CC BY
93
округа (г. Сургут). Микроэлементы в медицине. 2005; 6 (1): 2-8.
9. Корчина Т.Я., Кушникова Г.И. Эколого-медицинские последствия загрязнения нефтепродуктами геологической среды. Гигиена и санитария. 2008; 4: 24-6.
10. Корчина Т.Я., Корчин В.И., Кушникова Г.И., Янин В.Л. Характеристика природных вод на территории Ханты-Мансийского автономного округа. Экология человека. 2010; 8: 9-12.
11. Корчина Т.Я., Корчин В.И. Сравнительная характеристика интоксикации свинцом и кадмием населения Ханты-Мансийского автономного округа. Гигиена и санитария. 2011; 3: 8-10.
References
1. Gorbachev A.L., Lugovaya E.A., Skal'nyy A.V. Bioelement status of indigenous inhabitants of the northern regions of Russia. Mikroelementy v meditsine. 2012; 13(3): 1-6. (in Russian)
2. Revich B.A. Biomonitoring of toxic substances in the human body. Gigiena i sanitariya. 2004; 6: 26-30. (in Russian)
3. Vil'ms E.A., Turchaninov D.V. Mineral disorders in population of Omsk region: epidemiology and prophylactic. Omskiy nauchnyy vestnik. 2010; 1(94): 21-5. (in Russian)
4. Khasnulin V.I., Khasnulin P.V. Modern concepts of the mechanisms forming northern stress in humans in high latitudes. Ekologiya cheloveka. 2012; 1: 3-11. (in Russian)
Генетические исследования
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 614.7:579.842.14:579.253.4].083.1
Ахальцева Л.В., Журков В.С., Сычева Л.П., Кривцова Е.К.
5. Gogadze N.V., Turchaninov D.V. Hygienic assessment of the nutritional status and health of the population losses of the Khanty-Mansi Autonomous District - Ugra from nutrition-related diseases. Sanitarnyy vrach. 2014; 11: 42-6. (in Russian)
6. Skal'nyy A.V., Rudakov I.A. Bioelements in Medicine [ Bioelementy v meditsine]. Moscow: Mir; 2004. (in Russian)
7. Frolova O.O. Clinical experience correction element status. In: Materials II International Scientific and Practical Conference "Bioelements." [Materialy II mezhdunarodnoy nauchnopraktiches-koy konferentsii «Bioelementy»]. Orenburg; 2006; 95-8. (in Russian)
8. Golubkina N.A., Korchina T.Ya., Merkulova N.N., Pestin S.A., Taslitskiy S.S. Selenium status of the Khanty-Mansi Autonomous District (Surgut). Mikroelementy v meditsine. 2005; 6 (1): 2-8. (in Russian)
9. Korchina T.Ya., Kushnikova G.I. Ecological and medical consequences of oil pollution of the geological environment. Gigiena i sanitariya. 2008; 4: 24-6. (in Russian)
10. Korchina T.Ya., Korchin V.I., Kushnikova G.I., Yanin V.L. Description of natural waters on territory of Khanty-Mansi Autonomous District. Ekologiya cheloveka. 2010; 8: 9-12. (in Russian)
11. Korchina T.Ya., Korchin V.I. Comparative characteristics of lead and cadmium intoxication in the Khanty-Mansi Autonomous District. Gigiena i sanitariya. 2011; 3: 8-10. (in Russian)
Поступила 13.06.15
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КОНТРОЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ШТАММОВ SALMONELLA TYPHIMURIUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ТЕСТЕ SALMONELLA/МИКРОСОМЫ (тест Эймса)
ФГБУ «НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Минздрава РФ, 119992, Москва
Проанализированы данные контролей с растворителями (диметилсульфоксид и дистиллированная вода) экспериментов, проведенных в лаборатории генетического мониторинга в 2004-2014 гг. на штаммах Salmonella typhimurium TA 100, TA 98 и ТА 97 в вариантах без и в присутствии системы метаболической активации. Для всех штаммов не выявлено влияния растворителя и системы метаболической активации на среднее число колоний ревертантов в контроле. Обобщенные параметры (исторический контроль) среднего числа колоний ревертантов на чашку: ТА 100 - число экспериментов 317, среднее 118; 95% интервалы 71-165; ТА 98 - число экспериментов 389, среднее 22; 95% интервалы 9-36; ТА 97 - число экспериментов 217, среднее 142; 95% интервалы 94-191.
Ключевые слова: тест Эймса; S. typhimurium TA 100; S. typhimurium TA 98; S. typhimurium TA 97; исторический отрицательный контроль.
Для цитирования: Гигиена и санитария. 2015; 94(7): 103-105.
Akhaltseva L.V., Zhurkov V.S., Sychova L.P., Krivtsova E.K. GENETIC EVALUATION OF CONTROL VARIANTS OF STRAINS SALMONELLA TYPHIMURIUM, USED IN THE TEST SALMONELLA / MICROSOME (Ames test)
A.N. Sysin Research Institute for Human Ecology and Environmental Health, Moscow, Russian Federation, 119992
There were analyzed data of controls with solvents (DMSO and distilled water) of experiments performed in the laboratory of genetic monitoring in 2004-2014 on Salmonella typhimurium TA 100, TA 98 and TA 97 strains in the versions without and in the presence of metabolic activation. For all strains there was no revealed effect of the either solvent or system of metabolic activation on the average number of colonies of revertants in control. Generalized parameters (historical control) of the average number of colonies of revertants per plate: TA 100 - number of experiments - 317, average -118; 95% intervals of 71-165; TA 98 - number of experiments - 389, mean - 22; 95% intervals 9-36; TA 97 - the number of experiments - 217, average - 142; 95% intervals of 94-191.
Key words: Ames test, S. typhimurium TA 100, S. typhimurium TA 98, S. typhimurium TA 97, the historical negative control. For citation: Gigiena i Sanitariya. 2015; 94(7): 103-105. (In Russ.) For correspondence: Lyudmila V. Akhaltseva; е-mail: ahallv@mail.ru Received 15.03.15
Для корреспонденции: Ахальцева Людмила Вячеславовна', ahallv@mail.ru
[игиена и санитария 7/2015
Анализ мутагенной активности факторов окружающей среды - обязательная составная часть их токсикологической оценки [1-3]. К основным тестам оценки мутагенной активности химических веществ c 1970-х годов по настоящее время [4-6] относится тест Salmonella/микросомы (тест Эймса), выявляющий индукцию обратных генных мутаций от гистидинзависимости к гистидиннезависимости в специальных штаммах Salmonella typhimurium. В генетической токсикологии тест Эймса используют как для оценки мутагенного действия отдельных веществ, так и для изучения суммарной мутагенной активности загрязнений объектов окружающей среды [7-10]. Используемые штаммы позволяют выявлять мутагены разного механизма действия: ТА 100 - мутации замены пар оснований, ТА 98 и ТА 97 - мутации сдвига рамки считывания генетического кода, а варианты без (СМ-) и в присутствии системы метаболической активации (СМ+) оценивать мутагенную активность как самого вещества, так и его возможных метаболитов.
Характеристики штаммов сальмонеллы и методики проведения экспериментов приведены в ряде международных и отечественных рекомендаций [11-13].
Одним из важнейших моментов теста является характеристика уровня спонтанного мутирования используемых штаммов Salmonella typhimurium (отрицательный контроль). Уровни мутирования штаммов в экспериментах лаборатории за длительный период (исторический контроль) позволяют контролировать генотип штаммов, возможные побочные эффекты выбранных растворителей и системы метаболической активации при проведении экспериментов. В международных и отечественных методических рекомендациях указывается на необходимость включения в отчет испытаний мутагенной активности веществ «данных по историческому (лабораторному) отрицательному
Таблица 1
Статистические параметры среднего числа колоний ревертантов Salmonella typhimurium ТА 100, ТА 98 и ТА 97 на чашку в контрольных группах в вариантах СМ- и СМ+ с растворителями ДМСО и водой
Параметр Среднее число колоний ревертантов на чашку в контрольных вариантах опытов
растворитель ДМСО растворитель вода
СМ- СМ+ СМ- СМ+
Salmonella typhimurium ТА 100
Число опытов 111 85 71 50
Min - max 115-171 58,5-175 71-173,5 60,5-188
X ср 118,7 118,9 118,0 116,8
Медиана 119,0 121,0 118,5 118
а 24,6 22,7 19,5 24,6
X - 2 а + X ср ср + 2 а 69,5+167,9 73,5+164,3 79,0+157,0 Salmonella typhimurium ТА 98 67,6+166,0
Число опытов 147 117 55 70
Min - max 7-46 11-40 10-45 13-43
X ср 21,7 22,3 22,7 23,4
Медиана 21,0 21 21 21,5
а 6,8 6,5 6,8 6,6
X - 2 а + X ср ср + 2 а 8,1+35,3 9,3+35,3 8,1+36,3 10,2+36,6
Salmonella typhimurium ТА 97
Число опытов 90 38 49 40
Min - max 93-190 96-190,5 84-198,5 90-195
X ср 140,0 149,9 141,8 142,8
Медиана 138 144,75 138,5 139,25
а 24,1 22,5 25,4 24,0
X - 2 а + X ср ср + 2 а 91,8+188,2 104,9+194,9 91,0+192,6 94,8+190,8
(растворители) контролю»: диапазон колебаний, среднюю, стандартное отклонение [11, 13]. Ранее мы проводили обобщение данных по количеству колоний ревертанов на чашку в контроле с другими штаммами S. typhimurium [14]. В настоящей работе обобщены данные контролей по штаммам, рекомендуемым для теста Эмса в современных документах.
Цель работы - проанализировать данные контрольных вариантов с растворителями (диметилсульфоксид (ДМСО) и дистиллированная вода) в экспериментах, проведенных в лаборатории генетического мониторинга за период 2004-2014 гг.
Материалы и методы
Штаммы Salmonella typhimurium ТА 100, ТА 98 и ТА 97 получены из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика».
Эксперименты проведены в варианте без метаболической активации (СМ-) и с метаболической активацией (СМ+) с 9000 g фракцией гомогената печени самцов крыс Вистар после однократного введения индуктора микросомальных ферментов Со-вол (300 мг/кг внутрибрюшинно за 5 сут до эвтаназии).
Непосредственно перед экспериментом готовили микросо-мальную активирующую смесь, содержащую в 1 мл 0,1-0,3 мл фракции, нормированной по содержанию белка (4 мг на чашку), по 0,1 мл растворов НАДФ и глюкозо-6-фосфата, затем доводили до 1 мл 0,2 М фосфатным буфером, содержащим KCl и MgCl2.
Ночную культуру центрифугировали 15 мин при 5000 об/мин. Полученный осадок ресуспендировали в буферном растворе до плотности 3-109 клеток на 1 мл.
В пробирки с расплавленным селективным полуобогащенным (0,7%) агаром вносили 0,1 мл растворителя (ДМСО или дистиллированная вода), 0,1 мл суспензии бактерий и 0,5 мл микросомальной активирующей смеси (для варианта с метаболической активацией) или 0,02 М фосфатного буфера, перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара на чашки Петри. Учет результатов проводили через 48 ч инкубации при 37оС.
В качестве единицы анализа взято среднее число ревертан-тов на чашку в контроле для каждого штамма и варианта метаболической активации. В подавляющем большинстве опытов на каждый штамм/вариант метаболической активации ставили по 2 чашки. В опыте с 3 чашками в контроле в статистический анализ брали среднее 2 первых чашек.
Результаты и обсуждение
В табл. 1 представлены статистические параметры среднего числа колоний ревертантов на чашку Salmonella typhimurium ТА 100, ТА 98 и ТА 97 в контрольных группах экспериментов 20042014 гг. с растворителями ДМСО и дистиллированной водой в вариантах СМ- и СМ+: число опытов, min-max - минимальное и максимальное среднее число колоний ревертантов на чашку в контрольном варианте опыта; Хф - среднее число колоний ревертантов на чашку в контрольных вариантах опытов в подгруппе; Медиана - медиана числа колоний ревертантов на чашку в контрольных вариантах опытов в подгруппе; а - стандартное отклонение.
Таблица 2
Статистические параметры среднего числа колоний ревертантов Salmonella typhimurium ТА 100, ТА 98 и ТА 97 на чашку в контрольных вариантах - эксперименты 2004-2014 гг. (исторический контроль)
Параметр TA 100 TA 98 TA 97
Число опытов (N) 317 389 217
Min-max 57-188 7-46 84-198,5
X ср 118,0 22,3 142,3
Медиана 119 21 139,5
а 23,7 6,7 24,2
X + 2 а ср 165,4 35,7 190,7
X - 2 а ср 70,6 8,9 93,9
Для всех штаммов не выявлено влияния наличия или отсутствия системы метаболической активации и вида растворителя (ДМСО и дистиллированная вода) на среднее число колоний ревертантов в эксперименте. В связи с этим мы представляем обобщенные параметры (исторический контроль) среднего числа колоний ревертантов штаммов Salmonella typhimurium ТА 100, ТА 98 и ТА 97 на чашку в контрольных вариантах опытов по результатам экспериментов лаборатории в 2004-2014 гг. (табл. 2).
Колебания количества колоний ревертантов в контрольных вариантах экспериментов лаборатории для каждого штамма Salmonella typhimurium должны быть в пределах Х ±2 а. Любые отклонения среднего количества колоний ревертантов на чашку в контроле за установленные пределы указывают на возможную методическую ошибку. В этом случае эксперимент необходимо повторить или провести проверку генотипа штамма.
Литература (п.п. 5, 11 см. References)
1. Сычева Л.П., Журков В.С., Рахманин Ю.А. Актуальные проблемы генетической токсикологии. Генетика. 2013; 49(3): 293-302.
2. Ревазова Ю.А., Журков В.С. Генетические подходы к оценке безопасности факторов среды обитания человека. Вестник РАМН. 2001; 10: 77-80.
3. Рахманин Ю. А. Генетические исследования в гигиене окружающей среды. Гигиена и санитария. 2011; 5: 4-9.
4. Бочков Н.П., Шрам Р.Я., Кулешов Н.П., Журков В.С. Система оценки химических веществ на мутагенность: общие принципы, практические рекомендации и дальнейшие разработки. Генетика. 1975; 11(10): 156-69.
6. Журков В.С., Сычева Л.П., Ингель Ф.И., Ахальцева Л.В., Юр-ченко В.В. Гармонизация с международными подходами методических документов по оценке мутагенных свойств химических факторов окружающей среды. Гигиена и санитария. 2013; 6: 49-52.
7. Журков В.С., Соколовский В.В., Можаева Т.Е., Миркис В.И., Борисов В.И., Ахальцева Л.В. Влияние хлорирования и озонирования на суммарную мутагенную активность воды поверхностного водоисточника. Гигиена и санитария. 1997; 1: 11-3.
8. Журков В.С., Русаков Н.В., Тонкопий Н.И., Сычева Л.П., Ахальцева Л.В., Неяскина Е.В. и др. Гигиеническая оценка мутагенного потенциала промышленных отходов. Гигиена и санитария. 1998; 4: 30-2.
9. Ахальцева Л.В., Журков В.С., Кирьянова Л.Ф., Неяскина Е.В., Рыжова И.Н., Севостьянова Е.М. и др. Влияние йодирования на суммарную мутагенную активность хлорированной водопроводной воды. Гигиена и санитария. 2005; 4: 18-20.
10. Журков В.С., Ахальцева Л.В., Неяскина Е.В., Крятов И.А., Тон-копий Н.И., Карцева Н.Ю. Анализ мутагенной активности водных и буферных экстрактов образцов почв, загрязненных нефтью. Гигиена и санитария. 2009; 3: 57-60.
12. МУ № 4110-86. Методические указания по изучению мутагенной активности химических веществ при обосновании их ПДК в воде. М.: Минздрав СССР; 1986.
13. Дурнев А.Д., Гуськова Т. А., Ревазова Ю.А., Меркулов В.А., Вер-стакова О.Л., Журков В.С. и др. Методические рекомендации по оценке мутагенных свойств лекарственных средств. В кн.: Ми-
ронов А.Н., ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К; 2012: 94-114.
14. Журков В.С., Дуган А.М. Анализ спонтанного фона мутирования Salmonella typhimurium. Гигиена и санитария. 1991; 1: 70-1.
References
1. Sycheva L.P., Zhurkov V.S., Rakhmanin Yu.A. Actual problems of genetic toxicology. Genetika. 2013; 49(3): 293-302. (in Russian)
2. Revazova Yu.A., Zhurkov V.S. Genetic approaches to evaluating safety of human environmental factors. Vestnik RAMN. 2001; 10: 77-80. (in Russian)
3. Rakhmanin Yu. A. Genetic studies in environmental hygiene. Gigiena i .sanitariya. 2011; 5: 4-9. (in Russian)
4. Bochkov N.P., Shram R.Ya., Kuleshov N.P., Zhurkov V.S. System for the evaluation of the risk from chemical mutagens for man: Basic principles and practical recommendations. Genetika. 1975; 11(10): 156-69. (in Russian)
5. Cimino M.C. Comparative overview of current international strategies and guidelines for genetic toxicology testing for regulatory purposes. Environ. Mol. Mutagen. 2006; 47(5): 362-90.
6. Zhurkov V.S., Sycheva L.P., Ingel' F.I., Akhal'tseva L.V., Yurchenko V.V. Harmonization with international approaches to guidance documents on methods of assessment of the mutagenic properties of chemical environmental factors. Gigiena i sanitariya. 2013; 6: 49-52. (in Russian)
7. Zhurkov V.S., Sokolovskiy V.V., Mozhaeva T.E., Mirkis V.I., Borisov V.I., Akhal'tseva L.V. Impact of chlorination and ozonization on the total mutagenic activity of drinking water. Gigiena i sanitariya. 1997; 1: 11-3. (in Russian)
8. Zhurkov V.S., Rusakov N.V., Tonkopiy N.I., Sycheva L.P., Akhal'tseva L.V., Neyaskina E.V. et al. The hygienic evaluation of the mutagenic potential of industrial wastes. Gigiena i sanitariya. 1998; 4: 30-2. (in Russian)
9. Akhal'tseva L.V., Zhurkov V.S., Kir'yanova L.F., Neyaskina E.V., Ryzhova I.N., Sevost'yanova E.M. et al. Impact of iodination on the total mutagenic activity of chlorinated tap water. Gigiena i sanitari-ya. 2005; 4: 18-20. (in Russian)
10. Zhurkov V.S., Akhal'tseva L.V., Neyaskina E.V., Kryatov I.A., Tonkopiy N.I., Kartseva N.Yu. Analysis of the mutagenic activity of aqueous and buffer extracts from oil-polluted soil samples. Gigiena i sanitariya. 2009; 3: 57-60. (in Russian)
11. OECD 471. Bacterial reverse mutation test. Test Guideline 471. OECD, Paris; 1997.
12. MU №4110-86. Guidance for study of mutagenic activity of chemicals for justifying their maximum permissible concentration in water. Moscow: Minzdrav SSSR; 1986. (in Russian)
13. Durnev A.D., Gus'kova T.A., Revazova Yu.A., Merkulov V.A., Ver-stakova O.L., Zhurkov V.S. et al. Guidance on the study of mutagenic properties of pharmacological substances. In: Mironov A.N., ed. Guide for Preclinical Studies of New Pharmacological Agents [Ruko-vodstvo po provedeniyu doklinicheskikh issledovaniy lekarstvennykh sredstv]. Part 1. Moscow: Grif i K; 2012: 94-114. (in Russian)
14. Zhurkov V.S., Dugan A.M. Analisis of spontaneous mutation level of Salmonella typhimurium. Gigiena i sanitariya. 1991; 1: 70-1. (in Russian)
Поступила 15.03.15
