CC BY
65
ЛИТЕРАТУРА
REFERENCES
1. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К. Этиология хронических вирусных нейроинфекций. М.: Медицина; 1984.
2. Грибенча С.В., Козлов А.Ю., Костина Л.В., Елаков А.Л., Лосич М.А., Цибезов В.В. и др. Получение моноклональных антител к нуклеопротеину вируса бешенства. Вопросы вирусологии. 2013; 58(5): 38-43.
3. Грибенча С.В., Львов Д.К. Бешенство. В кн.: Львов Д.К., ред. Вирусы и вирусные заболевания человека и животных. М.: Медицина; 2013: 811.
4. Delmas O., Holmes E.C., Talbi C., Larrous F., Dacheux L., Bouchier C., Bourhy H. Genomic diversity and evolution of the lyssaviruses. PLoS One. 2008; 3(4): e2057.
1. Barinskiy I.F., ShubladzeA.K. Etiology ofthe ChronicNeuroinfections [Etiologiya Khronicheskikh Virusnykh Neyroinfektsiy]. Moscow: Meditsina; 1984. (in Russian).
2. Gribencha S.V., Kozlov A.Yu., Kostina L.V., Elakov A.L., Losich M.A., Tsibezov V.V. et al. Obtaining of monoclonal antibodies against the rabies virus nucleoprotein. Voprosy Virusologii. 2013; 58(5): 38-43. (in Russian).
3. Gribencha S.V., L'vov D.K. Rabies. In: L'vov D.K., ed. Viruses and Viral Diseases of Humans and Animals [Virusy i Virusnye Zabolevaniya Cheloveka i Zhivotnykh]. Moscow: Meditsina; 2013: 811. (in Russian).
4. Delmas O., Holmes E.C., Talbi C., Larrous F., Dacheux L., Bouchier C., Bourhy H. Genomic diversity and evolution of the lyssaviruses. PLoS One. 2008; 3(4): e2057.
Поступила 29.05.14
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
УДк 615.371:579.841.93].012.6:578.832.1.083
Садикалиева С. О.1, Султанкулова К. Т.1, Шораева К. А.1, Строчков В. М.1, Червякова О. В.1, Зайцев В. Л.1, Табынов К. К.1, Сандыбаев Н. Т.1, Сансызбай А. Р.1, Егоров А. Ю.2
Генетическая стабильность HA-, na- и NS-генов рекомбинантного векторного вируса Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1), экспрессирующего бруцеллезный ген
'НИИ проблем биологической безопасности, 080409, пос. Гвардейский, Казахстан; 2HSC Development GmbH, Тульн, Австрия
Сконструирован рекомбинантный штамм вируса гриппа Flu-Ns1-124-Omp16 (H5N1), экспрессирующий бруцеллезный ген Omp16, на основе технологии обратной генетики для создания векторной противобруцел-лезной вакцины. Полученный рекомбинантный штамм является генетически стабильным. Стабильность подтверждена сравнительным анализом нуклеотидных последовательностей HA-, NA- и NS-генов рекомбинантного векторного вируса Flu-Ns1-124-Omp16 (H5N1), экспрессирующего ген Omp16 (GenBank: ААА59360.1) Brucella abortus. Cравнительный генетический анализ показал, что нуклеотидная последовательность гена NS 1-го и 5-го пассажных уровней вируса Flu-Ns1-124-Omp16 (H5N1) на 100% еоответствует исходному участку 12ААS2TC_124omp16g, содержащему химерный Ns1-124-Omp16 в составе ДнК-плазмиды pHW2000. в результате сравнительного генетического анализа установлена 100% идентичность нуклеотидных последовательностей НА- и NA-генов 1-го и 5-го пассажных уровней рекомбинантного штамма Flu-ns1-124-Omp16 (H5N1) с генами НА и NA штамма А/АstanaRG/6:2/2009 (hem). Было показано, что рекомбинантный векторный вирус Flu-Ns1-124-Omp16 (H5N1), экспрессирующий бруцеллезный ген Omp16, сохраняет генетическую стабильность на протяжении 5 пассажей на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ).
К л ю ч е в ы е с л о в а: рекомбинантный векторный вирус; бруцеллезный ген; гемагглютинин; нейраминидаза; неструктурный белок; полимеразная цепная реакция; генетический анализ.
Для цитирования: Вопросы вирусологии. 2015; 60(4): 18-23.
Sadikaliyeva S.O., Sultankulova K.T., Shorayeva K.A., Strochkov V.M., Chervyakova O.V., Zaitsev V.L., Tabynov K.K., Sandybayev N.T., SansyzbayA.R., Egorov A.Yu.
genetic stability of the на, па, and Ns genes of the recombinant vector virus Flu-Ns1-124-Omp16 (H5N1) expressing the brucellar gene
'Scientific-Research Institute of Biological Safety Problems, 080409, Gvardeiskiy, Kazakhstan; 2HSC Development
GmbH, Tulln, Austria
The recombinant strain Flu-Ns1-124-Omp16 (H5N1) of the influenza virus expressing the brucellar Omp16 gene was constructed on the basis of the technology of reverse genetics for the purpose of developing vector anti-brucellosis vaccine. The obtained recombinant strain is a genetically stable construction. This stability is confirmed by the comparative analysis of the nucleotide sequences of the НА, NA, and Ns genes of the recombinant vector virus Flu-Ns1-124-Omp16 (H5N1) expressing the Omp16 gene of the Brucella abortus (genBank: AAA59360.1). The comparative analysis showed that the nucleotide sequence of the Ns gene of the first and the fifth passage level of the Flu-Ns1-124-Omp16 (H5N1) virus corresponded for 100% to the initial part of 12ААS2TC_124 Omp16g containing the chimera Ns1-124-Omp16 in the composition of DNA (deoxyribonucleic acid) plasmids pHW2000. Total identity with HA and NA genes of the strain А/AstanaRG/6:2/2009 (H5N1) was shown by the comparative analysis of the nucleotide sequences of HA and NA genes of the first and the fifth passage level of the recombinant strain Flu-Ns1-124-Omp16 (H5N1). The recombinant vector virus Flu-Ns1-124-Omp16 (H5N1) expressing the brucella Omp16 gene maintains the genetic stability during 5 passages in 10-day developing chicken embryos.
Key words: recombinant vector virus; brucellosis gene; hemagglutinin; neuraminidase; non-structural protein; PCR (polymerase chain reaction); genetic analysis.
Gtation: Voprosy virusologii. 2015; 60(4): 18-23. (In Russ.)
For correspondence: Sandugash Sadikalieva, Junior research fellow; e-mail: t.m.tlenchieva@mail.ru
Received 11.03.14
Для корреспонденции: Садикалиева Сандугаш Оразбековна, мл. науч. сотр.; e-mail: t.m.tlenchieva@mail.ru
Введение
Важнейшим и перспективным методом борьбы с бруцеллезной инфекцией является иммунопрофилактика. По данным Объединенного комитета экспертов ФАО, бруцеллез сельскохозяйственных животных распространен практически во всем мире [1, 2].
Противобруцеллезные вакцины имеют существенные недостатки, к которым относятся абортогенность, непродолжительный иммунитет и неэффективная защита против данной инфекции. С целью устранения этих недостатков разрабатываются новые вакцины против бруцеллеза, такие как ДНК-вакцины, векторные вакцины. В связи с этим сотрудниками НИИПББ c помощью методов обратной генетики сконструирован модифицированный по NS-гену рекомбинантный векторный вирус гриппа А Flu-NS1-124-Omp16 антигенного подтипа H5N1, несущий бруцеллезный ген.
Концепция гриппозного вектора основана на получении методом обратной генетики рекомбинантных штаммов вируса гриппа с модифицированным по длине геном NS. Белок NS1 - один из факторов патогенности вируса, ответственный за подавление врожденного иммунитета хозяина и позволяющий вирусу гриппа успешно реплицироваться на фоне подавленной системы интерферона (ИФН). Удаление белка NS1 ведет к абортивной репликации вируса из-за активации широкого круга противовирусных факторов и формирования противовирусного статуса в клетках [3-6].
У рекомбинантного штамма вируса гриппа А Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1), несущего бруцеллезный ген в качестве донора гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA), использован вакцинный штамм A/AstanaRG/6:2/2009 (H5N1), который является реассортантом высокопота-генного вируса гриппа A/chicken/Astana/6/2005 (H5N1) и A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Была внесена мутация в сайт протеолитического расщепления НА штамма A/chicken/ Astana/6/2005 (H5N1) (GenBank: FJ390028.1) путем удаления аминокислотного мотива RRRK [7, 8].
Установлено, что полученный рекомбинантный векторный вирус Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) является эффективным вектором для доставки бруцеллезного гена Omp16 в организм иммунизируемых животных. Рекомбинантный гриппозный вектор Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) рекомендуется использовать в качестве кандидата для создания вакцины, обеспечивающий формирование противобруцеллезного иммунитета [9].
Целью данной работы был анализ генов NA, HA и NS рекомбинантного векторного вируса Flu-NS1-124-Omp16 антигенного подтипа H5N1, несущего бруцеллезный ген Omp16.
Материалы и методы
Конструирование рекомбинантного векторного вируса Flu-NSl-124-Omp16 (H5N1). Синтез генетической конструкции, содержащей генетические сегменты PB2, PB1, PA, NP, M и NS вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1) (ID CY033578.1) и HA, NA вакцинного штамма A/AstanaRG/6:2/2009 (H5N1) вируса гриппа, проведен в двунаправленной экспрессионной плазмиде pHW [10, 11].
Для создания векторной вакцины на основе вируса гриппа, стабильно синтезирующего белок бактерии бруцеллеза, была синтезирована ДНК-плазмида pHW 12AAS2TC_124omp16g, содержащая рекомбинантный вирусный ген белка NS1 с последовательностью Omp16 (GenBank: AAA59360.1). Генетическая конструкция синтезирована в компании «Gene Art Life Technologies», Австрия.
Рекомбинантный векторный вирус Flu-NS1-124 -Omp16 (H5N1), синтезирующий бруцеллезный
ген, был получен методом трансфекции плазмидами сертифицированных клеток Vero при помощи методики Nucleofector™, «Lonza». Дефицитные по ИФН клетки Vero (Европейская коллекция клеточных культур) совместно трансфицированы с 0,5 мкг/мл плазмидами, кодирующими гены PB2, PB1, PA, НА, NP, NA, M и NS. Трансфицированные клетки исследованы до появления цитопатического действия (ЦПД). После проявления ЦПД надосадочную жидкость центрифугировали при 300 g в течение 15 мин.
Культивирование вирусов в куриных эмбрионах. Ку-риные эмбрионы заражали суспензией вируса в аллан-тоисную полость и помещали в термостат для инкубации при 34°С в течение 48 ч. После инкубации куриные эмбрионы помещали в холодильник при -4°С для охлаждения. В качестве объекта исследований в работе использованы 1-й и 5-й пассажные уровни вируса Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ).
Выделение РНК. Вирусную РНК из вируссодержащей суспензии выделяли с использованием набора QIAmp Viral RNA Mini Kit, «Qiagen».
ПЦР-анализ. Для наработки фрагментов кДНК использовали набор Super Script III One-Step RT-PCR with platinum Taq фирмы «Invitrogen». Амплификацию проводили с использованием термоциклера GeneAmp PCR System 9700, «Applied Biosystems». Параметры амплификации: наработка первой цепи кДНК - 450С б0 мин, активация полимеразы при 940С 2 мин, 5 циклов - 940С 30 с, 450С 30 с, б80С 3 мин, 31 цикл - 940С 30 с, 570С 30 с, б80С 3 мин, б80С 7 мин. Олигонуклеотидные прай-меры, используемые для амплификации HA-, NA- и NS-генов рекомбинантного векторного вируса А Flu-NS1-124-Omp^ (H5N1), представлены в таблице.
Секвенирование. Определение первичной нуклеотид-ной последовательности проводили методом дидеокси-секвенирования с использованием набора Big Dye Terminator Cycle Sequincing Kit v 3.1 (ABI) на автоматическом 1б-капиллярном секвенаторе Genetic Analyser 3130 xl, «Applied Biosystems» (США).
Сравнительный компьютерный анализ. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей проведен c использованием компьютерных программ Vector NTI и MEGA 4.
Результаты и обсуждение
Согласно литературным источникам, в профилактике бруцеллеза у животных определенное место принадлежит вакцинации [12]. Рекомбинантные вирусы являются кандидатами для производства современных вакцин [13, 14]. Для создания эффективных вакцин, кроме выбора оптимальных протективных факторов, необходима эффективная система доставки, обеспечивающая презентацию гена. В качестве такой системы используется один из аттенуированных штаммов вируса гриппа А/
Олигонуклеотидные праймеры, используемые для амплификации HA-, NA- и NS- генов рекомбинантного векторного вируса а Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1)
Ген Праймер Последовательность
HA Sc-HA-f TATTCGTCGAGCTCAGCAAAAGCAGGGG
Bh-HA-r ATAGGATCCCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT
NA Xb-NA-f TATTCTAGACAGGGAGCAAAAGCAGGAGT
Hd-NA-r ATAAAGCTTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTT
NS NS-f AGCAAAAGCAGGGTGACAAAG
NS-r CTCTTGCTCCACTTCAAGC
1500 п.о.
NA
М 1 2
NS
М К 1 2
1000 п.о.
1000 п.о.
Рис. 1. Электрофоретический профиль разделения амплифицированных генов НА, NA и химерного гена NS рекомбинантного вируса Flu-NS1-124-Omp16 (H5Nl) 1-го и 5-го пассажных уровней.
HA: М - маркер, «Fermentas»; 1 - НА (1710 п. о.) Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) 1-го пассажного уровня; 2 - НА (1710 п. о.) Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) 5-го пассажного уровня; NA: М - маркер, «Invitrogen»; 1 - NA (1490 п. о.) Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) 1-го пассажного уровня; 2 - NA (1490 п. о.) Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) 5-го пассажного уровня; NS: М - маркер, «Invitrogen»; К - NS A/PR/8/34 (H1N1); 1 - NS (1280 п. о.) Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) 1-го пассажного уровня; 2 - NS (1280 п. о.) Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) 5-го пассажного уровня.
Puerto Rico/8/34 (H1N1). Для получения рекомбинантного штамма вируса гриппа А, экспрессирующего бруцеллезный ген Omp16 (GenBank: AAA59360.1 ), связанный с открытой рамкой считывания гена NS1, в качестве исходного штамма был выбран А/Puerto Rico/8-NS1-124 c модифицированным по длине геном NS, кодирующим 124 аминокислоты N-терминальной области белка.
Рекомбинантный вирус Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) сконструирован путем котрансфекции культуры клеток Vero, затем адаптирован к 10-суточным РКЭ. Для подтверждения генетической стабильности генов NA, HA и NS было проведено 5 дополнительных пассажей ре-комбинантного вируса Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1), экспрессирующего бруцеллезный ген Omp16.
При создании эффективной вакцины против бруцеллеза немаловажную роль играет идентификация иммуно-генных белков. Известно, что при иммунизации мышей белком Omp16 у них наблюдается повышение активно-
сти цитотоксических лимфоцитов CD4(+), CD8(+), а также Т-клеток [15, 16]. Исходя из этого, в данной работе в качестве бруцеллезного агента был выбран белок Omp16, который характеризуется как иммуногенный и защитный антиген. Omp16 является белком наружной мембраны, представляет собой липопротеин и содержится во всех шести видах и известных биоварах бактерии Brucella.
Для проведения генетического анализа были наработаны гены HA, NA и NS 1-го и 5-го пассажных уровней рекомбинантного вируса Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1). Результаты амплификации представлены на рис. 1.
На данном рисунке представлены отдельные полосы HA-, NA- и NS-сегментов рекомбинантного вируса Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) с химерной конструкцией NS1, содержащей вставку нуклеотидной последовательности гена Omp16. Из-за вставки в гене NS1 бруцеллезного агента Omp16 ген NS рекомбинантного вируса отличается от гена NS вируса гриппа А/Puerto Rico/8/34 (H1N1)
1 GTCGACCTCC CAGCTGGAGG GAAGTTGGGG СТТСААСССС GGGAGCAAAA CCCTCGTTTT GCAGGGTGAC CGTCCCACTG AAAGACATAA TTTCTGTATT BjmHI TGGATCCAAA ACCTAGGTTT CACTGTGTCA GTGACACAGT Hindlll AGCTTTCAGG TCGAAAGTCC TAGATTGCTT АТС ТА AC GA A TCTTTGGCAT AGAAACCGTA
101 GTCCGCAAAC CAGGCGTTTG GAGTTGCAGA CTCAACGTCT CCAAGAACTA GGTTCTTGAT GGTGATGCCC CCACTACGGG CATTCCTTGA GTAAGGAACT TCGGCTTCGC AGCCGAAGCG CGAGATCAGA GCTCTAGTCT AATCCCTAAG TTAGGGATTC AGGAAGGGGC TCCTTCCCCG AGCACCCTCG TCGTGGGAGC
GTCTGGACAT CGAGACAGCC СAGACСTGTA GCTCTGTCGG
ACACGTGCTG GAAAGCAGAT AGTGGAGCGG ATTCTGAAAG AAGAATCCGA TGAGGCACTT AAAATGACCA TGGCCTCTGT TGTGCACGAC CTTTCGTCTA TCACCTCGCC TAAGACTTTC TTCTTAGGCT ACTCCGTGAA TTTTACTGGT ACСGGAGACA
ACCTGCGTCG CGTTACCTAA TGGACGCAGC GCAATGGATT
CTGACATGAC TCTTGAGGAA ATGTCAAGGG AGTGGTCCAT GCTCATACCC AAGCAGAAAG TGGCAGGCCC TCTTTGTATC GACTGTACTG AGAACTCCTT TACAGTTCCC TCACCAGGTA CGAGTATGGG TTCGTCTTTC ACCGTCCGGG AGAAACATAG
AGAATGGACC AGGCGATCAT TCTTACCTGG TCCGCTAGTA
ATG AGAAGAATTC AATCAATAGC AAGATCACCA ATAGCAATAG CACTTTTCAT GTCACTTGCA GTGGCAGGAT TAC TCTTCTTAAG TTAGTTATCG TTCTAGTGGT TATCGTTATC GTGAAAAGTA CAGTGAACGT CACCGTCCTA
GCGCATCAAA AAAGAATCTT CCAAACAATG CAGGGGATCT TGGACTTGGA GCAGGGGCAG CAACACCAGG ATCATCACAA GATTTCACAG TGAATGTGGG CGCGTAGTTT TTTCTTAGAA GGTTTGTTAC GTCCCCTAGA ACCTGAACCT CGTCCCCGTC GTTGTGGTCC TAGTAGTGTT CTAAAGTGTC ACTTACACCC
AGATAGAATA TTCTTCGATC TTGATTCATC ACTTATAAGA GCAGATGCAC AACAAACACT TTCAAAACAA GCACAATGGC TTCAAAGATA TCCACAATAT TCTATCTTAT AAGAAGCTAG AACTAAGTAG TGAATATTCT CGTCTACGTG TTGTTTGTGA AAGTTTTGTT CGTGTTACCG AAGTTTCTAT AGGTGTTATA
TCAATTACAA TAGAAGGACA TGCAGATGAG AGAGGAACAA GAGAGTATAA TCTTGCACTT GGACAAAGAA GGGCAGCAGC AACAAGAGAT TTCCTTGCAT AGTTAATGTT ATCTTCCTGT ACGTCTACTC TCTCCTTGTT CTCTCATATT AGAACGTGAA CCTGTTTCTT CCCGTCGTCG TTGTTCTCTA AAGGAACGTA
CAAGAGGGGT GCCAACAAAT AGAATGAGAA CAATATCATA TGGAAACGAA AGACCAGTGG CAGTGTGCGA CGCAGACACA TGCTGGTCAC AGAATAGAAG GTTCTCCCCA CGGTTGTTTA TCTTACTCTT GTTATAGTAT ACCTTTGCTT TCTGGTCACC GTCACACGCT GCGTCTGTGT ACGACCAGTG TCTTATCTTC
GGCAGTGACA GTGCTTAATG GGGCTGGAAG Ц CCGTCACTGT CACGAATTAC CCCGACCTTC
TGATAATAA GCGGCCGC ЦАСТАТТАТТ CGCCGGCG
Рис. 2. Нуклеотидная последовательность NS1 гена рекомбинантного вируса Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1).
л U ►
«■! ж
о О о О
о О о Ü
H H Н
и U и и
о H H H H
о о о о о
о e> о о
CJ cj <J о
H H н H
и и и и
и и и и
CJ и и и
■4 ■4 ■=! ■=!
и и и и
о и о о О
Ot ■4 ■4 ■=!
и и и и
о о о О
о о о О
о о S О
о о о о
■4 <
•=■: ■4
о о о о
о о о о о
со ■=! ■4
-f. О о о о
•4 ■4
■4 ■4
н н н f-
и и и u
о и о и
о и о и
н н н f-
■4
■4
о о о О
•=>: -=:
о и о и
н H H н
•4 •=! •=<
о О О о
■4 •=<
о о О О о
ID и cj и о
-4. и и о о
о о о о
и и и LÏ
н H н H
н H H H
cj CJ и и
о о о о
о о о о
о и cj и и
ю H н (-
»4. ■4 •=< ■=!
о о О о
н H H H
н H H H
и <J> и и
и о и и
н H н
н H н
о •=! •a! ■=!
и и и и
-4. и и и и
и и и и
и и и и
о о о О
н H H Н
■=! ■=■:
О о о О
H H н H
о О о о о
со О о о е>
-1. •=<
н н н н
и и и и
■4 •=<
о о о о
•=!
о о о и и
M и и и и
-4. •=! •=!
о О о О
■4 <
cj и о U
о о о о
н н H ^
н H н н
о о о е>
О ■4 < •=<
3 о О о о
»4. cj и о и
■4
■4 ■=< ■о!
и и D и
о о О О
и и и О
и и о
о н н H H
о о о о о
•ч н f- н f-
■4 ■=! ■=!
и и и и
о о о О
о о о О
H H H H
н H H H
H H H H
и и и и
о H H H H
СП. H H Е— H —
H H H i-
и и и <J>
о о о о
H H H H
H H H f-
о о о о
•=<
о H H H H
со. о о о о
о о о о-
-î -r
00 00 m m 00
ч- ■ч- IV
Q Q v>
£ rH m 3 M
^ ^ с
i4 гЧ
— z H S)
1Л 1Л с
" Z X □
? ■—■ ----- u
• ю ю
1 I-l гН
X а а
5 г г
% о о
(¿i (N (N
S »H гН
1 % H И 7
о <N
О H <N сл
«
<u
5
^
6
о
К
g
« о
S ±
S —
<N
И
Z
I
ja
Рч
о £
и
о -
о
E
ft л X
сп
ъ
Ü ft О
S СМ
«
UÜUÜUÜU
H H
* [_j L) L) D
К H H H H
* < ■я: ■4
"(1 H f" f-
К •=c •=c •=c
к uu:u::u
H < ■i
к < < <
-Ol ПСЮ СЦП о
H
к H H H
* < < < <
* < <
к < < <
H U::CI::U::Ü
•=Î < с <
* i- f-t i-
H t- i-
* о ICC C3 û.
H (- (- f-
К ■=e < <
< «c
К H H H
* H H H H
К 3CQCQ3DQ3DQ]
(Ь сь" e> es
< ■< <
t: H f- H H
*: H H H
(!)
t: < < < <
H H H H H
t= < < <
t: 2 s s
rœi
t: H (- H
H H H H
^ < < < ■4
t: < < <
f- i- H H
* tb tb о
* H H H H
* < < < ■4
H f- H H
К H H (-
* [_) □□□
К H [- H
К < ■4
H < <
юлссогсиосс
* h- H f- H
К * < < ■4
К H lb; Il 'Il ; t^j ]
К
* < < < <4
CJCJ::CJ:LJ
* •ч; < <
* < < < ■4
H H H H
* < ■=c ■3 ■4
■4
t: H H H
t: •a! <t о 4
t: < «t < -4
t: < < ■4
< < < 4
t: CJ CJ CJ CJ
H H 8-t H
H < <
t: < < < 4
•=c < ■4
t: O::<J:[CJ:: и
К uüuüuüu
H H f- H
* «с < < •=c
* < < < 4
* "f- H H H
te <
* < < я; 4
H •< ■4
К < < <t 4
*
* H S-
«с H H H
* < tû •=e < ■4
-OU 02Я ГСЯ COI . > , к , к ,к
< <t < 4
К luanjiDCDLcja тл пил тл тп
< < < 4
* < < 4
t: < < < ■4
•я: «c < 4
О U U и
ü>! tb
ю
о
о
vt см
о
о с
и —.
|Я a a.
CT с •H ю
ÛJ я -H
CO и S
с to LTl -4 -H
а) К г H
to
о с E s
(Е et
m M о
Jl) С) о tD CD
■н eg -H -H
л а Q
с и см я Я
2 о О
< CD 1
N T
CS см CM
-H -H
Q) CTl <3 1 1
ц CM g —i
о s со to
3 о u в a
СГ at n 1
а> со < г 3
со —I -H
< Рм к.
4
О s S a a
I
s
ю
s
s
u ft
Ш £
<N <N
tö 55
<
дикого типа (К), увеличенным размером (1280 пар оснований (п. о.)), что было подтверждено результатами электрофореза в агарозном геле продуктов амплификации кДНК. Размеры полученных сегментов NA (1490 п. о.), HA (1710 п. о.) соответствуют размерам цельных сегментов генома вируса гриппа, описанных в литературе [17].
Известно, что делеция NS1 -гена критична для репродукции вируса, так как приводит к неполноценной репликации в генетически компетентных организмах. Однако вирусы гриппа, утратившие NS1, могут размножаться в ИФН-дефицитных клеточных линиях, подобных клеткам Vere, накапливаясь до титров, сравнимых с титрами вирусов дикого типа. Исследования показали, что в отличие от вирусов с полностью удаленным геном NS полученные штаммы не утрачивают способность к репродукции в ИФН-компетентных клетках, что связано с присутствием N-терминального РНК-связывающего домена в белке NS1 и частичным сохранением функции белка как антагониста системы ИФН I типа [3, 18].
Было проведено секвенирование ну-клеотидной последовательности гена NS1 рекомбинантного вируса Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1). Полученная нуклеотидная последовательность представлена на рис. 2.
Как видно из рис. 2, нуклеотидная пос-ледоватедьность гена NS1 рекомбинантного вируса имеет вставку нуклеотидной последовательности гена бруцеллезного белка Omp16 размером 503 п. о., расположенного между нуклеотидными позициями 429 и 932.
При создании вакцины немаловажную роль играет генетическая стабильность рекомби-нантного вируса. Для этого оценивали стабильность NS-гена 1-го и 5-го пассажных уровней рекомбинантного вируса Flu-NS1-124 -Omp16 (H5N1) с использованием компьютерной программы Vector NTI. Результаты сравнения нуклеотидных последовательностей этих пассажных уровней рекомбинантного вирусного гена NS, содержащего последовательность Omp16 Brucella abortus с исходным участком 12AAS2TC_1240mp16g в ДНК-плазмиде pHW2000, приведены на рис. 3.
Сравнительный генетический анализ показал, что степень сходства химерного гена NS рекомбинантного штамма 1-го и 5-го пассажных уровней вируса Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) на 100% соответствует исходному участку 12AAS2TC_1240mp16g, содержащему рекомбинантный вирусный ген белка NS1 с последовательностью Omp16 в составе ДНК-плазмиды pHW2000. Таким образом, нуклеотидная последовательность NS-гена 5-го пассажного варианта штамма Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) не претерпевает каких-либо изменений по сравнению с исходной конструкцией и 1-м пассажным уровнем.
При создании рекомбинантного штамма Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) в качестве донора НА и NA использован штамм A/AstanaRG/6:2/2009 (H5N1). Данный штамм был получен методом обратной генетики и представляет собой ре-ассортант высокопотагенного штамма вируса гриппа A/chicken/Astana/6/2005 (H5N1) и виру-
са гриппа А/Puerto Rico/8/34. Так как штамм A/chicken/ Astana/6/2005 (H5N1) является высокопатогенным и имеет сайт протеолитического расщепления НА с мотивом повторяющихся аминокислот, была внесена мутация в этот участок путем удаления аминокислотного мотива RRRK [7, 8].
Сегмент НА рекомбинантного вируса имеет последовательность, совпадающую с модифицированным сайтом расщепления сегмента НА вируса гриппа A/AstanaRG/6:2/2009 (H5N1) (рис. 4).
Секвенирование и последующий сравнительный анализ последовательности гена, кодирующего НА вируса гриппа A/chicken/Astana/6/05 (H5N1) (GenBank: FJ390028.1), A/AstanaRG/6:2/2009 (H5N1) и рекомбинантного вируса Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) 1-го и 5-го пассажных уровней, подтвердили наличие модификации в сайте расщепления гена НА, т. е. в нуклеотидной последовательности рекомбинантного вируса Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) участок нуклеотидной последовательности, отвечающий за патогенность, отсутствует. Таким образом, НА вируса гриппа A/AstanaRG/6:2/2005 (H5N1) и рекомбинантного штамма Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) 1-го и 5-го пассажных уровней идентичны на 100%.
На рис. 5 показаны результаты сравнения гена NA ре-комбинантного вируса со штаммомA/chicken/Astana/6/05 (H5N1) (GenBank: FJ390029.1) и A/AstanaRG/6:2/2009 (H5N1).
Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена NA 1-го и 5-го пассажных уровней рекомбинантного вируса Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) с генами NA штаммов A/chicken/Astana/6/05 (H5N1) (GenBank: FJ390029.1) и A/AstanaRG/6:2/2009 (H5N1) показал, что они не имеют никаких замен в нуклеотидных последовательностях, т. е. идентичны.
В последние годы использование обратной генетики, основанной на применении плазмид, содержащих кДНК-копии фрагментов вирусного генома, позволяет конструировать вакцинные штаммы вируса гриппа путем котрансфекции культуры клеток Vero. Метод позволяет исключить риск контаминации вакцинного штамма посторонними инфекционными агентами из неконтролируемых биологических материалов. Указанная технология дает возможность вводить в геном вируса гриппа (посредством сайт-специфического мутагенеза) мутации и делеции, которые придают вирусу полезные свойства высокорепродуктивного и аттенуированного штамма, а также вставки чужеродных нуклеотидных последовательностей, кодирующие протективные белки, что обеспечивает создание векторной вакцины [19-21].
Предназначенные для производства вакцинные штаммы вируса гриппа должны соответствовать по антигенной структуре гемагглютинину и нейраминидазе вирусов, доминирующих в Республике Казахстан.
Заключение
Сравнительный генетический анализ показал, что нуклеотидная последовательность гена NS 1-го и 5-го пассажных уровней вируса Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) на 100% соответствует исходному участку 12AAS2TC_124Omp16g, содержащему химерный вирусный ген белка NS1 с последовательностью Omp16 (GenBank: AAA59360.1) Brucella abortus в составе ДНК-плазмиды pHW2000.
В ходе сравнительного генетического анализа установлена 100% идентичность нуклеотидных последовательностей НА- и NA-генов 1-го и 5-го пассажных уровней рекомбинантного штамма Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1) с генами НА и NA штамма A/AstanaRG/6:2/2009 (H5N1).
Для рекомбинантного вируса Flu-NS1-124-Omp16
(H5N1) была продемонстрирована высокая генетическая стабильность. Секвенирование генов НА, NA и NS этого вируса после 5 пассажей на 10-суточных РКЭ показало отсутствие мутаций в данных генах.
Использование в качестве вакцины рекомбинантного аттенуированного вируса гриппа Flu-NS1-124-Omp16 (H5N1), несущего бруцеллезный ген Omp16, может служить перспективным подходом в решении задач разработки нового поколения противобруцеллезных вакцин.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 1-6, 10-11, 13-21 см. REFERENCES)
7. Строчков В.М., Червякова О.В., Султанкулова К.Т., Мамадалиев С.М., Зайцев В.Л., Шораева К.А. и др. Рекомбинантные штаммы A/AstanaRG/6:2/2009 и A/AstanaRG/5:3/2009 вируса гриппа, полученные методом обратной генетики. В кн.: Материалы международной конференции «Современное состояние генетики в Казахстане». Алматы; 2010; 63-5.
8. Игнатьева А.В., Руднева И.А., Тимофеева Т. А., Шилов А. A., За-бережный А.Д., Алипер Т.И. и др. Высокопродуктивный вирус-реассортант, содержащий гемагглютинин и нейраминидазу пандемического вируса гриппа A/MOSCOW/01/2009(H1N1). Вопросы вирусологии. 2011; 56 (4): 9-14.
9. Гоцкина Т.М., Рыскельдинова Ш.Ж., Асанжанова Н.Н., Кыдырба-ев Ж.К., Кожамкулов Е.М., Инкарбеков Д.И. и др. Возможность использования морских свинок как модельных животных для изучения иммунобиологических свойств рекомбинантных вирусов гриппа А, экспрессирующих бруцеллезные белки L7/L12 и Omp16. В кн.: Материалы международной научной конференции молодых ученых «Инновационное развитие науки в обеспечении биологической безопасности». Гвардейский; 2013; 47-54.
12. Ставицкий С.Б., Носков А.Н., Кравченко Т.Б. Молекулярная вакцина для профилактики бруцеллеза. Патент РФ № 2285538, 2006.
REFERENCES
1. Racloz V., Schelling E., Chitnis N., Roth F., Zinsstag J. Persistence of brucellosis in pastoral systems. Rev. Sci. Tech. 2013; 32 (1): 61-70.
2. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) (2010). Brucella melitensis in Eurasia and the Middle East. Proc. FAO technical meeting in collaboration with WHO and OIE, May 2009, Rome. FAO Animal Production and Health Proceedings No. 10. FAO, Rome. Available at: www.fao.org/docrep/012/i1402e/ i1402e00.pdf ( Accessed on 5 April 2013).
3. Egorov A., Brandt S., Sereinig S., Romanova J., Ferko B., Katinger D. et.al. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. J. Virol. 1998; 72(8): 6437-41.
4. Fernandez-Sesma A. The influenza virus NS1 protein: inhibitor of innate and adaptive immunity. Infect. Disord. Drug Targets. 2007; 7(4): 336-43.
5. Ferko B., Stasakova J., Romanova J., Kittel C., Sereinig S. Katinger H. et al. Immunogenicity and protection efficacy of replication-deficient influenza A viruses with altered NS1 genes. J. Virol. 2004; 78: 13037-45.
6. Garcia-Sastre A., Biron C.A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 2006; 312: 879-82.
7. Strochkov V.M., Chervyakova O.V., Sultankulova K.T., Mama-daliev S.M., Zaytsev V.L., Shoraeva K.A. et al. Recombinant strains A/AstanaRG/6: 2/2009 and A/AstanaRG/5: 3/2009 influenza virus obtained by reverse genetics. In: Proceedings of International Conference "Current Status of Genetics in Kazakhstan."[Materialy me-zhdunarodnoy konferentsii «Sovremennoe sostoyanie genetiki v Ka-zakhstane»]. Almaty; 2010; 63-5. (in Russian)
8. Ignat'eva A.V., Rudneva I.A., Timofeeva T.A., Shilov A. A., Za-berezhnyy A.D., Aliper T.I. et. al. A highly reassortant containing the hemagglutinin and neuraminidase pandemic influenza A/ MOSCOW/01/2009 (H1N1). Voprosy virusologii. 2011; 56 (4): 9-14. (in Russian)
9. Gotskina T.M., Ryskel'dinova Sh.Zh., Asanzhanova N.N., Kydyrbaev Zh.K., Kozhamkulov E.M., Inkarbekov D.I. et al. The possibility of using guinea pigs as an animal model for the study of immunobiologi-cal properties of recombinant influenza A viruses expressing brucellosis proteins L7/L12 and Omp16. In: Proceedings of the International Confernnce of Young Scientists "Innovative Development of Science in Biological Safety. " [Materialy mezhdunarndnoy nauchnoy konferentsii molodykh uchenykh «Innovatsionnoe razvitie nauki v obespechenii bio-logicheskoy bezopasnosti»]. Gvardeyskiy; 2013; 47-54. (in Russian)
10. De Wit E., Spronken M.I., Bestebroer T.M., Rimmelzwaan G.F., Osterhaus A.D., Fouchier R.A. Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34 from eight cDNA fragments. Virus Res. 2004; 103(1-2): 155-61.
11. Hoffmann E., Neumann G., Kawaoka Y., Hobom G., Webster R.G.
A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010; 97(11): 6108-13.
12. Stavitskiy S.B., Noskov A.N., Kravchenko T.B. Molecular Vaccine for Preventive Maintenance Brucellosis. Patent RF № 2285538, 2006. (in Russian).
13. WHO Guidance on development of influenza vaccine reference viruses by reverse genetics. Available at: whqlibdoc.who.int/hq/2005/ WH0_CDS_CSR_GIP_2005.6.pdf.
14. Leclercq S., Harms J.S., Oliveira S.C. Enhanced efficacy of DNA vaccines against an intracellular bacterial pathogen by genetic adjuvants. Curr. Pharm. Biotechnol. 2003; 4: 99-107.
15. Pasquevich K.A., Estein S.M., Garcia Samartino C., Zwerdling A., Coria L.M., Barrionuevo P. et al. Immunization with recombinant Brucella spp. outer membrane proteins Omp16 or Omp19 in adjuvant induces specific CD41 and CD81 T cells as well as systemic and oral protection against Brucella abortus infection. Infect. Immun. 2008; 77(1): 436-45.
16. Luo D., Ni B., Li P., Shi W., Zhang S., Han Y. et al. Protective immunity elicited by a divalentDNAvaccine encoding both the L7/L12 and
Omp16 genes of Brucella abortus in BALB/c mice. Infect. Immun. 2006; 74: 2734-41.
17. Wang X., Li M., Zheng H., Muster T., Palese P., Beg A.A. et al. Influenza A virus protein prevents activation of NFk-B and induction of alpha/bets interferon. J. Virol. 2000; 74(24): 11566-73.
18. Kochs G., Martínez-Sobrido L., Lienenklaus S., Weiss S., García-Sastre A., Staeheli P. Strong interferon-inducing capacity of a highly virulent variant of influenza A virus strain PR8 with deletions in the NS1 gene. J. Gen. Virol. 2009; 90 (12): 2990-4.
19. Liu M. Zhang Y., Liu C.G., Pan W.Q., Liu C.N., Yang T. Generation of High-yield vaccine strain wholly derived from Avian Influenza Viruses by Reverse Genetics. Chin. J. Biotech. 2006; 22: 720-6.
20. Stech J., Garn H., Wegmann M., Wagner R., Klenk H.D. A new approach to an influenza live vaccine: modification of the cleavage site of hemagglutinin. Nat. Med 2005; 11(6): 683-9.
21. Hoffmann E., Webster R. G. Unidirectional RNA polymerase I-poly-merase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids. J. Gen. Virol. 2000; 81(12): 2843-7.
Поступила 11.03.14
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 616.921.5-036.1-074
Осидак Л. В., Гончар В. В., Волощук Л. В., Головачева Е. Г., Куликова Н. А., Дондурей Е. А., Афанасьева О. И., Суховецкая В. Ф., Милькинт К. К., Образцова Е. В., Мушкатина А. Л., Коновалова Н. И., Писарева М. М., Гончарова Е. С., Галкина С. Н.,\Дриневский В. П., Го А
Клинико-лабораторная характеристика гриппа A(Н1N1pdm2009) у детей и взрослых в период 2009 - 2013 гг. в Санкт-Петербурге
ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, 196237, г. Санкт-Петербург
Сравнительный анализ клинико-лабораторных показателей у 419 детей и 468 взрослых, госпитализированных по поводу гриппа A(H1N1) до и в течение пандемического цикла 2009 - 2013 гг., показал, что клиническая картина пандемического гриппа у пациентов любого возраста, в том числе в постпандемический период, в целом типична для гриппа, а ее характер определяется вовлечением (или отсутствием такового) в процесс легких, причем частота развития пневмоний во все сравниваемые периоды статистически значимо более высокая среди взрослых, чем среди детей. При пандемическом гриппе статистически значимо чаще, чем при сезонном, регистрировали гипертермию (> 39°С), геморрагический и диспептический синдромы. Выявлен ряд различий основных характеристик клинической симптоматики пневмоний между выжившими и умершими пациентами с тяжелой формой пандемического гриппа. Установлены закономерности цитокиновых реакций у пациентов любого возраста в зависимости от выраженности интоксикации и наличия осложнений. Доказана лечебная эффективность включения противовирусных химиопре-паратов в комплексную терапию гриппа.
К л ю ч е в ы е с л о в а: грипп A(H1N1pdm2009); дети; пандемия; пневмония; особенность клинической картины.
Для цитирования: Вопросы вирусологии. 2015; 60(4): 23-28.
Osidak L.V., Gonchar V.V., Voloshuk L.V., Golovacheva E.G., Culikova N.A., Dondurey E. A., Afanasjeva
O.I., Suhovezkaia V.F., | Milkint K.K., Obraztsova E.V., Mushkatina A.L., Konovalova N.I., Pisareva М.М., Goncharova E.S., Galkina S.N., | Drinevsky V.P., Go A.
Clinical and laboratory presentation of the influenza А (H1N1pdm 2009) in children and adults during the period of 2009-2013 in St. Petersburg
Research Institute of Influenza, 196237, St. Petersburg, Russia
Comparative analysis of the clinical laboratory data from 419 children and 468 adults hospitalized during the pandemic of A (H1N1pdm 2009) and pre- and post-pandemic periods (2010-2013) showed that the clinical presentation of the pandemic influenza in patients of all ages is generally typical for influenza, and its character is determined by the degree of involvement of lungs in the process. Besides, the incidence of pneumonia in adults is statistically significantly higher than in children. During all compared periods hyperthermia (>39°С), hemorrhagic and dyspeptic syndrome were observed. Some differences in the main clinical manifestations of pneumonia in recovered patients and patients who died of the severe pandemic influenza were observed. The regularities of the cytokine reactions depending on the intensity of intoxication and occurrence of complications were determined in patients of all ages. Medical efficacy of inclusion of antiviral chemotherapeutic agents into complex influenza treatment was proved.
Key words: influenza (AH1N1pdm 2009); children; pandemic; pneumonia; peculiarity of clinical presentation.
Citation: Voprosy virusologii. 2015; 60(4): 23-28. (In Russ.)
For correspondence: Lyudmila Osidak, MD, PhD, DSc, prof.; e-mail: Lvosidak@mail.ru
Received 17.03.14
Для корреспонденции: Осидак Людмила Викторовна, д-р мед. наук, проф.; e-mail: Lvosidak@mail.ru
