель) и хлорамфеникола (ХФ) (нижняя панель) на рост бактерий E. coli (WT, AAcrB и AAcrZ). SkQ (1.5-24 мкг/мл) или хлорамфеникол (0.5-8 мкг/мл) добавляли к бактериальным культурам (5 х 105 клеток/мл), помещенным в 96-луночные планшеты. Рост оценивали по ежечасно измеряемой во время инкубации оптической плотности при 620 нм с помощью планшетного спектрофотометра Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США). Бактериям давали расти в течение 20 ч при 37°С. Точки данных представляют собой средние значения ± стандартное отклонение, по меньшей мере, для трех экспериментов
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
том E. coli по белку SsrS и штаммом E. coli дикого типа. Нельзя исключить, что устойчивость к таким антибиотикам, нацеленным на биоэнергетику, как SkQ1, может быть повышена за счет тривиального увеличения уровня экспрессии. Недавно было показано [13], что экспрессию помп плейо-тропной лекарственной устойчивости у дрожжей Saccharomyces cerevisiae можно индуцировать до-децилтрифенилфосфонием, другим представителем этого класса антибиотиков, т.е. додецилтри-фенилфосфоний может служить как активатором, так и ингибитором лекарственной устойчивости [14, 15]. Однако нет прямой взаимосвязи между временной активацией экспрессии и постоянным увеличением плейотропной устойчивости к подобным веществам.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, полученные результаты показывают, что SkQ1 является эффективным антибиотиком, устойчивость к которому бактерий E. coli обусловлена лишь наличием помпы AcrAB-TolC. Существенный фактор, определяющий устойчивость других грамотрицательных бактерий к SkQ1, - идентичность их белков AcrB и AcrB из E. coli. Белок AcrZ не участвует в формировании устойчивости к SkQ1, иными словами, обычный способ регуляции устойчивости за счет влияния на помпу МЛУ AcrAB-TolC через белок AcrZ не эффективен в случае SkQ1. •
Работа поддержана грантом РНФ № 16-14-10025. Мы благодарны А.С. Корзиной за помощь на протяжении всего проекта.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Nazarov P.A., Osterman I.A., Tokarchuk A.V., Karakozova M.V., Korshunova G.A., Lyamzaev K.G., Skulachev M.V., Kotova E.A., Skulachev V.P., Antonenko Y.N. // Sci. Rep. 2017. V. 7. № 1. Р. 1394.
2. Khailova L.S., Nazarov P.A., Sumbatyan N.V., Korshunova G.A., Rokitskaya T.I., Dedukhova V.I., Antonenko Y.N., Skulachev V.P. // Biochemistry (Mosc.). 2015. V. 80. № 12. Р. 1589-1597.
3. Pos K.M. // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1794. № 5. Р. 782-793.
4. Hobbs E.C., Yin X., Paul B.J., Astarita J.L., Storz G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. № 41. P. 16696-16701.
5. Munita J.M., Arias C.A. // Microbiol. Spectr. 2016. V. 4. № 2. 10.1128/microbiolspec.VMBF-0016-2015.
6. Karakozova M.V., Nazarov P.A. // Bull. RSMU. 2018. V. 2. P. 32-36.
7. Keseler I.M., Mackie A., Peralta-Gil M., Santos-Zavaleta A., Gama-Castro S., Bonavides-Martinez C., Fulcher C., Huerta A.M., Kothari A., Krummenacker M., et al. // Nucl. Acids Res. 2013. V. 41 (Database issue). P. D605-D612.
8. El Meouche I., Dunlop M.J. // Science. 2018. V. 362. № 6415. P. 686-690.
9. Baba T., Ara T., Hasegawa M., Takai Y., Okumura Y., Baba M., Datsenko K.A., Tomita M., Wanner B.L., Mori H. // Mol. Syst. Biol. 2006. V. 2. 2006.0008. doi: 10.1038/msb4100050
10. Sabath L.D., Garner C., Wilcox C., Finland M. //
Antimicrob. Agents Chemother. 1976. V. 9. № 6. P. 962-969.
11. Martyushin A.A., Tsarev D.A., Grigorenko M.A., Fedorov I.I., Ramenskaya G.V., Tashlitsky V.N., Skulachev V.P. // Pharmacia. 2008. V. 5. P. 23-29.
12. Antonenko Y.N., Avetisyan A.V., Bakeeva L.E., Chernyak B.V., Chertkov V.A., Domnina L.V., Ivanova O.Y., Izyumov D.S., Khailova L.S., Klishin S.S., et al. // Biochemistry (Mosc.). 2008. V. 73. № 12. P. 1273-1287.
13. Wassarman K.M. // Microbiol. Spectr. 2018. V. 6. № 3. 10.1128/microbiolspec.RWR-0019-2018.
14. Galkina K.V., Besedina E.G., Zinovkin R.A., Severin F., Knorre D. // Sci. Rep. 2018. V. 8. № 8131. P. 1-11.
15. Knorre D.A., Markova O.V., Smirnova E.A., Karavaeva I.E., Sokolov S.S., Severin F.F. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014. V. 450. № 4. P. 1481-1484.
