Генетическая изменчивость и дифференциация крапчатого суслика по данным секвенирования контрольного региона мтДНК Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ИЗВЕСТИЯ

ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 25 2011

IZVESTIA

PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 25 2011

УДК 575.832:599.322.2

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КРАПЧАТОГО СУСЛИКА ПО ДАННЫМ СЕКВЕНИРОВАНИЯ КОНТРОЛЬНОГО РЕГИОНА мтДНК

© О. А. ЕРМАКОВ*, В. Л. СУРИН**, С. В. ТИТОВ*

*Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского,

кафедра зоологии и экологии **Гематологический научный центр РАМН, лаборатория генной инженерии e-mail: oaermakov@list.ru

Ермаков О. А., Сурин В. Л., Титов С. В. - Генетическая изменчивость и дифференциация крапчатого суслика по данным секвенирования контрольного региона мтДНК // Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского. 2011. № 25. С. 176-180. - Проведен анализ изменчивости нуклеотидных последовательностей 5'-конца контрольного региона митохондриальной ДНК (310 пн) 25 экземпляров крапчатого суслика (Spermophilus suslicus) из 20 точек ареала. Результаты анализа выявили значительный уровень генетических различий (8 %) между популяциями S. suslicus, обитающими к востоку и к западу от Днепра. Филогеографическая структура более выражена в западной части ареала.

Ключевые слова: крапчатый суслик, Spermophilus suslicus, контрольный регион мтДНК.

Ermakov O. A., Surin V. L., Titov S. V. - Genetic diversity and differentiation of the Speckled Ground Squirrel inferred from sequencing of mtDNA control region // Izv. Penz. gos. pedagog. univ. im.i V.G. Belinskogo. 2011. № 25. P. 176-180. - Sequence variation of the 5’end of the mitochondrial DNA control region (310 bp) was examined in 25 samples of Speckled ground squirrel from 20 localities in species region. Results of the analysis have revealed a significant level of distinctions (8 %) between populations S. suslicus living to the East and the West from Dnepr. The philogeographic structure is pronounced in the western part in species region.

Keywords: Speckled Ground Squirrel, Spermophilus suslicus, control region mtDNA.

Крапчатый суслик ^регшорЫ1ш suslicus (Си1-denstaedt, 1770) - широкоареальный вид наземных беличьих, распространенный от восточных районов Польши на западе до среднего течения Волги на востоке. Его ареал, протяженностью более 1700 км в долготном направлении, разделен водотоками крупных рек, в первую очередь Днепра, а также известны изолированные участки обитания: севернее р. Припяти в Белоруссии, южнее - в Люблянском воеводстве Польши и в Волынской обл. Украины [10]. В составе вида выделяют от трех [15, 16] до пяти [3, 4] или восьми [7] подвидов. Кроме того, крапчатый суслик - единственный среди палеарктических представителей рода Sper-торИт, у которого известны две хромосомные формы, разделенные р. Днепр: 2п = 36, ^ = 72 и 2п = 34, ^ = 68 [2; 13]. Существование двух форм подтверждено и аллозимными различиями [11], и выдвинуто предположение об их видовой самостоятельности [8]. Ранеесведенияомолекулярно-генетическойизменчи-вости ^ suslicus были получены по данным о структуре гена cyt Ь [9] и КАРВ-РСЯ [12], однако в эти исследования не были вовлечены зверьки из крайних запад-

ных частей ареала и экземпляры из типовых, или близко к ним расположенных, местонахождений. Данная работа восполняет указанный пробел в исследовании генетической дифференциации S. suslicus.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Всего нами были использованы образцы ДНК 25 сусликов из 20 географических точек, из них к западу от Днепра - 9 экз. из 8 точек, к востоку - 16 экз. из

12 точек. Анализировался генетический полиморфизм частичной последовательности контрольного региона мтДНК (левый домен, включая вариабельный фрагмент; 310 пн). Контрольный регион мтДНК является некодирующей областью, характеризующейся значительной изменчивостью и поэтому пригодной для выяснения вопросов генетической дифференциации на внутривидовом уровне.

ДНК выделяли из образцов печени, хранившихся в 96%-ном этаноле, либо, в случае использования музейных образцов, из когтевой фаланги четвертого пальца передней конечности, по стандартной методи-ке,включающейобработкудодецилсульфатомнатрия

и протеиназой К при 50о C в течение ночи с последующей фенольной экстракцией.

Для амплификации фрагмента контрольного региона мтДНК использовали разработанные нами специфичные для мтДНК сусликов праймеры: MDL1 TCCACCTTCAACTCCCAAAGC [5] и MDL2R GGTAGGGGATAGTCATTTGG. Для работы с музейными образцами ввиду ожидаемой деградации ДНК дополнительно использовали внутренние праймеры MDL1x GGACATTATATGTTTAATCAAC и MDL2Rx GTTGATTAAACATATAATGTCC, позволяющие амплифицировать короткие фрагменты длиной до 200 пн. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили после их электрофоретической очистки в ПААГ с использованием концевых и внутренних праймеров. Филогенетическая реконструкция была выполнена методомneighbor-joing(смодельюmaximumcomposite likelihood), различия между группами оценивались по p-дистанции в программе MEGA 4 [14]. Бутстреп под-

держки были рассчитаны на основании 500 реплик. В качестве внешней группы использовались последовательности европейского (S. dtettus) и малого (S.pyg-maeus)сусликов.

Ниже приведены номера, современные адреса, географические координаты, год сбора материала, коллектор, места хранения и номер коллекционного экземпляра (обозначение «P» соответствует экземплярам из коллекции кафедры зоологии и экологии ПГПУ, г. Пенза; «S» - Зоологического музея МГУ, г. Москва; «Z» - Зоологического музея Зоологического института РАН, г. Санкт-Петербург; «N» - Сибирского зоологического музея ИСиЭЖ РАН, г. Новосибирск). Координаты мест сбора материала определялись при помощи Интернет-сервисов Google или Yandex (Карты) через программу SAS. Планета (http://sasgis.ru).Номера, указанные перед адресом, соответствуют номерам точек на карте(рис.1).

Молдова: 1 - г. Кишинев, 46°57' с.ш. 28°44' в.д., 1941 г., Решетник, S 42203; 2 - Штефан-Водэвскийр-н, п. Оланешты, 46°30' с.ш. 29°54' в.д., 1953 г., Васильева, S 57143; Польша: 3 - Люблинское воеводство, п. Свидник, 51°13' с.ш. 22°41' в.д., 2005 г., Гондек, Р 513; Беларусь: 4 - Гродненская обл., Кореличский р-н, п. Мир, 53°27' с.ш. 26°27' в.д., 1954 г., Некрасов, N 25435; Украина: 5- Ивано-Франковскаяобл., Рогатинский р-н, п. Говри, 49°24' с.ш. 24°36' в.д., 1959 г., Татаринов, S 78307; 6- Тернопольская обл., Подволочисский р-н, п. Токи, 49°38' с.ш. 26°14' в.д., 1950 г., Иванусь, S 55668; 7 - Черновицкая обл., Кельменецкий р-н, п. Новоселица, 48°12' с.ш. 26°16' в.д., 1974 г., Петров, S 103423; 8 - г. Одесса, 46°49' с.ш. 30°21' в.д., 2000 г., Лобков, Р 207; 9 - Харьковская обл., г. Лозовая, 48°54' с.ш. 36°16' в.д., 1925 г., (из коллекции С.И. Огнева), S 11485; 10 - Луганская обл., Меловской р-н, хут. Криничный, 48°18' с.ш. 40°05' в.д., 1972 г., Воронцов, Z 67498; Россия: 11 - Московская обл., Зарайский р-н, «Великое поле», 54°47' с.ш. 38°42' в.д., 2002 г., Шекарова, Р 270; 12 - Липецкая обл., с. Донское, 52°37' с.ш. 38°58' в.д., 2000 г., Быстракова, Р 205;

13 - Саратовская обл., Аркадакский р-н, п. Соцземледельский, 51°39' с.ш. 43°41' в.д., 1997 г., Титов, Р 103; 14 - Нижегородская обл., Сеченовский р-н, с. Новоселки, 55°16' с.ш. 45°45' в.д., 2000 г., Ермаков, Р 202; 15- Чувашскаяреспублика, Цивильский р-н, п. Молодежный, 55°51' с.ш. 47°20' в.д., 2000 г., Титов, Ермаков, Р 186, Р 199, Р 239; 16 - Батыревский р-н, с. Козловка, 55°04' с.ш. 47°42' в.д., 1997 г., Титов, Р 215; 17- Ульяновская обл., Сурский р-н, п. Сурское, 54°28' с.ш. 46°42' в.д., 1997 г., Титов, Р 176; 18 - Кузоватовский р-н, с. Смышляевка, 53°45' с.ш. 47°44' в.д., 2005 г., Титов, Р 083; 19 - Николаевский р-н, с. Куроедовские Выселки, 55°06' с.ш. 47°21' в.д., 1994 г., Ермаков, Титов, Р 063; 20 - Николаевский р-н, с. Клин, 55°07' с.ш. 47°28' в.д., 2000-04 гг., Титов, Ермаков, Р 160, Р 163, Р 462.

Рис. 1. Места сбора материала, использованного для анализа. Белые значки - экземпляры, происходящие из популяций к западу от Днепра, залитые - к востоку от Днепра. Эллипсами и прописными буквами обозначены кластеры с высокими значениями бутстреп поддержек (см. рис. 2, 3). Типовые местонахождения подвидов обозначены тремя первыми буквами латинских названий таксонов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Первичная структура фрагмента контрольного региона мтДНК длиной 310 пн., следующего непосредственно за геном тРНК-Рго, определена у 25 экземпляров крапчатого суслика (рис. 2). При их сравнении было выявлено 53 вариабельных сайта (17% от общей длины фрагмента), из которых 46 являются информативными с точки зрения максимальной экономии. Отношение транзиции/трансверсии в суммарной вы-боркеоказалосьравным4.1. Содержаниенуклеотидов составило в среднем: А - 34.8%, Т - 32.7%, С - 22.1%, G - 10.4%. Все изученные экземпляры имели уникальные гаплотипы.

Различия между «западными» и «восточными» крапчатыми сусликами составили 8.0% (6.5-10.4%) нуклеотидных замен, маркерными среди которых являются трансверсия А/Т в трех позициях - 19, 238, 268 и две транзиции - С/Т (236 позиция) и А/G (264 позиция). Эти замены встречаются у всех девяти изучен-ныхкрапчатыхсусликов,обитающих кзападуотДнеп-ра, и не отмечены у восточных экземпляров (рис. 2).

В

(

j

4

г

Л-2

CI t-1 DIt

11 ......... ..t.. .С. .. . .t. . . . . . «St.. ..-Mi

2Ü-J ...... ..DC.. ..Г. .Л. ■гг ..г

Jù ». . в в .i":. .. . .т. . я ■ ■?-, , -f--«. „ , S "T-

J .. .И. . .Г S3. . . .43. .. . ..тт

и С. - .fl . .Ç, .. .

2У .. _г .■j. .

и С. - .. .■Д t\. ..

2S-J Т. .. .. .G.Q.. .. .05Г. .■3.G

J3-P ■т E.Û.. . ОК. » .■Я.С C. .. .

ТА . . .С.О.. хж .в.С. .. .. ав а. .

12 _ . А . . .т ere.. .тт.

Г. h ...

■г...........

г............

■г...........

г. .сг .

Т. С. 'И. . tt . V. l'r ■' .

.ÏCTÏ.I-im. ..Т.С.Л. TCTTGC.ACTTOC. .АА. .т. .кг. т-ис...T.c.h. -Hrmsc.imcn. jn, т гсг т итг дг ТТТГТС.С.АС Т Т. ЙА. т ..СТ. Т Mi. ,№..Т.

...С ТА ....ТЧ .A LJ'.M . .aCTr.C.JBi т ...с... л ..jus. . . KBJLoa.T.a.juti.

.С. . Л . Mt. . . IttlJtK.t.Ott.AT

. ..с.ст * с. .а . . .ттта .а. ч.с. .м. т.

. . .с^.ггт л i:. „л . н тпггг-:и .л т.-::. пл.. т

LLJJ ШИ7 И И )Ш U Ш2 221111112 22 ZZ 2221212 221Ш 21 £2 I l?» мн 77771 йя-н

г 4 ГГ НЙЫ И ЫНШЭИ W 574 B9£S 4Ü №Ш

Разнообразие фрагмента контрольного региона мтДНК исследованных экземпляров оказалось различным на каждом из берегов Днепра. Уровень изменчивости среди крапчатых сусликов западной части ареала составил в среднем 4.4 ± 0.9%, что в полтора раза выше такового у сусликов из восточной части ареала - 2.9 ± 0.5%.

Реконструкция филогенетических отношений между гаплотипами исследованных S. suslicus приведена на рис. 3. Все «восточные» крапчатые суслики, обитающие на территории от Днепра до Волги, объединяются с высокой степенью бутстреп поддержки в единый кластер - А. Напротив, «западные» крапчатые суслики не образуют единую филогруппу, а устойчиво распадаются на три статистически поддержанных кластера - В, С и Б.

Рис. 3. Филогенетическое дерево гаплотипов контрольного региона мтДНК крапчатого суслика (Ж 1^). Цифры у ветвей -индексы бутстрепа (500 реплик), индексы менее 70% не указаны. Значки, номера и обозначения кластеров соответствуют таковым на рис. 1, 2.

Рис. 2. А - первичная структура фрагмента С-региона мтДНК S. suslicus (популяция 19); Б - варианты С-региона мтДНК. Приведены только вариабельные позиции, нумерация которых соответствует полной структуре. Идентичные нуклеотиды отмечены точками, звездочками обозначены маркерные замены. Номера точек сбора слева, значки справа и обозначения кластеров соответствуют таковым на рис. 1. Обозначения 8-1, 8-2 и т. п. относятся к разным особям одной популяции.

Среди сусликов, происходящих из популяций восточной части ареала, от Днепра до Волги ( кластер А ), выраженнаяфилогеографическаяиподвидоваяструк-тура не обнаружена. Базальное положение занимает экземпляр из популяции 12, расположенной в непосредственной близости от типового местонахождения («Воронежские степи») номинативного подвида S. s. suslicus. Экземпляры из окрестностей типовых

местонахождений S. s. averini (популяция 9, «Русская Лозовая») и S. s. guttatus (популяция 14, «междуречье Пьяны и Суры») располагаются внутри кластера. На концевой ветви кластера A обособленное положение занимают суслики из популяции 15 (Чувашия, окр. г. Цивильск), изолированной от основной части ареала.

Суслики западной части ареала, формируют три значительно различающиеся филогруппы (класте -ры B, C и D), соответствующие географическим регионам и, вероятно, подвидовой структуре.

«Волынско-Подольскую» филогруппу (кластер B) образуют гаплотипы сусликов из популяций 5 и 6, находящихся в окрестностях одноименных возвышенностей на Западной Украине, а также из популяций 3 и 4, расположенных в восточной Польше и на изолированном участке ареала крапчатого суслика в Белоруссии (Новогрудская возвышенность). В отношении возникновения белорусского изолята существуют две точки зрения: 1 - искусственное расселение сусликов на этой территории в начале XIX века одним из князей Радзивиллов [10], 2 - поселения являются реликтами послеледникового периода [1]. На наш взгляд, более вероятна вторая точка зрения, и ее косвеннымподтверждениемможетслужитьбазальное положение польских и белорусских сусликов (популяции 3 и 4) в рассматриваемом кластере. «Волынско-Подольские»крапчатыесуслики,по-видимому,долж-ны рассматриваться в составе подвида S. s. volhynensis, описанного из Волынской обл. Украины.

Кластеры C и D «западных» крапчатых сусликов соответствуют гидрографическим регионам, т. е. междуречьям крупных водотоков - Прута, Днестра и Южного Буга. «Пруто-Днестровская» филогруппа (кластер D) включает гаплотипы сусликов Бессарабии из окрестностей Кишинева (типовая серия подвида S. s. ognevi, популяция 1) и Северной Буковины на правобережье Днестра (популяция 7). «Одесская, или Днестровско-Бугская» (кластер С) филогруппа состоит из гаплотипов причерноморских сусликов, от-ловленныхвокрестностяхтиповогоместонахождения

S. s. odessana. Обособленное положение среди «западных» крапчатых сусликов занимает гаплотип экземпляра из популяции 2, расположенной в приустьевой областиправобережьяДнестра,что,возможно,свиде-тельствует об его анцестральном характере по отношению к подвидам S. s. ognevi (междуречье Прута и Днестра, кластер D) и S.s. odessana (междуречье Днестра и Буга, кластер С).

Таким образом, результаты молекулярно-генетического анализа фрагмента контрольного региона митохондриальной ДНК указывают на значительную генетическую дифференциацию «западных» и «восточных» крапчатых сусликов. Уровень различий мтДНК (8.0%) между ними выше, чем различия между популяциями малого суслика S. pygmaeus с правого и левого берегов Волги - 6.97% (4.85-8.74%) [6] и межвидовых различий большого (S. major) и желтого (S. fulvus) сусликов (6.7%-7.6%) [5].

Исходя из мнения И. М. громова [4], что пред-ковой формой S. suslicus следует считать позднеплейстоценовых мелких сусликов из группы citelloi-des-severskensis (типы из северо-западной Венгрии и г. Новгород-Северский), можно предположить, что некая предковая популяция крапчатого суслика, обитавшая на западе Восточно-Европейской равнины, на первом этапе дифференцировалась на формы, территориально соответствующие гидрографическим регионам, а позднее, за счет одной волны расселения через верховьяднепраиВолго-донскойводоразделкрапча-тые суслики проникли до правобережья Волги.

Благодарности: авторы благодарят руководителей и сотрудников отделов териологии Зоологических музеев МГУ (г. Москва), ЗИН РАН (г. Санкт-Петербург), ИСЭЖ РАН (г. Новосибирск), а также В. А. Лобкова (Одесса) и О. Годнек (Польша, Краков) за предоставленный коллекционный материал.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 11-04-00228-а).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бахарев В.А., Еремейчик А.П., Халецкая Ю.М. Статус и характеристика поселений крапчатого суслика ( Citellus suslicus) // Экологические проблемы Полесья и сопредельных территорий: Матер. VI Межд. научн.-практ. конф. гомель, 2004. С. 21-22.

2. Воронцов H.H., Ляпунова Е.А. Хромосомы сусликов Палеарктики ( Citellus, Marmotinae, Sciuridae, Roden-tia) // Млекопитающие (эволюция, кариология, фаунистика, систематика). Новосибирск, 1969. С. 41-47.

3. громов И.М., Ербаева Е.А. Млекопитающие фауны России и сопредельных территорий. Зайцеобразные и грызуны. СПб.: РАН, 1995. 522 с.

4. громовИ.М.,Бибиковд.И.,КалабуховН. И. идр. Наземные беличьи (Marmotinae). Фауна СССР. Млекопитающие. М.-Л.: Наука, 1965. Т. З. Вып. 2. 467 с.

5. Ермаков О.А., Сурин В.Л., Титов С.В. и др. Изучение гибридизации четырех видов сусликов (Spermophilus: Rodentia, Sciuridae) молекулярно-генетическими методами // генетика. 2002. Т. З8. № 7. С. 950-964.

6. Ермаков О.А., Титов С.В., Савинецкий А.Б. и др. Молекулярно-генетические и палеоэкологические аргументы в пользу конспецифичности малого (Spermophilus pygmaeus) и горного (S. musicus) сусликов // Зоол. журн. 2006. Т. 85. № 12. С. 1474-148З.

7. Загороднюк М.В., Федорченко А.А. Аллопатриче-ские виды среди грызунов группы Spermophilus suslicus (Mammalia) // Вестник зоологии. 1995. № 5-6. С. 49-58.

8. Кораблев В.П. Распространение хромосомных форм крапчатого суслика Spermophilus suslicus Güld., 1770 // Редкие виды млекопитающих России и сопредельных территорий. Тез. совещ. М.: ИПЭЭ, 1997. С. 50.

9. Кораблев В.П., Сузуки Х., Ляпунова Е.А. и др. Молекулярно-генетическое изучение хромосомных форм крапчатого суслика Spermophilus suslicus Guld. 1770 // Териофауна России и сопредельных территорий. Матер. VI съезда ВТО. М.: ИПЭЭ, 1999. С. 125.

10. Огнев С.И. Звери СССР и прилежащих стран. грызуны. М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1947. Т. 5. 809 с.

11. ФрисманЛ.В.,КораблевВ.П.,ЛяпуноваЕ.А.идр.Ал-лозимнаядифференциацияразнохромосомныхформ крапчатого суслика Spermophilus suslicus Guld, 1770, Rodentia // генетика. 1999. T. З5. № З. С. З78-З84.

12. ЦвиркаМ.В.,КораблевВ.П.,Челоминаг.Н.Исследо-ваниегенетической изменчивостикрапчатогосуслика Spermophilus suslicus Güld, 1770 (Rodentia, Sciuridae) // Териофауна России и сопредельных территорий: Матер. Межд. совещ. Москва, 200З. С. З76.

13. DenisovV., BielianinA.,Jordan M., Rudek Z. Karyologi-cal investigations of two species Citellus (Citellus pyg-maeus Pall. And Citellus suslicus Guld.) // Folia boil. 1969. V. 17. P. 169-174.

14. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA 4: Molecular Evolutionary Genetics Analisis (MEGA) software version 4.0 // Mol. Biol. Evol. 2007. V. 24. P. 1596-1599.

15. Thorington R. W., Hoffmann R. S. Family Sciuridae / Mammal species of the world: a taxonomic and geographic reference in (D. E.Wilson and D. M.Reeder, eds.). ЗЫ ed. Johns Hopkins University Press, Baltimore, Maryland. 2005. P. 754-818.

16. Helgen K.M., Cole F.R., Helgen L.E., Wilson D.E. Generic revision in the Holarctic Ground squirrel genus Spermophilus // J. of Mammalogy. 2009. V. 90 (2). P. 270-З05.