CC BY
91
Сергей Дромашко Оксана Конева
заведующий лабораторией моделирования генетических процессов Института генетики и цитологии НАН Беларуси, доктор биологических наук
младший научный сотрудник Института генетики и цитологии НАН Беларуси
Генетическая паспортизация пород белорусского карпа
УДК 577.21:597.551.2
Геномная регистрация живых организмов приобретает все большую актуальность. Активно идет разработка методов генотипирования растений и животных, ценных как с экологической, так и с сельскохозяйственной точки зрения. Осуществляются попытки создания генетических паспортов для различных биологических объектов. Масштабность и важность данной тенденции иллюстрируется также тем, что во многих странах уже введены законы, протоколирующие и регулирующие этот процесс (например, Закон «О государственной геномной регистрации в РФ» от 03.12.2008 г.) [1].
Ценность генетического типирования состоит в том, что оно позволяет достоверно определить таксономическую принадлежность организмов вплоть до уровня популяции, штамма; оценить уровень полиморфизма, его изменение, что важно для разработки мероприятий по сохранению биоразнообразия в дикой природе [2, 3]. В случае паспортизации сельскохозяйственных видов животных оно также дает возможность точно идентифицировать породу, что имеет огромное экономическое значение. Яркий пример эффективного использования такой паспортизации — работа российских генетиков, позволившая выявить подлог
с ропшинским карпом. Среди рыбоводов эта порода завоевала популярность своей зимостойкостью, неприхотливостью и плодовитостью, хорошими вкусовыми качествами. Для выращивания рыб, как правило, вначале покупается сертифицированный материал — икра или мелкие мальки. На этом этапе некоторые нечестные продавцы пытаются обмануть покупателей, выдавая неизвестных мальков за ропшинского карпа и стараясь вместо одной породы продать другую, в частности менее зимостойкую. выявить подлог в таком случае позволяет только генотипирование и последующее сравнение полученных данных с генетическим паспортом заявленной породы [4].
В области рыбоводства до сих пор в целях паспортизации породы в основном использовались биохимические маркеры (например, у карпа — определение полиморфизма генов по локусу трасфер-ринов). В то же время с помощью методов ДНК-типирования (RAPD-маркеры и микросателиты [5—8]) зарубежными исследователями в последние годы выявлена высокая геномная вариабельность некоторых европейских (Венгрия) и азиатских (Китай) пород карпа. В странах СНГ лишь в россии проводились единичные исследования местных и европейских
пород этой рыбы методом мультилокус-ного геномного типирования [9].
Генетическое тестирование имеет пожизненную информационную ценность. Его необходимо осуществлять один раз. результаты стабильны и не зависят от эпигенетических факторов.
Единого протокола для составления генетического паспорта индивидуума или породы не существует. Возможно, это связано с тем, что работы по данному вопросу начали проводить не так давно и объем сведений о геномах различных организмов находится на разном уровне. Для некоторых уже известна полная последовательность генома, для других собраны лишь частичные данные или их вообще нет.
Процесс определения генотипа индивидуума осуществляется с помощью биологических методов. К данным методам относятся ПЦР, ДНК-секвенирование, гибридизация, ДНК-микрочипы и др. [10].
На сегодняшний день генетическая паспортизация, как основа геномной регистрации ресурсных видов растений и животных, нуждается в более рациональных подходах, базирующихся на молекулярном маркировании геномов.
Для генетического типирования используются различные варианты молекулярных маркеров — RFLP (англ. Restriction Fragment Length Polymorphism — полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), RAPD (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA — случайная амплификация полиморфной ДНК), AFLP (англ. Amplified Fragment Length Polymorphism — полиморфизм длин ампли-фицируемых фрагментов), ISSR (англ. Inter-Simple Sequence Repeat — участки генома между микросателлитными локу-сами), SSR или микросателлиты (англ. Simple Sequence Repeats — тандемные повторы) и др., каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки [11].
Целью наших исследований была разработка технологии генетического паспорта белорусского карпа по результатам молекулярного маркирования как научно-методической основы геномной регистрации исследуемых пород для их идентификации, использования потенциала и оптимизации сохранения генофондов. Исследования проведены в рамках задания 4.4.7 «Оценить генетическое разнообразие и создать эколого-гене-тические и молекулярно-биологические паспорта карпа белорусской селекции» ГП «Биотехнология».
Объектом исследования являлись 2—3-годовалые особи лахвинской и тремлян-ской породных групп карпа (зеркальная и чешуйчатая отводки), выловленные в феврале — октябре 2009 г. в прудах рыбхозов «Лахва» и «Тремля» соответственно. Выборка осуществлялась из товарной рыбы.
Для разработки генетического паспорта белорусского карпа в качестве молекулярных маркеров, позволяющих выявить высокий уровень полиморфизма Днк и проанализировать большую часть генома карпа, были выбраны RAPD-маркеры. Данная технология недорогая и доступная для массового анализа. Метод не требует предварительного клонирования и секвенирования фрагментов для под-
бора праймеров. Это тем более важно, что данных по последовательности генома карпа у нас не имеется. Пока установлена только полная первичная последовательность митохондриального генома карпа и исследован полиморфизм его отдельных участков в азиатских и европейских популяциях [7—8, 12—13].
Для предварительного анализа были избраны 7 праймеров с целью выявить среди них эффективные, пригодные для идентификации изучаемых нами пород (табл. 1).
Выделение ДНК осуществлялось из законсервированных в 96%-ном этаноле плавников карпа (10—13 особей каждой отводки) методом фенол-хлороформной экстракции. Концентрацию и чистоту ДНК определяли спектрофотометрически на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro UV/Visible (Biochrom Ltd.), качество проверяли электрофоретически в 2%-ном агарозном геле (SeaKem® LE Agarose, LONZA).
Амплификацию проводили на амплифи-каторе MyCycler™ (BioRad). Ее продукты подвергали электрофоретическому разделению в 2%-ном агарозном геле в устройстве для горизонтального электрофореза Vagophor 11 (Эстония). Гель окрашивали в водном растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в течение 20 мин. Визуализацию геля осуществляли с помощью системы документирования гелей GelDoc XR (Bio-Rad, США). Полученные изображения обрабатывали с использованием программы Quantity One 4.4.
Статистическая обработка экспериментальных данных по генотипированию осуществлялась с применением программы Statistica 6.0.
В данной статье мы приводим только результаты, полученные по праймеру 21 (5'-GGATCCGAGGGTGGCGGTTCT-3')— одному из наиболее эффективных, показавшему свою пригодность для идентификации исследуемых нами пород.
При проведении RAPD-анализа чешуйчатой и зеркальной отводок лахвинской породы карпа по праймеру №21 были получены 36 типов ампликонов, большинство из которых присутствовало у обеих отводок лахвинского карпа. внимания заслуживает фрагмент в 525 п.о. (пар оснований) (присутствовал только у зеркальной отводки лахвинского карпа, у 2 образцов из 10) и фрагмент в 1821 п.о. (присутствовал только у чешуйчатой отводки лахвинского карпа, у 4 образцов из 10) (рис. 1), лишь эти ампликоны встречались в одной из отводок в количестве больше 1 на всю выборку.
Данные ампликоны при более детальных исследованиях могут претендовать на роль молекулярно-генетических маркеров для идентификации зеркальной и чешуйчатой отводок лахвинского карпа. Также следует отметить значительные частотные отличия между двумя вышеупомянутыми отводками лахвинского карпа по ампликонам в 2066 и 895 п.о.: у чешуйчатой отводки ампликон в 2066 п.о. присутствовал у 40% исследуемых особей, в то время как у зеркальной от-
Таблица 1. Характеристика RAPD-праймеров, выбранных для анализа
Название праймера Последовательность Концентрация, мкМ
ОрВ-01 5'-GTTTCGCTCC-3' 13,7
OpE-06 5'-AAGACCCCTC-3' 14,5
OpF-05 5'-CCGAATTCCC-3' 18,6
OpE-16 5'-GGTGACTGTG-3' 14,1
21 5'-GGATCCGAGGGTGGCGGTTCT-3|| 10
45 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' 10
15/19 5'-GAGGGTGGCGGCTAG-3' 10
Рис. 1. Изображение геля с продуктами амплификации по праймеру №21 чешуйчатой и зеркальной отводок лахвинского карпа: а — полное изображение геля; б, в — увеличенные фрагменты выделенных на основном изображении геля участков, стрелки указываеют на спецефические для отводки ампликоны; М - маркер молекулярного веса GeneRuller™ 100bp Plus DNA Ladder (Fermentas)
Tf!wnKUIX|IUUII> м Гр»М/1»НС«М» Ч|4иуйЧЛ11ЛМЯ
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации, полученных с помощью праймера №21 для: а — зеркальной отводки тремлянского карпа, б — чешуйчатой отводки тремлянского карпа; М — маркер молекулярного веса GeneRuller™ 100bp Plus DNA Ladder
водки только у 10%. Ампликон 895 у чешуйчатой отводки встречался с частотой 40%, у зеркальной отводки — с частотой 70%. Возможно, данные различия также могут быть использованы в качестве дополнительных критериев идентификации отводок.
При сравнении спектра ампликонов по праймеру №21 лахвинской зеркальной и тремлянской зеркальной пород карпа получены следующие результаты: обнаружены различия по 15 типам ампликонов между этими двумя породами, однако внимания заслуживают только несколько из них. У особей лахвинской зеркальной породы присутствует ПЦР-
фрагмент в 922 п.о. (с частотой 40%), в то время как у тремлянской зеркальной (рис. 2) данный фрагмент отсутствует полностью. У нее обнаружены амплико-ны в 1873 (с частотой 40%), 681 (с частотой 50%) и 615 п.о. (с частотой 70%). Данные ампликоны полностью отсутствуют у особей лахвинской зеркальной породы карпа.
Особое внимание следует уделить ам-пликону в 362 п.о., который на 100% присутствует в лахвинской зеркальной пароде и на 100% отсутствует в трем-лянской зеркальной породе карпа.
Сводный набор спектров и частот амп-ликонов по праймеру №21 лахвинской
зеркальной, лахвинской чешуйчатой, тремлянской зеркальной и тремлянской чешуйчатой пород карпа приводится в табл. 2. Из нее видно, что RAPD-анализ всех четырех пород карпа по праймеру №21 в сумме дал 50 типов ампликонов.
Среди полученных ампликонов для лахвинской зеркальной породы карпа оказался характерным (то есть не встречался ни у одного образца из выборок других пород) только один ампликон в 1703 п.о., который у анализируемой выборки из породы присутствовал с частотой 10%. Однако частота встречаемости низкая, так что этот ампликон не стоит рассматривать как возможный вариант молекулярного маркера для идентификации или паспортизации породы.
Для лахвинского чешуйчатого карпа характерными оказались три ампликона: 2190 (10%), 1923 (10%) и 1821 п.о. (40%). Среди них заслуживает внимания для дальнейшего рассмотрения в качестве возможного вспомогательного маркера характеристики породы ампликон в 1821 п.о., так как он присутствует в выборке с приемлемой частотой.
Для тремлянской зеркальной породы карпа являются характерными 5 амп-ликонов: 2226 (10)%, 1679 (10%), 1538 (60%), 1364 (10%) и 681 п.о. (50%). Для характеристики породы пригодны только ампликоны 1538 и 681 п.о.
Для тремлянского чешуйчатого карпа специфическими оказались 6 амплико-нов: 1571 (84,62%), 1098 (15,38%), 1040 (30,77%), 1002 (15,38%), 967 (53,85%) и 931 п.о. (53,85%). Для характеристики породы пригодны только ампликоны 931, 968 и 1040 п.о. Особое внимание следует уделить ампликону 1571, который позволяет идентифицировать породу практически на уровне единичной особи.
Специфическими для тремлянской породы карпа (то есть присутствуют у особей данной породы обеих отводок, и полностью отсутствуют у особей лахвинской породы обеих отводок) являются три ам-
Таблица 2. Сравнение спектров и частот ампликонов по праймеру №21 лахвинской зеркальной, лахвинской чешуйчатой, тремлянской зеркальной и тремлянской
чешуйчатой пород карпа
Ампликоны, пар оснований Процент ампликонов в выборке по локусу
лахвинский лахвинский тремлянский тремлянский лахвинский лахвинский тремлянский тремлянский
зеркальный карп чешуйчатый карп зеркальный карп чешуйчатый карп зеркальный карп чешуйчатый карп зеркальный карп чешуйчатый карп
2446±4,22 2446±4,22 2462±23,00 10,00% 30,00% 20%
2226 10%
2190 10,00%
2066±6,39 2066±6,39 2105±25,16 1946 10,00% 40,00% 20% 7,69%
1923 10,00%
1873±12,23 1882 40% 7,69%
1821±8,55 40,00%
1736±13,83 1736±13,83 1737 1795 20,00% 20,00% 10% 7,69%
1703 10,00%
1679 10%
1571±3,45 84,62%
1538±3,84 60%
1517±3,04 1517±3,04 90,00% 100,00%
1495±0,98 1508±3,93 20% 76,92%
1443 1430 10,00% 10%
1364 10%
1330±4,78 1330±4,78 20,00% 30,00%
1299±5,05 1299±5,05 1302±3,52 20,00% 30,00% 23,08%
1229 1243 10,00% 10%
1188±1,58 1188±1,58 1176±18,61 10,00% 20,00% 23,08%
1144±2,91 1144±2,91 1144 30,00% 40,00% 10%
1098±10,36 15,38%
1071±1,57 1071±1,57 1061±3,68 1062±1,60 80,00% 100,00% 1061±3,68 100,00%
1040±3,70 30,77%
1002±1,13 15,38%
979±1,33 979±1,33 974±4,43 987±1,66 90,00% 90,00% 80% 30,77%
967±2,11 53,85%
931±2,35 53,85%
922±2,85 922±2,85 910±1,34 40,00% 40,00% 92,31%
895±1,98 895±1,98 896±3,53 890±1,64 70,00% 40,00% 30% 61,54%
866±2,81 866±2,81 874±1,44 870±3,50 50,00% 70,00% 70% 46,15%
844±2,17 844±2,17 840±4,18 850±3,31 60,00% 40,00% 30% 30,77%
814±3,55 814±3,55 797±3,78 10,00% 20,00% 61,54%
770±1,99 770±1,99 770±6,87 90,00% 90,00% 20%
748 754±2,30 756±3,07 10,00% 50% 23,08%
739±1,53 739±1,53 728±5,11 30,00% 10,00% 20%
719±5,07 719±5,07 721 10,00% 10,00% 7,69%
695±1,25 695±1,25 698±3,05 80,00% 70,00% 20%
681±2,11 50%
651±1,58 651±1,58 650±5,81 70,00% 60,00% 20%
622±0,87 622±0,87 623±1,62 630±2,92 100,00% 100,00% 40% 15,38%
615±1,06 615±1,89 70% 30,77%
547±1,07 547±1,07 552±2,08 542±1,52 100,00% 100,00% 20% 53,85%
525±2,44 529±0,62 20,00% 15,38%
496±0,93 496±0,93 495±1,54 482±0,75 100,00% 100,00% 100% 100,00%
442±2,92 442±2,92 433±1,18 50,00% 30,00% 50%
422±1,07 422±1,07 422±3,55 80,00% 100,00% 20%
390±3,46 390±3,46 10,00% 10,00%
362±0,62 362±0,62 100,00% 90,00%
324±0,75 324±0,75 327±1,51 100,00% 100,00% 20%
■ — ПЦР-фрагмент присутствует у одной из пород с частотой выше 50%;
■ — ПЦР-фрагмент присутствует у одной из пород с частотой до 50% включительно;
■ — ПЦР-фрагмент присутствует у всех исследованных особей обеих пород без исключения;
■ — ПЦР-фрагмент присутсвует либо у большинства исследованных особей обеих пород с их отводками, либо у одной из пород, но с низкой частотой.
пликона: 1873 п.о. (встречался у 40% анализируемых особей зеркальной отводки и у 7,69% особей чешуйчатой отводки), 1495 п.о. (у 20% анализируемых особей зеркальной и у 76,92% особей чешуйчатой отводки), 615 п.о. (у 70% анализируемых особей зеркальной и у 30,77% особей чешуйчатой отводки). Все данные ампликоны могут использоваться для характеристики породы.
Специфическими для лахвинской породы карпа оказались 4 ампликона: 1517 п.о. (встречался у 90% анализируемых особей зеркальной и у 100% особей чешуйчатой отводки), 1330 п.о. (у 20% анализируемых особей зеркальной и у 30% особей чешуйчатой отводки), 390 п.о. (у 10% анализируемых особей зеркальной и у 10% особей чешуйчатой отводки), 362 п.о. (у 100% особей зеркальной и у 90% особей чешуйчатой отводки). Пригодными для характеристики породы являются только ампликоны 1517, 1330 и 362. Следует обратить особое внимание на маркеры 1517 и 362, которые в 100% присутствовали у особей данной породы обеих отводок, так как они могут оказаться молекулярными маркерами, позволяющими идентифицировать породу на уровне единичной особи.
Также был выявлен ампликон, характерный только для зеркальной отводки обеих пород: 1229 п.о. (у исследуемых особей лахвинской породы он встречался с частотой 10%, у особей тремлянской породы — с частотой 10%). Однако для характеристики зеркальной отводки карпа он не пригоден, так как частота встречаемости низкая или требуется проведение дополнительных исследований на более обширном материале.
Таким образом, в результате данных исследований впервые для карпа белорусской селекции выявлены ампликоны, которые могут быть использованы для характеристики породы. В генетический паспорт породы мы предлагаем включать следующую информацию: метод генетического типирования; праймер (название,
последовательность), дающий эффективные ампликоны для идентификации породы; молекулярный вес ПЦР-фраг-мента, являющегося генетическим маркером породы (в парах оснований); изображение геля продуктов амплификации по данному праймеру с обозначением участков, содержащих молекулярые маркеры породы (для упрощения сравнения результатов при тестировании других особей).
Если всю вышеупомянутую информацию представить в виде математической формулы, получим следующее выражение:
RAPD - 1517М21 или RAPD - №211517,
где RAPD — метод, с помощью которого в данном случае производилось геноти-пирование (это могут быть также SSR, AFLP и т.д.); №21 — сокращенное название праймера (или локуса), который использовался в генотипировании и оказался эффективным для идентификации породы, отводки и т.д.; 1517 — молекулярный вес (в парах оснований) ПЦР-фрагмента (ампликона), оказавшегося генетическим маркером породы.
Также в генетический паспорт можно добавить информацию о частотных различиях по некоторым другим ампликонам у заявленной породы.
Литература
1. Федеральный закон Российской Федерации от 03.12.2008 г. №242-ФЗ «О государственной геномной регистрации в Российской Федерации» // Собрание законодательства российской Федерации от 08.12.2008 г. №49. С. 5740.
2. Слуквин A.M., Конева О.Ю., Лесюк М.И. Генетическая идентификация стерляди (Acipenser ruthenus L.), выращенной в ОАО «Рыбхоз «Полесье» Пинского района Брестской области, по микросателлитным маркерам // молекулярная и прикладная генетика. 2009. Т. 9. С. 146-152.
3. Тимошкина Н.Н. Внутривидовой генетический полиморфизм русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii) / Н.Н. Тимошкина и др. // Генетика. 2009. Т. 45. №9. С. 1250-1259.
4. Российские генетики раскрывают подлог с карпом // Электронное издание «Наука и технологии России STRF.ru». 8 сентября 2009. — [http://strf.ru/science. aspx?CatalogId=393&d_no=23514] - 25.02.2010.
5. Bartfai R. Genetic analysis of two carp broodstocks by RAPD and microsatellite markers. / R. Bartfai, S. Egedi, G. Hua Yue et al. // Aquaculture. — 2003. Vol. 219. P. 157—167.
6. Barman H. Genetic variation between four species of Indian major carps as revealed by random amplified polymorphic DNA assay. / H. Barman et al. // Aquaculture. 2003. Vol. 217. P. 115—123.
7. Zhou J. Genetic variation analysis within and among six varieties of common carp (Cyprinus carpio L.) in China using microsatellite markers. / J. Zhou, Q. Wu, Z. Wang, Y. Ye // Rus. J. Genetics. 2004. Vol. 40, №10. P. 1144—1148.
8. Kohlmann K. Genetic variability and structure of common carp (Cyprinus carpio L.) populations throu-
ghout the distribution range inferred from allozyme, microsatellite and mitohondrial DNA markers / K. Kohlmann et al. // Aquat. Living Resour. 2003. Vol. 16. P. 421-431.
9. Луданный Р.И. Генетическое разнообразие и дифференциация отечественных пород карпа (Cyprinus carpio L.), выявляемая с помощью RAPD-маркеров. / Р.И. Луданный и др. // Генетика. 2006. Т. 42, №8. С. 1121-1129.
10. [http://en.wikipedia.org/wiki/Genotyping] - 25.02.2010.
11. Бронникова С.В. Молекулярное маркирование и генетическая паспортизация ресурсных и редких видов растений с целью оптимизации сохранения их генофондов / Аграрный вестник Урала. №2 (56), 2009. С. 57-59.
12. Chang Y. The complete nucleotide sequence and gene organization of carp (Cyprinus carpio L.) mitochondrial genome. / Y. Chang, F. Huang, T. Lo // J. Mol. Evol. 1994. Vol. 38. P. 138-155.
13. Gross R. PCR-RFLP analysis of the mitohondrial ND-3/4 and ND-5/6 gene polymorphisms in the European and East Asian subspecies of common carp (Cyprinus carpio L.). / R. Gross et al. // Aquaculture. 2002. Vol. 204. P. 507-516.
Summary
The article deals with results of typing for carp (Cyprinus carpio L) breeding. The study is fulfilled for the first time in the country. Amplicons which can be used for characteristics of «lakhvinsky» and «tremlyansky» races are revealed.
