CC BY
82
УДК 575.86:599.322.2
М.В. Цвирка, В.П. Кораблёв
Биолого-почвенный институт ДВО РАН (г. Владивосток)
генетическая изменчивость и дифференциация длиннохвостого СУСЛИКА (Spermophilus undulatus) ПО ДАННЫМ RAPD-PCR-АНАЛИЗА
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке ДВО РАН (грант № 12-І-П6-02).
Методом RAPD-PCR-анализа суммарной клеточной ДНК с использованием десяти произвольных олигонуклеотидных праймеров впервые проведено сравнение генетической изменчивости и выяснен уровень генетической дифференциации четырех подвидов длиннохвостого суслика Spermophilus undulatus (Pallas 1773), которые по аллозимным данным относятся к двум разобщенным географическим формам - западной (S. u. eversmanni) и восточной (S. u. intercedens,
S. u. menzbieri, S. u. jacutensis). Идентифицированы 288 признаков, включая так-сон-специфичные маркерные фрагменты для отдельных подвидов, а также для двух географических форм. Рассчитаны значения параметров генетического разнообразия и построены NJ-филогенетическая реконструкция и UPGMA-дендрограмма генетического сходства популяций. Показаны высокий уровень генетической дифференциации западной и восточной форм длиннохвостого суслика (D = 0,24-0,27; р = 0,00) и близость восточных подвидов между собой (D = 0,005-0,008; р = 1,00). Проведена таксономическая оценка их молекулярных различий.
Ключевые слова: Spermophilus undulatus; RAPD-PCR-анализ; RAPD-маркеры; генетическая изменчивость; внутривидовая дифференциация; филогения.
Введение
Длиннохвостый суслик Spermophilus undulatus (Pallas 1778) - политипи-ческий вид голарктического рода Spermophilus (F. Cuvier 1825), населяющий горные и предгорные районы Северо-восточной Азии (от Джунгарского Алатау до Приамурья и Якутии). Широкое географическое распространение обусловило значительную изменчивость фенотипических характеристик входящих в его состав форм. На основании морфологических и биоэколо-гических особенностей были выделены и описаны 6 современных подвидов длиннохвостого суслика: S. undulatus undulatus (Pallas 1778), S. u. stramin-eus (Obolensky 1927), S. u. eversmanni (Brandt 1841), S. u. intercedens (Ognev 1937), S. u. jacutensis (Brandt 1843) и S. u. menzbieri (Ognev 1937) [1-3]. Получены обширные данные по географической изменчивости длиннохвостого
суслика по разным системам признаков: морфологическим [4-5] и аллозим-ным [6]. Показано, что подвиды, распространенные в западной части ареала (S. u. stramineus, S. u. eversmanni), отличаются от подвидов из восточной части (S. intercedens, S. u. menzbieri и S. u. jacutensis), S. u. undulatus занимает промежуточное положение между ними. Степень различий между группами западных и восточных подвидов по разным данным достигает уровня полу-видов [6] или видов [5].
С развитием и освоением новых молекулярных технологий существенно расширился спектр методов, привлекаемых, наряду с классическими морфологическим и биохимическим подходами, для решения таксономических проблем [7-9]. Одним из доступных методов является полимеразная цепная реакция (PCR) с использованием произвольных праймеров (RAPD - случайно амплифицированная полиморфная ДНК). С её помощью выявляется генетическая изменчивость по множеству независимых признаков, разбросанных по всему геному. Причем в последнее время было показано, что среди продуктов амплификации представлены все типы последовательностей ДНК. Благодаря считыванию информации с разных функциональных участков молекулы ДНК метод RAPD-PCR позволяет выявить «скрытую» генетическую изменчивость и более точно оценить полиморфизм по сравнению с аллозимным анализом [7]. Наряду с положительными сторонами метода существует ряд технически преодолимых сложностей и концептуальных ограничений, которые следует учитывать при работе [10-12]. Несмотря на известные недостатки метода, он остается популярным, успешно применяется в исследованиях систематики животных и наиболее адекватен для внутри- и межвидовых сравнений [13-15]. Перспективность использования RAPD-PCR-маркёров в сравнительных молекулярно-генетических, таксономических и филогенетических исследованиях палеарктических сусликов рода Spermophilus показана нами в предыдущих работах [16-20].
Цель настоящей работы - изучить генетическую изменчивость и внутривидовую дифференциацию длиннохвостого суслика Spermophilus undulatus с помощью метода полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (RAPD-PCR). Использование характеристик ядерного генома позволит на более высоком уровне оценить масштаб географической изменчивости популяций длиннохвостого суслика, определить генетическую структуру и уточнить степень генетической дифференциации подвидов из разных частей ареала.
Материалы и методики исследования
Материалом для данной работы послужили образцы тканей длиннохвостого суслика Spermophilus undulatus: S. u. eversmanni, S. u. intercedens, S. u. menzbieri и S. u. jacutensis из экспедиционных сборов 1992, 2004-2005 гг., а также 1977-1982 гг., исследованные ранее морфометрическими и алло-
зимными методами (табл. 1, рис. 1). Для межвидовых парных сравнений в анализ включили образцы S. parryi (Richardson 1825) из того же подрода (Urocitellus), что и S. undulatus, а также S. dauricus (Brandt 1843) и S. relictus (Kaschkarov 1923), относящихся к другому подроду Citellus. В качестве внешней группы использовали азиатского бурундука Tamias sibiricus (Lax-mann 1769).
ДНК исследуемых сусликов выделяли по стандартному методу фенольной депротеинизации с использованием протеиназы К и последующим осаждением изопропиловым и этиловым спиртами [21] из свежемороженых и фиксированных в спирте печени и скелетных мышц.
Для анализа использовали 10 из 26 предварительно протестированных декамерных олигонуклеотидных праймеров, инициировавших синтез различимых продуктов амплификации (OPA-02, OPC-02, OPC-05, OPC-09, OPC-10, OPC-12, OPC-16, OPC-20, OPD-05, OPE-20, «Operon Technologies Inc.», США). Во избежание методических ошибок предварительно проводили оптимизацию условий PCR-реакции с каждым праймером: уточняли активность Taq-полимеразы, подбирали оптимальную концентрацию ионов магния Mg2+ и количество ДНК-мишени.
Т а б л и ц а 1
характеристика использованного материала
№ места сбора Вид / подвид Число особей (n) Место сбора
1 S. undulatus intercedens 4 РФ, Читинская обл., Ононский р-н, с. Верхний Цасучей (долина р. Онон)
2 -//- 1 Там же, Читинский р-н, станция «Новая» (60 км на восток от Читы)
3 S. u. menzbieri 6 РФ, Амурская обл., Михайловский р-н, окр. с. Безозёрное
4 S. u. jacutensis 6 РФ, Якутия, пос. Тулагино (22 км от Якутска)
5 S. u. eversmanni 1 РФ, Республика Алтай, Онгудайский р-н, пос. Онгудай
6 -//- 1 Там же, Онгудайский р-н, пос. Каракоп
7 S. dauricus dauricus 3 РФ, Читинская обл., Ононский р-н, пос. Усть-Ималка
8 -//- 3 РФ, Читинская обл., Ононский р-н, окр. пос. Усть-Ималка
9 -//- 6 Там же, окр. пос. Усть-Ималка, кордон «Булум»
10 S. relictus relictus 4 Узбекистан, Тянь-Шань, Кураминский хр., Ангренское плато, перевал Чапанкуйды
11 S. parryi leucostictus 3 РФ, Магаданская обл., Хасын-ский р-н, окр. пос. Атка
Рис. 1. Видовые ареалы сусликов и места сбора материала в соответствии с табл. 1
Для исключения артефактных полос вследствие образования вторичных структур в праймере или контаминации ставили контрольную пробу с полной амплификационной смесью без добавления ДНК. Воспроизводимость результатов амплификации (идентичность полос в спектрах) проверяли троекратно с праймерами 0РС-02, ОРС-16, OPD-05 и двукратно с каждым из остальных праймеров.
Полимеразную цепную реакцию (RAPD-PCR) проводили в амплифика-торе «BюRad» (США) в следующих условиях: денатурация - 2 мин/94°С, затем 41 цикл: денатурация - 1 мин/94°С, отжиг - 30 сек/37°С, 15 сек/45°С, синтез - 2 мин/72°С. Стадию синтеза на конечном этапе проводили при 72°С в течение 6 мин. Реакционная смесь (25 мкл) содержала 60 нг тотальной ДНК, 1 х буфер (67 мМ трис-НС1, рН 8,8, 2 мМ MgCl2, 0,1% Tween-20, 0,01 М 2-меркаптоэтанол), по 0,2 мМ каждого dNTP, 25 пкмоль праймера, 1 ед. Taq-полимеразы.
Продукты амплификации разгоняли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия в 1х ТВЕ-буфере, в течение 1—1,5 ч до полного разделения фрагментов. В качестве маркера молекулярной массы использовали рестрицированную Pst I ДНК фага лямбда (X) известного размера. Гели фотографировали в отраженном УФ-свете с помощью гель-документирующей системы «BioRad» (США).
Для статистической обработки результатов по электрофореграммам составляли бинарные матрицы «1 - 0» (присутствие - отсутствие фрагмента), учитывая все визуально выявляемые полосы. С помощью программ РОР-GENE ver. 1.31 [22] и TFPGA-ver. 1.3 [23] рассчитывали параметры генетической изменчивости и дифференциации популяций. Оценку генетической изменчивости проводили по числу полиморфных признаков ^п), частоте
фрагментов (А) и доле полиморфных фрагментов в отдельных (Р) и совокупной выборках (Роб). Для оценки генетических различий между популяциями использовали индексы сходства I (I=2Nab/(Na+Nb), где Na и Nb - числа амплифицированных фрагментов у образцов a и b; Nab - число фрагментов с одинаковой электрофоретической подвижностью), и межпопуляционные генетические дистанции D (D = — lnI) [24]. Также проводили точный тест на дифференциацию популяций [23]. Дендрограмма генетического сходства построена посредством невзвешенного парно-группового метода с арифметическим усреднением UPGMA [25]. Филогенетическая реконструкция выполнялась методом ближайшего связывания NJ с бутстрепными оценками степени надежности порядка ветвления [26].
Результаты исследования и обсуждение
Описание RAPD-профилей. В суммарной выборке, включающей все исследованные виды, идентифицировано 288 признаков, в выборке БрегтврЫ-1ш ыпёыШш - 141 признак. Число амплифицированных фрагментов в спектрах PCR-продукгов варьировало от 6 до 21. Молекулярный вес фрагментов находился в пределах от 250 пар нуклеотидов (пн) до 2150 пн.
RAPD-спектры продуктов амплификации, полученные с каждым из 10 исследованных праймеров, показали уникальный тип распределения амплифицированных фрагментов. Праймеры ОРА—02, ОРС—02, ОРС—05, ОРС—09, ОРС—12, ОРС—20, OPD—05, ОРЕ—20 инициировали синтез полиморфных, а ОРС—10 и ОРС—16 - мономорфных профилей у особей длиннохвостого суслика 5. ыпёыШш. В целом выборки 5. ыпёыШш имели похожие спектры продуктов амплификации, отличаясь от других видов — S. раггуг, Б. dauricus и 5. ге1Шш. RAPD-профили особей трех восточных подвидов длиннохвостого суслика (X и. intercedens, S. и. тетЫеп и 5. и. jacutensis) оказались наиболее сходными между собой. Особи подвида 5. и. eversmanni отличались от них набором отдельных фрагментов, что позволяло их идентифицировать визуально (рис. 2, а—д). Так, X. и. intercedens, X. и. тетЫеп и 5. и. jacutensis имеют одни и те же фрагменты в спектрах PCR-продукгов ДНК (ОРА—021159, ОРС—02790, ОРС—09поо, ОРС—09шо, ОРС—09м, ОРС—09^, ОРБ—051700), отсутствующие у 5. ^ eversmanni. В свою очередь, последний подвид имеет наибольшее количество уникальных фрагментов (ОРА—02514, ОРС—09264, OPD—0 5 350, ОРЕ—201700), отличающих его от трёх других подвидов длиннохвостого суслика. С помощью праймера ОРС—02 выявлены фрагменты, маркирующие подвиды 5. ^ intercedens (1843 пн) и 5. ^ jacutensis (2 100 пн) (рис. 2, б). Три праймера (ОРС—20, OPD—05, ОРЕ-20) показали количественные различия между выборками (подвидами) длиннохвостого суслика, определяемые по яркости отдельных фрагментов. Так, X. и. тетЬ-ieri отличается от остальных подвидов яркостью фрагмента ОРЕ-20660, а 5. ^ eversmanni - «мажорностью» фрагмента ОРЕ-201260. Фрагменты ОРС—20920
(данные не приведены) и OPD-O51490 наиболее ярки сразу у трех выборок из восточной части ареала - Б. и. intercedens, S. и. твтЫвп, S. и. jacutensis (рис. 2, г, д).
м 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 и 12 13 14 15 16 17 18 19 1
£ .Л 843 пн
ш 1 11 § *=> I)] 1 = •— 1 II > к 1
— г- — ГГ = = — 55 — =: —
-
- -1
Рис. 2. RAPD-PCR-спектры сусликов: БрегторЪПш иЫиШш т1егсед.вт (дорожки 1-5), Б. и. menzbieri (дорожки 6-11), Б. и. ]асШет1з (дорожки 12-17) и Б. и. еуеютапт (дорожки 18-19), инициированные праймерами ОРА-02 (а), ОРС-02 (б), ОРС-09 (в), ОРD-05 (г) и ОРЕ-20 (д); М - маркер молекулярного веса (PstI)
Генетическая изменчивость и дифференциация. В табл. 2 представлены параметры генетической изменчивости БрегторНПш ипёиШш. Вследствие невысокой изменчивости RAPD-PCR-спектров выборки длиннохвостого
суслика имеют сходные значения частот фрагментов (А). В целом по всем праймерам значения данного показателя изменяются в пределах 0,38—0,48. По отдельным праймерам разброс значений несколько шире, например 0,3—0,43 (ОРС—02), 0,36—0,63 (ОРС—16), 0,35—0,64 (ОРЕ—20). Наибольшие различия по частотам фрагментов (0,11—0,63) между всеми выборками длиннохвостого суслика S. и. intercedens, S. и. тетЫеп, S. и. jacutensis, S. и. eversmanni выявлены с помощью праймера ОРС—09.
Т а б л и ц а 2
Генетическая изменчивость S. undulatus Pallas, 1773, выявляемая с помощью десяти праймеров (141 признак)
Прай- мер Нуклеотидная последовательность (5'-3') N / Nn ^об A/P
S. u. intercedens S. u. menzbieri S. u. jacutensis S. u. eversmanni
ОРА-02 TGCCGAGCTG б/4 0,б7 0,5/0 0,б1/0,83 0,б7/0 0,б7/0,33
ОРС- 02 GTGAGGCGTC 21/21 1 0,31/0,1 0,3б/0,48 0,3/0,38 0,43/0,43
ОРС- 05 GATGACCGCC 20/1б 0,8 0,5б/0,15 0,5/0,15 0,бб/0,35 0,38/0,05
ОРС- 09 CTCACCGTCC 19/1б 0,84 0,11/0,11 0,б3/0 0,53/0,1б 0,42/0,32
ОРС- 10 TGTCTGGCTG 1б/10 0,б3 0,31/0,31 0,29/0,31 0,29/0,25 0,19/0,13
ОРС- 12 TGTCATCCCC 20/7 0,35 0,32/0,25 0,11/0,1 0,21/0,25 0,13/0,05
ОРС- 1б CACACTCCAG 14/3 0,21 0,47/0,07 0,б3/0,07 0,44/0,5 0,3б/0
ОРС- 20 ACTTCGCCAC 19/19 1 0,35/0,32 0,42/0,21 0,2б/0,21 0,5/0,1б
OPD- 05 TGAGCGGACA 21/19 0,9 0,58/0,05 0,57/0 0,57/0,24 0,4/0,14
ОРЕ- 20 AACGGTGACC 10/9 0,9 0,б4/0,1 0,б3/0,1 0,52/0,3 0,35/0,1
В целом по всем праймерам 1б,б/ 13,б 0,82 0,42/0,15 0,48/0,23 0,45/0,27 0,38/0,17
_________________________________ ? ______________________________________________________
Примечание. N - общее число признаков; Ш - число полиморфных признаков; А - частота фрагментов; Роб и Р - доля полиморфных признаков в совокупной и в отдельных выборках соответственно.
Для выявления внутривидового полиморфизма наиболее эффективными оказались 6 праймеров: ОРС—02, ОРС—05, ОРС—09, ОРС—20, ОРD—05 и ОРЕ—20 (Роб = 0,79—1). Самые низкополиморфные амплификанты были получены с помощью праймеров ОРС—12 и ОРС—16 (Роб = 0—21—0—35). Среднее значение Роб для выборки X ыпйы1аЫ8 в целом, рассчитанное по всем праймерам, составляет 0,82. С помощью показателя генетического полиморфизма (Р) мы также оценивали внутрипопуляционную изменчивость разных подвидов длиннохвостого
суслика. Значения генетического полиморфизма, рассчитанные по всем праймерам, у подвидов X ыпйы1аЫ8 в целом низки: близкие значения выявлены для X и. ]аси(ет!^' и X и. швтЫвп (0,27 и 0,23 соответственно), X и. eversmanni и X и. intercedens (0,17 и 0,15 соответственно). Значения данного показателя, выявленные с помощью отдельных праймеров, внутри каждой выборки варьируют незначительно у X и. intercedens (0—0,32), X и. ]асШет!^' (0—0,38) и X и. eversmanni (0—0,43), и более широко - у X и. швтЫвп (0—0,83).
Для выявления степени генетической дифференциации между подвидами длиннохвостого суслика и видами X parryi, £ dauricus и X ^ИсШ' были рассчитаны коэффициенты генетических дистанций (В) и сходства (I) (табл. 3). Наименьшие значения В и, соответственно, наибольшие значения I обнаружены между двумя популяциями Б. и. intercedens (0,04 и 0,96). Между подвидами длиннохвостого суслика коэффициенты генетических дистанций изменяются в широком диапазоне от 0,05 (Б. и. intercedens - X и. швтЫвп) до 0,27 (Б. и. intercedens - Б. и. eversmanni), т.е. различаются более чем в 5 раз, что свидетельствует о разной степени генетической дифференциации подвидов длиннохвостого суслика между собой. Наименьшие значения выявлены между подвидами из восточной части ареала, X и. intвrcвdвns, S. и. швтЫвп, Б. и. jacutвnsis, (0,05—0,08), наибольшие - между подвидом из западной части ареала (Б. и. eversmanni) с каждым из «восточных» подвидов (0,24—0,27). Значения генетических дистанций между популяциями видов одного подрода Пю^еИт (Б. undulatus - Б. parryi) изменялись от 0,33 до 0,44, между видами разных под-родов Urocitвllus — Citвllus (Б. undulatus - X dauricus, S. undulatus - X гвНсШ', Б. parryi - Б. dauricus и Б. parryi - Б. ^Шш) были выше: от 0,37 до 0,59.
Т а б л и ц а 3
Генетическое сходство (I, выше диагонали) и различия ф, ниже диагонали) популяций сусликов рода Spermophilus по 288 RAPD-признакам
Виды Б/1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1. Б. dauricus (7) — 0,96 0,96 0,61 0,58 0,61 0,66 0,64 0,66 0,64
2. 8. dauricus (8) 0,04 — 0,95 0,61 0,57 0,60 0,64 0,63 0,66 0,62
3. S. dauricus (9) 0,04 0,05 — 0,58 0,55 0,58 0,62 0,62 0,65 0,63
4. S. и^иШи' intercedens (1) 0,49 0,50 0,54 — 0,96 0,95 0,95 0,77 0,66 0,66
5. S. и. intercedens (2) 0,54 0,56 0,59 0,04 — 0,93 0,92 0,77 0,64 0,64
6. S. и. швтЫвп (3) 0,49 0,51 0,55 0,05 0,07 — 0,94 0,77 0,66 0,65
7. S. и. jacutensis (4) 0,42 0,44 0,47 0,06 0,08 0,06 — 0,79 0,68 0,69
8. S. и. eversmanni (5) 0,45 0,47 0,48 0,26 0,27 0,26 0,24 — 0,69 0,72
9. S. пЫ^и' (10) 0,41 0,41 0,44 0,41 0,45 0,42 0,39 0,37 — 0,66
10. S. parryi (11) 0,45 0,47 0,46 0,40 0,44 0,43 0,37 0,33 0,41 —
Примечание. В скобках указано место сбора в соответствии с табл. 1.
Максимальные значения попарных генетических дистанций, рассчитанных для каждой пары сусликов по общим для них признакам (табл. 4), выявлены между S. и. intercedens - 5. и. еуеютапт, S. и. тетЫеп - S. и. eversmanni, X и. jacutensis - 5. и. eversmanni ^ = 0,39-0,41), минимальные - между 5. и. intercedens - S. и. тетЫеп ^ = 0,06). 5. и. intercedens - 5. и. jacutensis и 5. и. тетЫеп - 5. и. jacutensis имеют средние значения данного параметра (0,26 и 0,24 соответственно). Генетические расстояния между двумя географическими формами длиннохвостого суслика (восточной и западной) равняется 0,48, между близкими видами 5. иЫиШш и 5. parryi - 0,53, 5. dauricus и 5. т1Шш -0,88. Точный тест на дифференциацию с высокой достоверностью (р = 0,00) различил две пары подвидов длиннохвостого суслика S. и. тетЫеп - 5. и. eversmanni и 5. и. jacutensis - X и. eversmanni, а также восточную - западную формы длиннохвостого суслика и пару видов 5. undulatus - 5. parryi.
Т а б л и ц а 4
Параметры генетической дифференциации исследованных выборок сусликов рода Spermophilus
Выборки n N D Точный тест (р)
S. undulatus intercedens / menzbieri 10 138 0,06 1,00
menzbieri /jacutensis 12 141 0,24 1,00
intercedens / jacutensis 10 143 0,26 1,00
menzbieri / eversmanni 8 152 0,39 0,00
jacutensis / eversmanni 8 127 0,39 0,00
intercedens / eversmanni 6 157 0,41 1,00
формы восточная / западная 19 141 0,48 0,00
S. undulatus / S. parryi 22 167 0,53 0,00
S. dauricus/ S. relictus 16 158 0,88 1,00
На UPGMA-дендрограмме генетического сходства популяций, построенной на основании данных сходства и различия (ID), три подвида длиннохвостого суслика Spermophilus undulatus - S. u. intercedens, S. u. menzbieri, S. u. jacutensis образовали единую группу, от которой последовательно отделены ветви S. u. eversmanni, S. parryi и S. relictus. S. dauricus образовал самостоятельный кластер и значительно удален от трёх других видов. Внутри основного кластера генетическое расстояние между тремя подвидами S. undulatus неодинаково: S. u. menzbieri и S. u. jacutensis ближе друг к другу, чем к S. u. intercedens. Две популяции S. u. intercedens наиболее близки. Подвид S. u. eversmanni, географически удаленный от других подвидов своего вида, высоко дифференцирован, а его ответвление от основного кластера произошло на уровне, близком к межвидовому узлу.
На NJ-филогенетической реконструкции наиболее близки между собой три восточных подвида длиннохвостого суслика - S. u. intercedens, S. u. men-
zbieri и £. и. ]асЫвт1$, западный подвид £. и. еуеттапт значительно удален от них и образует самостоятельный подкластер со 100%-ной бутстреп-под-держкой (рис. 3).
Рис. 3. Филогенетическая реконструкция (Ш) сусликов БрегторНИш ип^Шж intercedens (1п1, т2), S. и. тетЫеп (т), S. и. jacutensis (/ас), S. и. eversmanni (еу), X рагтуп, S. dauricus и S. ге1Шш, полученная на основе 1 000 бутстреп-репликаций. Указаны значения бутстрепа выше 50%
Длиннохвостый суслик 8ретторЫ1ш и^иШт - сравнительно молодой вид голарктического подрода игосШПш, предки которого мигрировали из Северной Америки и заселили Северо-восточную Азию в позднем плиоцене - раннем эоплейстоцене [2, 27]. История расселения и становление ареала длиннохвостого суслика, основанные на хромосомных данных, подробно описаны Н.Н. Воронцовым и Е.А. Ляпуновой [28, 29]. Формирование ареала
и внутривидовая дифференциация Б. undulatus шли под воздействием климатических изменений, происходивших в позднем плейстоцене. Многократные периодические похолодания способствовали распространению тундростепных биотопов - основному местообитанию длиннохвостого суслика, и широкому расселению данного вида в пределах Северной Евразии. Потепление и увлажнение климата в межледниковые периоды приводили к восстановлению лесистости, регрессу тундростепей, сокращению площадей открытых ландшафтов. Последствия этих изменений - деградация видового ареала, разобщение и исчезновение длиннохвостых сусликов с ряда занимаемых территорий (оптимальные условия для обитания сохранились в горах Алтая, Саян, в ЮгоВосточной Сибири и на Дальнем Востоке) - способствовали независимому развитию популяций и накоплению генетических различий между ними.
В настоящее время длиннохвостый суслик распространен на значительной территории Северо-Восточной Азии: в Центральной Сибири и Дальнем Востоке России (от Алтая до Центральной Якутии и Приамурья), Казахстане, Монголии и северо-восточной части Китая. Современный ареал сильно фрагментирован. От основной его части, расположенной в Центральной Сибири и в основном имеющей сплошной характер, отделены множество мелких полуизолированных и изолированных участков в Восточной Сибири и два крупных обособленных участка в Якутии и Приамурье. Интенсивное заселение Сибири и Дальнего Востока, развитие промышленности и хозяйственное освоение земель в ХХ в. привели к сокращению ареала длиннохвостого суслика и частичному исчезновению этого вида с указанных территорий. В то же время строительство авто- и железнодорожных мостов и магистралей привело к расселению сусликов в местах, недоступных ранее [30]. К сожалению, на данный момент численность и динамика изменения ареала длиннохвостого суслика прослеживается лишь в отдельных регионах России [31—35], и полная картина нам неизвестна.
В современную эпоху процесс формообразования у длиннохвостого суслика продолжается [4—6]. Авторы цитируемых работ увязывали значительную изменчивость морфологических и аллозимных характеристик данного вида с палеогеологическими событиями и его современным географическим распространением, подчеркивая тем самым ведущую роль указанных факторов в микроэволюции данного вида. К этому следует добавить, что заметное влияние на характер генетической и морфологической изменчивости длиннохвостого суслика также оказывают особенности пространствен-но-этологической структуры популяций вида, динамика его расселения и адаптивные возможности.
У длиннохвостого суслика отмечены клинальный характер изменчивости морфометрических и морфотипических признаков и высокий уровень дифференциации между западными подвидами S. и. eversmanni, S. и. 5^а-ттеш и восточными X и. intercedens, S. и. тетЫеп, Б. и. jacutensis [4, 5, 36]. Б. и. и^иШш занимает промежуточное положение между группами за-
падных и восточных подвидов. Краевые подвиды различаются между собой не менее, чем разные виды X. ипйиШш и X. раггуі [2, 5]. Прежде некоторые из них были описаны как самостоятельные виды [37, 38]. Кроме того, установлен высокий уровень морфологической дифференциации между восточными подвидами длиннохвостого суслика, в то время как дифференциация между западными подвидами между собой незначительна [4, 36]. Пространственная неравномерность морфологической дифференциации подтверждается иммунологическими данными [39] и особенностями строения зубной системы [40].
Исследования географической изменчивости и внутривидовой дифференциации X. ипёиШш на генетическом уровне были продолжены с помощью электрофоретического анализа водорастворимых белков [4, 6, 41]. В серии указанных работ на основе количественных различий по генетическим вариантам белков крови трансферрина и постальбумина установлены достоверные отличия длиннохвостых сусликов западной (X. и. stramineus, X. и. eversmanni) и восточной (X. и. jacutensis, X. и. intercedens, X. и. тетЫеп) частей ареала. Кроме того, между ними выявлена гибридная зона, охватывающая большую часть ареала X. и. ипйиШш в Забайкалье [4, 6], которая, предположительно, образовалась вследствие вторичного контакта данных форм в ксеротермическую фазу четвертичного оледенения и свидетельствует о незавершенности расхождения исследованных внутривидовых форм. К сожалению, исследования сусликов из гибридной зоны не имели продолжения, что не позволило авторам корректно оценить таксономическую значимость их аллозимных отличий.
В настоящей работе были изучены только 4 подвида длиннохвостого суслика (X. и. eversmanni, X. и. intercedens, X. и. тетЬіегі, X. и. jacutensis) из 6 ныне существующих [2, 3] и исследованных ранее с помощью аллозимно-го анализа [6]. Тем не менее их географическое распространение охватывает значительную российскую часть видового ареала, и это позволило получить представление о внутривидовой генетической дифференциации X. ипёиШт на основе RAPD-PCR-маркёров. RAPD-PCR-анализ длиннохвостых сусликов из различных участков ареала позволил отличить нам западную (в данной работе представленную одним подвидом, X. и. еуег5таппг) и восточную (X. и. intercedens, X. и. jacutensis, X. и. тетЫеп) формы. Восемь праймеров из десяти (кроме ОРС—10 и ОРС—16) инициировали амплификацию специфических фрагментов, с помощью которых легко идентифицировать особей этих форм на электрофореграммах. Все проведенные на основе этих данных анализы (распределение частот полиморфных признаков, оценка генетического полиморфизма и генетических дистанций, точный тест на дифференциацию популяций) также дискриминировали эти формы. Однако, несмотря на высокую генетическую дифференциацию данных пар, все же генетические дистанции между ними D = 0,24—0,27 и D = 0,48 (см. табл. 3 и 4 соответственно) ниже значений, обнаруженных при сравнении высокодифференци-
рованных видов подрода Urocitellus: S. undulatus - S. parryi (D = 0,33-0,44 и D = 0,53) и Citellus: S. dauricus - S. relictus (D = 0,41-0,44 и D = 0,88) [19, 42]. По результатам аллозимного анализа 14 белковых систем крови генетическая дифференциация западной и восточной форм длиннохвостого суслика (D = 0,187-0,192) даже превышает таковую между парами близких видов
S. suslicus - S. odessanus, S. pygmaeus - S. musicus и близка к наблюдаемой в надвидовой группе major [41, 43, 44]. По результатам сравнения последовательностей гена цитохрома b митохондриальной ДНК восточная и западная географические формы длиннохвостого суслика (D = 0,116) различаются как высокодифференцированные виды S. undulatus - S. parryi (D = 0,134) [45].
Заключение
По нашим данным, подвиды S. u. intercedens, S. u.jacutensis, S. u. menzbieri, относящиеся к восточной форме, несмотря на пространственную географическую разобщенность, мало отличаются между собой. Высокое сходство RAPD-PCR-профилей, низкие генетические дистанции (D = 0,05-0,08), результаты теста на генетическую однородность популяций (р = 1,00) и их объединение на NJ-филогенетической реконструкции и UPGMA-дендрограмме генетического сходства мы склонны рассматривать как результат общности их происхождения. Близость подвидов восточной формы между собой поддерживается данными по цитогенетическому анализу сусликов из Читинской (S. u. intercedens) и Амурской областей (S. u. menzbieri), обладающих идентичными кариотипами [46]. Более тесные родственные связи сусликов «восточной» формы показаны также при сравнении генетических дистанций и полученных по результатам аллозимного анализа (D = 0-0,021) [41] и сравнения последовательностей гена цитохрома b митохондриальной ДНК (D = 0,022-0,05) [45].
Сравнение значений генетических дистанций, полученных по 288 RAPD-PCR-признакам для популяций (0,04), подвидов (0,05-0,08), географических форм (0,24-0,27) и видов подрода Urocitellus (0,33-0,44), показало существование хиатуса между каждым из перечисленных уровней дивергенции (табл. 3). Как видно из приведенных данных, разрыв между значениями двух последовательных уровней подвиды - географические формы более значителен (в среднем в 3 раза), чем между уровнями географические формы - виды (в среднем почти в 1,7 раза).
В целом, характер генетической дифференциации длиннохвостого суслика на молекулярном уровне согласуется с данными морфологического, морфометрического и аллозимного исследований о значительной степени отличий восточной и западной форм. Высокий уровень аллозимной и молекулярной дифференциации географических форм длиннохвостого суслика позволяет с равной долей обоснованности рассматривать их либо в качестве самостоятельных таксонов видового уровня в рамках надвида S. undulatus,
либо в рамках единого вида, обладающего максимальной внутривидовой географической изменчивостью. Для решения данного вопроса необходимо провести комплексное исследование гибридной зоны этих форм в Прибайкалье и западной части Забайкалья. В любом случае существующая структура палеарктического вида Spermophilus undulatus является результатом продолжающегося процесса видообразования, географические формы которого, по всей видимости, сформировались сравнительно недавно, во время последнего гляциального (ледникового) периода.
Авторы благодарят д-ра биол. наук, проф., зав. лабораторией цитогенетики Института биологии развития Е.А. Ляпунову и канд. биол. наук, старшего научного сотрудника лаборатории цитогенетики Института биологии развития (г. Москва) О.В. Брандлера за любезное предоставление образцов тканей реликтового и длиннохвостого сусликов, д-ра биол. наук, ведущего научного сотрудника Института геологии алмаза и благородных металлов СО РАН (г. Якутск) Г.Г. Боескорова и младшего научного сотрудника Биолого-почвенного института ДВО РАН (г. Владивосток) Ю.В. Татонову - за помощь в сборе и обработке материала.
Литература
1. Громов И.М., Гуреев А.А., Новиков Г.А. и др. Млекопитающие фауны СССР. Ч. 1. М. ;
Л. : Изд-во АН СССР, 1963. 638 с.
2. Громов И.М., Бибиков Д.И., Калабухов Н.Н., Мейер М.Н. Фауна СССР. Млекопитаю-
щие. Наземные Беличьи (Maimotinae). М. ; Л. : Наука, 1965. T. 3. Вып. 2. 468 с.
3. Громов И.М., Ербаева М.А. Млекопитающие фауны России и сопредельных террито-
рий. Зайцеобразные и грызуны. СПб. : ЗИН РАН, 1995. C. 104-136.
4. Vorontsov N.N., Frisman L.V., Lyapunova E.A. et al. The effect of isolation on the morphological and genetical divergence of populations // Genetica (Neth). 1980. Vol. 52-53. P. 339-359.
5. Линецкая О.Н., Линецкий А.И. Видовые различия в характере краниометрической из-
менчивости у сусликов Восточной Палеарктики (подрод Urocitellus) // Современные подходы к изучению изменчивости. Владивосток : ДВО АН СССР, 1989. С. 99-105.
6. Фрисман Л.В., Воронцов Н.Н. Геногеографическая изменчивость длиннохвостого суслика Citellus undulatus Pallas // Современные подходы к изучению изменчивости. Владивосток : ДВО АН СССР, 1989. С. 43-60.
7. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Гене-
тика. 2002. Т. 38, № 9. С. 1173-1195.
8. ГречкоВ.В. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики // Гене-
тика. 2002. Т. 38, № 8. С. 1013-1033.
9. Avise J.C. Molecular markers, natural history and evolution. N.Y. : Chapman and Hall, 1994.
511 p.
10. Банникова А.А. Молекулярные маркеры и филогенетика млекопитающих // Журнал общей биологии. 2004. Т. 65, № 4. С. 278-305.
11. Lamboy W.F. Computing genetic similarity coefficients from RAPD data: correcting for the effects of PCR artifacts caused by variation in experimental conditions // Genome Research. 1994. Vol. 4. P. 38-43.
12. Backeljau T., DeBruynL., De Wolf H., et. al. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) and parsimony methods // Cladistics. 1995. Vol. 11, № 2. P. 119-130.
13. Потапов С.Г., BасuльевB.А., Самарина О.Г., Рысков А.П. Молекулярно-генетическое маркирование геномов представителей рода Phodopus // Генетика. 1994. T. 3G, № З. С. 61З-621.
14. Lavrenchenko L.A., Potapov S.G., Lebedev VS., Ryskov A.P. The phylogeny and system-atics of the endemic Ethiopian Lophuromys flavopunctatus species complex based upon random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis // Biochemical Systematics and Ecology. 2GG1. Vol. 29, № 11. P. 11З9-Ш1.
1З. Wasko A.P., Galletti P.M. RAPD analysis in the Neotropical fish Brycon lundii: genetic diversity and its implications for the conservation of the species // Hydrobiology. 2GG2. Vol. 474. P. 131-137.
16. Цвирка M.B. Генетическое разнообразие, филогенетические связи и систематика па-леарктических сусликов рода Spermophilus (подроды Citellus и Colobotis) : автореф. дис. ... канд. биол. наук. Владивосток : БПИ ДВО РАН, 2005. 24 с.
17. Цвирка M.B., Кораблёв B.n., Челомина Г.Н. Генетическая дифференциация близких видов сусликов Spermophilus musicus, S. pygmaeus, S. suslicus (Rodentia, Sciuridae) // Материалы междунар. конф. «Систематика, филогения и палеонтология мелких млекопитающих». СПб. : ЗИН РАН, 2GG3. С. 228-23G.
18. ЦвиркаM.B., Челомина Г.Н., Кораблёв B.n. Генетическая дифференциация, филогенетика и систематика пустынных сусликов подрода Colobotis (Spermophilus: Rodentia, Sciuridae) // Зоологический журнал. 2GG6. Т. 86, № З. С. 629-64G.
19. Цвирка M.B., Спиридонова Л.Н., Кораблёв B.n. Молекулярно-генетические связи некоторых восточно-палеарктических сусликов рода Spermophilus (Sciuridae, Rodentia) // Генетика. 2GG8. Т. 44, № 8. С. 1Ш-1116.
2G. Tsvirka M.V., Chelomina G.N., Korablev V.P. Genetic differentiation between two Palaearc-tic groups of Ground-Squirrels, Subgenera Citellus and Colobotis (Spermophilus, Sciuridae, Rodentia), based on RAPD-PCR assay // 1st European Ground Squirrel Meeting. Felsotarkany. Hungary, 2GG6. P. Зб.
21. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. М. : Мир, 1984. 474 с.
22. Yeh F.C., Boyle T.J.B. Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits // Belgian Journal of Botany. 1997. Vol. 129. P. 1З7.
23. MillerM.P. Tools for population genetic analysis (TFPGA) 1.3: A Windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data. Computer software distributed by author, 1997.
24. Nei M. Genetic distance between populations // American Naturalist. 1972. Vol. Юб, № 949. P. 283-292.
2З. Sneath P.H.A., Sokal R.R. Numerical Taxonomy. San Francisco : W.H. Freeman and Co., 1973. P. 442.
26. Saitou N., NeiM. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular Biology and Evolution. 1987. Vol. 4. P. 40б-425.
27. Агаджанян А.К. Этапы эволюции сусликов Северной Евразии // Бюллетень МОИП. Отд. Биол. 2GG6. Т. 111, вып. З. С. 4-16.
28. Bоpонцов Н.Н., Ляпунова Е.А. Строение хромосом Gtellus undulatus и история становления ареалов С. undulatus и C. parryi // Доклады АН СССР. 1969. T. 187, № 1. C. 2G7-21G.
29. Ляпунова Е.А. Видообразование и филогения некоторых видов млекопитающих на основе молекулярно-генетических подходов : автореф. дис. ... д-ра биол. наук. М. : ИБР АН РФ, 2GG2. 6G с.
3G. Соломонов Н.Г., Ануфриев А.И., Седалищев B.T. О причинах снижения численности суслика Citellus undulatus в Якутии // Териофауна России и сопредельных территорий : матер. междунар. совещ. Москва ; Тула : ИПП «Гриф и К», 2GG3. C. ЗЗ4-ЗЗЗ.
31. ПопковА.Ф., ЧипанинЕ.B. Эколого-фенетические исследования основных носителей чумы в сибирских природных очагах // Териофауна России и сопредельных территорий : матер. междун. совещ. Москва ; Тула : ИПП «Гриф и К», 2GG3. C. 272-273.
32. ПоповB.B., Bеpжуцкuй Д.Б., Ткаченко B.А. Миграционная активность длиннохвостого суслика при низкой численности // Териофауна России и сопредельных территорий : матер. междунар. совещ. Москва ; Тула : ИПП «Гриф и К», 2GG3. C. 273-274.
33. Buнокуpов B.Н. Численность и изменения ареалов длиннохвостых сусликов Якутии // Суслики Евразии (роды Spermophilus, Spermophilopsis): происхождение, систематика, экология, сохранение видового разнообразия : мат-лы рос. науч. конф. М. : КМК, 2005. С. 24-2З.
34. Muнаков И.А., Смирнов M..Н., Никитенко Б.B. Распространение и численность длиннохвостого суслика (Spermophilus undulatus Pall.) в Красноярском крае // Суслики Евразии (роды Spermophilus, Spermophilopsis): происхождение, систематика, экология, сохранение видового разнообразия : мат-лы рос. научн. конф. М. : КМК, 2005. С. бЗ-бЗ.
ЗЗ. Скалон Н£., Гагина Т.Н., Сергеев BM. Ареологические особенности и современное состояние популяций краснощекого и длиннохвостого сусликов в Кемеровской области // Суслики Евразии (роды Spermophilus, Spermophilopsis): происхождение, систематика, экология, сохранение видового разнообразия : мат-лы рос. научн. конф. М. : КМК, 2005. С. 96-98.
36. Bоpонцов Н.Н., Mежова О.Н. Клинальный характер изменчивости морфометрических признаков у Citellus undulatus - вида с дизъюнктивным ареалом // Зоологический журнал. 1982. Т. 61, № Ю. С. 1697-17G3.
37. Оболенский С.И. Предварительный обзор палеарктических сусликов (q.q. Citellus и Spermophilopsis) // Доклады АН СССР. 1927. С. 188-193.
38. Пляттер-Плохоцкий К.А. Вредные и полезные животные в сельском хозяйстве ДВК. Хабаровск : Дальгиз, 1934. 143 с.
39. Bоpонцов Н.Н., Жолнеровская Е.Н., Баранов О.К. Иммуносистематика сусликов Па-леарктики (Citєііш, Sciuridaе, Rodеntia). Серологическая дифференциация сусликов Палеарктики и подродовое членение рода // Зоологический журнал. 1981. Т. 6G. С. 1070-1077.
4G. Попков А.Ф. Внутривидовая изменчивость эколого-физиологических признаков сибирского длиннохвостого суслика Citellus undulatus Pallas : автореф. дис. . канд. биол. наук. Владивосток : БПИ ДВНЦ АН СССР, 1978. 1З9 с.
41. Крюков А.П., Шереметьева И.Н., Картавцева KB. и др. Генетические исследования ресурсных видов наземных позвоночных Российского Дальнего Востока // «Биологические ресурсы Дальнего Востока России: комплексный региональный проект ДВО РАН» / под ред. Ю.Н. Журавлёва. М. : КМК, 2GG7. С. 271-294.
42. Цвирка M.B. Молекулярно-генетические связи восточно-палеарктических сусликов рода Spermophilus (Sciuridae, Rodentia) // Териофауна России и сопредельных территорий (VIII съезд ТО). М. : КМК, 2GG7. С. ЗЗЗ.
43. Кораблев BH., Фрисман Л.B., Цвирка M.B. и др. Цитологическое и аллозимное исследование сусликов группы «major» (Spermophilus, Sciuridae, Rodentia) // Проблемы эволюции. Владивосток : Дальнаука, 2GG3. Т. З. С. 1З1-1бб.
44. Frisman L., Korablev V., Tsvirka M. et al. Genetic differentiation of ground squirrels (Spermophilus, Sciurudae, Rodentia) in major-erythrogenys-pallidicauda species group // Evolution, genetics, ecology and biodiversity: international conference. Vladivostok, 2GG1. P. З9.
4З. Tsvirka M., Korablev V., Pang J. Genetic differentiation and systematics of long-tailed ground squirrels Spermophilus undulatus Pallas, 1773 (Rodentia, Sciuridae) based on the molecular genetics analysis // Modern Achievements in Population, Evolutionary, and Ecological Genetics: International Symposium. Vladivostok, 2GG9. P. 48.
46. Кораблёв В.П. Цитогенетическое изучение изменчивости гетерохроматина и районов ядрышкового организатора у сусликов фауны СССР : автореф. дис. ... канд. биол. наук. М. : ИБР АН СССР, 1989. 26 с.
Поступила в редакцию 21.09.2012 г. Tomsk State University Journal of Biology. 2012. № 4 (20). P. 145-161
Marina V. Tsvirka, Vladimir P. Korablev
Institute of Biology and Soil Science of Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Vladivostok (Russia)
GENETIC VARIABILITY AND DIFFERENTIATION OF LONG-TAILED GROUND
SQUIRREL (Spermophilus undulatus) BASED ON RAPD-PCR ANALYSIS
The manuscript of Tsvirku M.V and Korablev VP. «Genetic variability and differentiation of long-tailed ground squirrel (Spermophilus undulatus) based on RAPD-PCR analysis» devoted to clarify the intraspecific taxonomy using the methods of molecular genetics. The study contributes to the processes of microevolution and speciation in Mammals, and studies of biodiversity in Siberia and Russian Far East.
Long-tailed ground squirrel Spermophilus undulatus (Pallas 1778) is the polytypic species of Holarctic genus Spermophilus (F. Cuvier 1825). It is distribute in the mountainous and foothill regions of the North-East Asia (from the Tien Shan to the Amur region and Yakutia). Wide geographical spread caused the considerable variability ofphenotypic characteristics of its component forms. Six subspecies of modern longtailed ground squirrel: S. undulatus undulatus (Pallas 1778); S. u. stramineus (Obolensky 1927); S. u. eversmanni (Brandt 1841); S. u. intercedens (Ognev 1937); S. u. jacutensis (Brandt 1843); S. u. menzbieri (Ognev 1937) (Gromov et al, 1963; Gromov et al, 1965; Gromov, Erbaeva, 1995) were described on the basis of bio-ecological and morphologicalfeatures. Despite of this fact the intraspecific systematics of S. undulatus based on classical morphological data is controversial and requires confirmation with using modern molecular genetic techniques.
To clarify the intraspecific taxonomy of S. undulatus comparison of genetic polymorphism of four subspecies (S. u. intercedens, S. u. eversmanni, S. u. menzbieri and
S. u. jacutensis) by RAPD-PCR analysis of total cellular DNA using ten arbitrary oligonucleotide primers. For the first time identified features showing significant differences between “western" and “eastern" forms, as well as taxon-specific marker fragments for individual subspecies. The values of the parameters of genetic diversity and phylogenetic NJ-tree and UPGMA-dendrogram of genetic similarity ofpopulations were obtained. High level of genetic differentiation between the “western" and “eastern"forms of long-tailed ground squirrel (D = 0.24—0.27, p = 0.00) and the proximity of the eastern subspecies of each to other (D = 0.005—0.008, p = 1.00) were showed. The obtained results allow to consider the validity of an equal share of two long-tailed ground squirrel geographical forms, either as separate taxa within the species level nadvida S. undulatis, or within a single species, which has a maximum intraspecific geographical variability.
Key words: Spermophilus undulatus; RAPD-PCR analysis; RAPD-markers; genetic variability; intraspecific differentiation; phylogeny.
Recеived September 21, 2012
