ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА AEROCOCCUS SP. 1KP-2016, ВЫДЕЛЕННОГО ОТ ПАЦИЕНТА С ИНФЕКЦИЕЙ КРОВОТОКА

А. В. Чаплин; И. А. Чагина; А. С. Пименова; Н. Т. Гадуа; Н. М. Каргальцева; О. Ю. Борисова; Е. Е. Донских; Л. И. Кафарская

А. В. Чаплин1-2 И. А. Чагина1, А. С. Пименова1, Н. Т. Гадуа1, Н. М. Каргальцева1, О. Ю. Борисова1-2, Е. Е. Донских2, Л. И. Кафарская2

1 Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г. Н. Габричевского, Москва, Россия

2 Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва, Россия

Бактерии рода Aerococcus часто ассоциированы с инфекциями мочевыводящих путей и кровотока у человека. Штамм Aerococcus sp. 1KP-2016, выделенный из лейкоцитарного слоя крови, обладал последовательностью 16S рРНК, совпадающей на 98,7% и менее с ранее описанными представителями данного рода. Целью работы было провести полногеномное секвенирование Aerococcus 1KP-2016 с последующей филогенетической реконструкцией. Показано, что Aerococcus 1KP-2016 является представителем нового вида рода Aerococcus, наиболее близкого к Aerococcus viridans и Aerococcus urinaeequi. Геномная последовательность, имеющая длину 2,042 млн п.н. и GC-состав 38,5%, депонирована в DBJ/EMBL/GenBank под идентификатором NEEY00000000.

Ключевые слова: Aerococcus, инфекция кровотока, лейкоцитарный слой крови, полногеномное секвенирование, филогенетический анализ

Вклад авторов: А. В. Чаплин — филогенетический анализ, анализ данных, подготовка рукописи; И. А. Чагина, А. С. Пименова, Н. Т. Гадуа — микробиологические исследования, подготовка рукописи; Н. М. Каргальцева, Л. И. Кафарская — анализ литературы, подготовка рукописи; О. Ю. Борисова — молекулярно-генетические исследования, анализ данных, анализ литературы, подготовка рукописи; Е. Е. Донских — анализ данных, анализ литературы, подготовка рукописи.

Соблюдение этических стандартов: исследование одобрено этическим комитетом ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора (протокол № 28 от 18 ноября 2014 г.); от пациента получено добровольное письменное согласие на участие в исследовании.

123 Для корреспонденции: Андрей Викторович Чаплин

ул. Адмирала Макарова, д. 10, г. Москва, 125212, Россия; okolomedik@gmail.com

Статья получена: 22.03.2023 Статья принята к печати: 16.04.2023 Опубликована онлайн: 25.04.2023

DOI: 10.24075/vrgmu.2023.012

GENETIC CHARACTERIZATION OF AEROCOCCUS SP. 1KP-2016 STRAIN ISOLATED FROM A PATIENT WITH BLOODSTREAM INFECTION

Chaplin AV1'2 Chagina IA1, Pimenova AS1, Gadua NT1, Kargaltseva NM1, Borisova OYu1'2, Donskikh EE2, Kafarskaya LI2

1 Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

2 Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia

Aerococcus genus bacteria are often associated with human urinary tract and bloodstream infections. The Aerococcus sp. 1KP-2016 strain isolated from the buffy coat had the 16S rRNA sequence that was a 98.7% (and less) match with the previously described members of this genus. The purpose of this study was to perform whole genome sequencing of Aerococcus 1KP-2016 followed by phylogenetic reconstruction. We have shown that Aerococcus 1KP-2016 belongs to the new species of the Aerococcus genus that is closest to Aerococcus viridans and Aerococcus urinaeequi. The genomic sequence, which consists of 2.042 million bps with GC content at 38.5%, was deposited in the DBJ/EMBL/GenBank under identifier NEEY00000000.

Keywords: Aerococcus, bloodstream infection, buffy coat (blood leukocyte layer), whole genome sequencing, phylogenetic analysis

Author contribution: AV Chaplin — phylogenetic analysis, data analysis, manuscript authoring; IA Chagina, AS Pimenova, NT Gadua — microbiological studies, manuscript authoring; NM Kargaltseva, LI Kafarskaya — literature analysis, manuscript authoring; OYu Borisova — molecular genetic studies, data analysis, literature analysis, manuscript authoring; EE Donskikh — data analysis, literature analysis, manuscript authoring.

Compliance with ethical standards: the study was approved by the Ethics Committee of the Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology (Minutes #28 of November 18, 2014); the patient signed a voluntary consent to participation in the study.

[X] Correspondence should be addressed: Andrey Viktorovich Chaplin 10 Admiral Makarov str., Moscow, 125212, Russia; okolomedik@gmail.co

Received: 22.03.2023 Accepted: 16.04.2023 Published online: 25.04.2023

DOI: 10.24075/brsmu.2023.012

Род Aerococcus был впервые описан в 1953 г., первым его изученным представителем стал Aerococcus viridans, выделяемый из воздуха и уличной пыли [1]. В настоящее время известно восемь видов, входящих в род Aerococcus: A. viridians, A. urinae, A. sanguinicola, A. christensenii, A. urinaehominis, A. urinaeequi, A. suis, A. vaginalis [2].

Представители рода Aerococcus чаще связаны с инфекцией мочевыводящих путей и уросепсисом [3]. Вместе с тем, в последнее десятилетие появилось много сообщений о случаях осложнений, вызываемых бактериями этого рода, в виде инфекции кровотока и инфекционного эндокардита, при которых A. urinae и A. sanguinicola считают наиболее частой этиологической причиной [2, 3]. Кроме того, было показано, что аэрококки этого рода способны вызывать инвазивные

инфекции — остеомиелит, менингит, септический артрит, перитонит, инфекции мягких тканей, этиологию которых чаще связывают с выделением Аегососсиэ-подобных микроорганизмов и А. иппае [2]. В Дании с 1987 г. описано 17 случаев бактериемии/септицемии, вызванных Аегососсиэ-подобными микроорганизмами с выделением в чистой культуре из крови, из которых в шести случаях был эндокардит, и у остальных больных — септицемия, несмотря на адекватную антимикробную терапию у семи пациентов произошел летальный исход [4]. По данным других авторов, выделение Аегососсиэ в гемокультуре расценивали как этиологический фактор бактериемии при заболеваниях мочевыделительной системы [5].

Вирулентность видов Аегососсиэ связывают со способностью этих микроорганизмов к образованию

биопленок (в том числе in vivo на клапанах сердца), агрегации тромбоцитов, бактериальной адгезии с помощью капсульного полисахарида, наличие которого было подтверждено сравнительным геномным анализом, показавшим широкое внутривидовое разнообразие локусов, ответственных за его синтез у представителей этого рода [2, 6, 7].

Целью работы было представить характеристику штамма Aerococcus sp. 1KP-2016, выделенного из крови пациента с инфекцией кровотока.

МATЕРИAЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование штамма Aerococcus sp. 1KP-2016 проводили на Columbia Agar Base (Conda; Испания) с добавлением 10% бараньей крови в течение 24-48 ч при температуре 37 ± 1 0С в микроаэрофильных условиях. Культурально-морфологические свойства выросших колоний оценивали с помощью стереоскопического микроскопа SteREO Discovery V12 (Carl Zeiss; Германия) (объектив PlanApo S 1,0 — FWD 60 мм; окуляр PI 10 x 23 Br foc). ^нотариальные свойства изучали путем окраски по Граму (ЗАО «ЭКОлаб»; Россия). Окрашенные мазки просматривали с помощью светового микроскопа Axio Scope А1 (объектив EC Plan-NEOFLUAR 100 x 1,3; окуляр PI 10 x 23 Br foc (Carl Zeiss; Германия)). Биохимические свойства бактерий были изучены с помощью коммерческой биохимической тест-системы Микро-ЛА^ест СТРЕПТОтест 16 (Лахема; Чехия) и лабораторно приготовленного теста на каталазу.

Антибиотикочувствительность изучали с помощью диско-диффузионного метода в соответствии с рекомендациями Европейского комитета по определению чувствительности к антимикробным препаратам (EUCAST) с использованием коммерческих стандартизованных бумажных дисков (HiMedia Laboratories Pvt. Limited; Индия).

Разрушение клеток для высвобождения хромосомной ДНК производили путем кипячения. Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК осуществляли согласно общепринятому протоколу [8]. Реакционная смесь для ПЦР содержала 1,5 мМ MgC^, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 50 мМ KCl, 0,1 мкМ праймеров — 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и 1492R (5'-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'), 200 мМ каждого нуклеозидтрифосфата и 1 ед. Taq ДНК-полимеразы (Thermo Fisher Scientific; Литва). Амплификацию проводили с 1 мкл препарата ДНК в общем объеме реакционной смеси 25 мкл с использованием амплификатора «^ерцик» («ДHК-Tехнология»; Россия). Очистку ПЦР-продуктов и их секвенирование проводили на базе ЗАО «Евроген» (Москва, Россия) (http://evrogen.ru/). Результаты секвенирования обрабатывали с помощью программного обеспечения ChromasLite (Technelysium Pty Ltd, Австралия) (для формата хроматограммы), секвенированные последовательности сопоставляли с международной онлайн-базой данных EMBL/NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) c помощью алгоритма megablast.

Секвенирование генома штамма Aerococcus sp. 1KP-2016 было выполнено на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора с помощью системы Ion Proton (Thermo Fisher Scientific; США). Сборка генома de novo была сделана с помощью программного обеспечения SPAdes [9]. Проверка на контаминацию сборки проведена с помощью Contest16S [10] и CheckM [11]. Для поиска систем CRISPR-Cas использовали CRISPRCasFinder [12], интегрированных фаговых геномов — PHASTER [13], генов антибиотикорезистентности — ResFinder [14].

Для сравнительного анализа были использованы все публично доступные геномы рода Aerococcus из базы данных Refseq на момент 4 октября 2021 г., а также Abiotrophia defectiva ATCC 49176T в качестве внешнего представителя (outgroup). Белок-кодирующие области в геномах, в соответствии с представленными в базах данных аннотациями, были кластеризованы в группы ортологов с использованием программного обеспечения ProteinOrtho

[15] со стандартными настройками. В результате была получена консервативная часть протеома из 543 групп ортологов, включающих в себя по одному однокопийному белок-кодирующему гену из каждого генома. Аминокислотные последовательности белков в данных группах ортологов были выровнены с помощью MUSCLE

[16] и конкатенатированы. Филогенетическая реконструкция на основании полученного конкатената выполнена с помощью алгоритма RapidNJ [17]. Среднюю нуклеотидную идентичность между геномами рассчитывали с помощью подхода ANIb и онлайн-сервиса JSpeciesWS [18]. Данные по средней нуклеотидной идентичности представлены двумя значениями через черту, чтобы отобразить различия между картированием фрагментов первого генома на второй и второго на первый соответственно. База данных GTDB, содержащая в себе альтернативную таксономию на основании исключительно филогеномного подхода [19], на момент написания статьи была представлена релизом 202.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штамм Aerococcus sp. 1KP-2016 был выделен из лейкоцитарного слоя крови пациента с инфекцией

Рис. 1. Колонии Aerococcus sp. 1 KP-2016 на колумбийском агаре (стереомикроскоп Stereo Discovery V12 (Carl Zeiss; Германия))

Рис. 2. Микрофотография мазка Aerococcus sp. 1KP-2016, окрашенного по Граму (световой микроскоп Axio Scope А1, объектив EC Plan-NEOFLUAR 100 х 1,3; окуляр PI 10 х 23 Br foc (Carl Zeiss; Германия))

кровотока (36 лет, г. Ставрополь) в августе 2016 г., у которого на протяжении длительного времени (в течение года) отмечалась субфебрильная температура.

На колумбийском агаре через 24-48 ч формировались единичные мелкие гладкие колонии размером менее 1 мм с неровными краями, приподнятым центром, полупрозрачные серовато-белого цвета с небольшой зоной гемолиза (рис. 1). В мазке, окрашенном по Граму, были выявлены грамположительные кокки, образующие тетрады (рис. 2). При оценке биохимических свойств выделенная культура дала положительные результаты на галактозидазу, эскулин, лактозу, трегалозу, и отрицательные на каталазу, гиппурат, фосфатазу, лейцин, альфа-аргинин, уреазу, маннитол, сорбитол, раффинозу, инулин, мелибиозу, рибозу. Культура была резистентна к ципрофлоксацину, офлоксацину, пенициллину, эритромицину, доксициклину, сохраняла промежуточную резистентность к клиндамицину и чувствительность только к имипенему.

Геном штамма Aerococcus sp. 1KP-2016, собранный до уровня контигов, был депонирован в DBJ/EMBL/GenBank под идентификатором NEEY00000000, впоследствии он вошел в NCBI Refseq как NZ_NEEY00000000. В результате сборки получено 119 контигов со средним покрытием 78x, суммарная длина полученной геномной последовательности составила 2,042 млн п.н. GC-состав достигал 38,5%. Алгоритм Contest16S не выявил различающихся фрагментов гена 16S рРНК, свидетельствующих о контаминации. Анализ набора консервативных генов с помощью CheckM показал оценку полноты генома 98,9% и оценку контаминации 1,1%, что соответствует высокому качеству сборки. В геноме не обнаружено локусов CRISPR. По данным PHASTER, геном имеет два предполагаемых профага в своем составе, в одном из которых присутствуют неповрежденные гены главного капсидного белка (B9P78_00230), белка хвоста (B9P78_00200) фаговой терминазы (B9P78_00240) и праймазы (B9P78_00325), что указывает на его интактность. Несмотря на низкую чувствительность штамма к антибактериальным препаратам, в результате поиска генов резистентности к антибиотикам был обнаружен только ген, кодирующий хлорамфеникол-О-ацетилтрансферазу (B9P78_09255). Регион в начале контига NEEY01000023 кодирует ряд ферментов биосинтеза полисахаридов (B9P78_05530-B9P78_05565), входящих в состав клеточной стенки или капсулы.

Последовательность 16S рРНК штамма Aerococcus sp. 1KP-2016 была на 98,7% и 98,6% идентична последовательностям типовых штаммов A. viridans и A. urinaeequi соответственно. В настоящий момент для дифференциации бактериальных видов принят порог в 98,7% [20] и, таким образом, схожесть 16S рРНК в данном случае не позволяет однозначно судить о таксономическом положении. В то же время средняя нуклеотидная идентичность между просеквенированной геномной последовательностью и геномами типовых штаммов A. viridans ATCC 11563 и A. urinaeequi DSM 20341 составлет 77,38/77,39% и 76,49/76,26% соответственно. Это значительно ниже, чем общепринятый порог в 95-96% для отнесения бактерий к одному виду [20, 21], что говорит о необходимости введения нового вида. Полученный результат дополнительно подтверждается базой данных альтернативной, построенной на сравнении геномов таксономии GTDB, в которой штамм 1KP-2016 отнесен к отдельному виду Aerococcus sp002252085.

На основании реконструкции филогении (рис. 3) показано, что наиболее родственным к штамму Aerococcus sp. 1 KP-2016 является штамм Aerococcus sp. SJQ22 (RKMG01000000), выделенный из почвы и на данный момент не отнесенный ни к одному валидированному виду рода Aerococcus. Однако средняя нуклеотидная идентичность между Aerococcus sp. 1 KP-2016 и этим штаммом составила всего лишь 87,87/88,05%, что опять же ниже общепринятого уровня сходства внутри вида.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Aerococcus являются причиной спорадических заболеваний мочевого тракта, эндокардита, инфекций ликвора и кровотока. Наиболее часто выделяют A. urinae (55-60%), A. sanguinicola (26-46%) и реже — A. viridians. В Европе и США превалирует A. sanguinicola и редко — A. viridians. Aerococcus рассматривают как часть нормальной микробиоты урогенитального тракта и выделяют из мочи при отсутствии клинических симптомов заболевания. Ретроспективное когортное исследование 2010-2015 гг. показало этиологическую роль Aerococcus при инфекциях мочевыводящих путей и бессимптомной бактериурии, преимущественно у пожилых

женщин, при этом в 35% случаев помимо аэрококков были выделены другие микроорганизмы [5, 22]. Ретроспективное когортное исследование 2005-2020 гг. больных с положительной гемокультурой аэрококков показало в 22,4% случаев достоверную клиническую картину наличия инфекции кровотока, где летальность зависела от продолжительности заболевания: при 30-дневной она составляла 17% и при трехмесячной — 24% случаев [2]. При выделении из пробы мочи или крови микробиологам трудно идентифицировать Aerococcus, так как по морфологии эти бактерии часто принимают за стафилококки, по гемолизу — за а-гемолитические стрептококки. Учитывая низкую биохимическую активность, биохимические тесты не позволяют получить достоверные результаты. В связи с этим видовая идентификация до вида возможна с использованием масс-спектрометрии, однако данная технология позволяет идентифицировать пять видов аэрококков: A. christensenii, А. sanguinicola, А. urinae, А. urinaehominis, А. viridians. Поэтому для идентификации штаммов аэрококков, выделенных из крови, применяют секвенирование гена 16S рРНК [5, 22].

Проведенное исследование позволило впервые идентифицировать штамм Aerococcus sp. 1 KP-2016, который выделен из лейкоцитарного слоя крови человека, обладает последовательностью 16S рРНК, совпадающей на 98,7% и менее с ранее описанными представителями данного рода. Проведенное полногеномное секвенирование с последующей филогенетической реконструкцией показало, что данный штамм является представителем нового вида рода Aerococcus, наиболее близкого к A. viridans и A. urinaeequi.

Следовательно, представители Aerococcus остаются микроорганизмами, у которых эпидемиологические и клинические характеристики полностью не изучены. Имеется много фундаментальных вопросов о патогенетической роли аэрококков в инфекционной инвазивной патологии. Сложности видовой идентификации внутри рода Aerococcus требуют применения современных молекулярно-генетических технологий, что позволяет определять новые виды микроорганизмов и расширять

-С

Abiotrophia defectiva ATCC 49176T (ACIN03000020) Aerococcus urinaehominis CCUG 42038BT (NZ_CP014163) Aerococcus suis DSM 21500T (NZFWXK01000000) Aerococcus sp. 1KP-2016 (NZ_NEEY01000000) Aerococcus sp. SJQ22 (NZ_RKMG01000000) Aerococcus Sp. HMSC10H05 (NZ_KV787015)

Aerococcus viridans UMB0240 ERR1203655.17957 1 67.9 (NZPNHQ01000000) Aerococcus viridans FDAARGOS 249 (NZNBTM02000000) Aerococcus viridans CCUG 4311T (NZ_CP014164) Aerococcus viridans NCTC7595 (NZJJAPS01000000) Aerococcus urinaeequi USDA-ARS-USMARC-56713 (NZ_CP013988) Aerococcus urinaeequi CCUG 28094T (NZ_CP014162) Aerococcus urinaeequi T43 (NZ_CP063067) Aerococcus viridans LL1 (NZAJTG01000000) Aerococcus urinaeequi AV208 (NZ_MDRY01000000) , Aerococcus urinaeequi 151250015-2-258-56 (NZ JACGAM010000000) H Aerococcus urinaeequi 151250009-4-258-51 (NZ_JACGA0010000000) I Aerococcus urinaeequi 151250015-1-258-55 (NZJACGAN010000000) Aerococcus sp, HMSC072A12 (NZ KV807454) Aerococcus sanguinicoia UMB623 (NZ VYW001000000) Aerococcus Sp. HMSC061A03 (NZ_KV811569) r Aerococcus sp. HMSC06H08 (NZ KV789055) Aerococcus sp. HMSC035B07 (NZ KV826915) l Aerococcus sp. HMSC062A02 (NZ_KV797951)

Aerococcus sanguinicoia UMB0139 (NZ_PKGY01000000) Aerococcus sp. HMSC23C02 (NZ_KV786066) i Aerococcus sanguinicoia CCUG 43001T (NZ_CP014160) , Aerococcus christensenii KA00e35 (NZ_KQ959339)

-i Aerococcus christensenii UMB0844 (NZPKGZ01000000)

*Aerococcus christensenii CCUG 28831 (NZ_CP014159) Aerococcus urinae ACS-120-V-Col10a (NC_015278) Aerococcus urinas UMB0621 (NZ_QMHA01000000) Aerococcus urinae UMB0722 (NZ QMHB01000000) Aerococcus urinae CCUG 36881T (NZ CP014161) Aerococcus urinae FDAARGOS 911 (NZ_CP065662) Aerococcus urinas UMB5628 (NZ_QMHJ01000000) Aerococcus urinae AU3 (NZLUKP01000000) Aerococcus urinae UMB2126 (NZ_VYWA01000000) Aerococcus urinae UMB8711 (NZ_VYVI01000000) Aerococcus urinae UMB0509 (NZ QMGX01000000) Aerococcus urinae UMB0088 (NZ_PNHS01000000) Aerococcus urinae UMB7480 (NZ_QMHM01000000) Aerococcus sp. HMSC075D05 (NZ_KV803642) Aerococcus urinae UMB0126 (NZPKGX01000000) Aerococcus urinae UMB0080 (NZ_PNHR01000000) Aerococcus urinae UMB0232 (NZ_PKGW01000000) Aerococcus urinae UMB0553 (NZ_QMGY01000000) Aerococcus urinae UMB8614 (NZ VYVN01000000) Aerococcus urinae UMB7049 (NZ_VYVT01000000) Aerococcus urinae UMB3669 (NZ_QMHI01000000) Aerococcus urinae UMB0337 (NZ_QMGW01000000) Aerococcus urinae UMB970 {NZ VYWK01000000) Aerococcus urinae UMB1741 (NZ_QMH001000000) Aerococcus urinae UMB8662 (NZ_VYVK01000000) Aerococcus urinae UMB0267 (NZ QMGV01000000) Aerococcus urinae UMB7382 (NZ_QMHL01000000) Aerococcus urinae UMB7783-2Q (NZ_JAHLMC010000000) Aerococcus urinae UMB1016 (NZ_QMHC01000000) Aerococcus urinae UMB3440 (NZ QMHH01000000) Aerococcus urinae UMB2879 (NZ_QMHG01000000) Aerococcus urinae UMB6497 (NZ_QMHK01000000) Aerococcus sp. HMSC062B07 (NZ_KV799320) Aerococcus urinae UMB2354 (NZQMHF01000000) Aerococcus urinae UMB637 (NZ_VYWL01000000) Aerococcus urinae UMB0239 (NZ_QMGU01000000) Aerococcus urinae UMB0072 (NZ_PKGV01000000) Aerococcus urinae UMB0072b (NZ PNGB01000000) Aerococcus urinae UMB0071 (NZ_QMGT01000000)

Рис. 3. Филогенетическое древо, реконструированное по последовательностям 543 консервативных однокопийных белков. Штамм, описанный в данной работе, выделен полужирным. Типовые штаммы отмечены верхним индексом «Т». Видовые названия указаны в соответствии с названиями в базе данных Refseq. Клады с уровнем bootstrap > 90 отмечены кругами

этиологический спектр возбудителей тяжелых инвазивных штамм 1KP-2016 является представителем нового

заболеваний. ВЫВОДЫ

Генотипические особенности изученного позволяют сделать вывод, что выделенный

штамма из крови

вида рода Легососоиз, который эволюционно близок Л. у1пСапз и Л. иппаееци1, но в то же время отличается от них. Необходимо дальнейшее изучение его фенотипических и хемотаксономических свойств в рамках полифазного подхода к бактериальной систематике.

Литература

1. Williams RE, Hirch A, Cowan ST. Aerococcus, a new bacterial genus. J Gen Microbiol. 1953; 8: 475-80.

2. Tai DBG, Go JR, Fida M, Saleh JA. Management and treatment of Aerococcus bacteremia and endocarditis. International J Infect Dis. 2021; 102: 584-9.

3. Rasmussen M. Aerococcus: an increasingly acknowledged human pathogen. Clin Microbiol Infect. 2016; 22: 22-7.

4. Christensen JJ, Jensen IP, Faerk J, Kristensen B, Skov R, Korner B. The Danish ALO Study Group. Bacteremia / Septicemia Due to Aerococcus-Like Organisms: Report of Seventeen Cases. Clin Infect Dis. 1995; 21 (4): 943-94.

5. Rasmussen, M. Aerococci and aerococcal infections. J Infection. 2013; 66: 467-74.

6. Yaban B, Kikhney J, Musci M, Petrich A, Schmidt J, Hajduczenia M et al. Aerococcus urinae - A potent biofilm builder in endocarditis. PLoS One. 2020; 15: е0231827.

7. Carkaci D, Hajholt K, Nielsen XC, Dargis R, Rasmussen S, Skovgaard, O. et al. Genomic characterization, phylogenetic analysis, and identification of virulence factors in Aerococcus sanguinicola and Aerococcus urinae strains isolated from infection episodes. Microb Pathog. 2017; 112: 327-40.

8. Mathieu А, Delmont ТО, Vogel ТМ, Robe Р, Nalin R, Simonet Р. Life on human surfaces: skin metagenomics. PLoS One. 2013; 8 (6): e65288.

9. Bankevich A, Nurk S, Antipov D, Gurevich AA, Dvorkin M, Kulikov AS. et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J Comput Biol. 2012; 19: 455-77.

10. Lee I, Chalita M, Ha S-M, Na S-I, Yoon S-H, Chun J. ContEst16S: an algorithm that identifies contaminated prokaryotic genomes using 16S RNA gene sequences. Int J Syst Evol Microbiol. 2017; 67: 2053-57.

11. Parks DH, Imelfort M, Skennerton CT, Hugenholtz P, Tyson GW. CheckM: assessing the quality of microbial genomes recovered from isolates, single cells, and metagenomes. Genome Res. 2015; 25: 1043-55.

12. Couvin D, Bernheim A, Toffano-Nioche C, Touchon M, Michalik J,

Néron B. CRISPRCasFinder, an update of CRISRFInder, includes a portable version, enhanced performance and integrates search for Cas proteins. Nucleic Acids Res. 2018; 46: W246-51.

13. Arndt D, Grant JR, Marcu A, Sajed T, Pon A, Liang Y. et al. PHASTER: a better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Res. 2016; 44: W16.

14. Zankari E, Hasman H, Cosentino S, Vestergaard M, Rasmussen S, Lund O, et al. Identification of acquired antimicrobial resistance genes. J Antimicrob Chemother. 2012; 67: 2640-4.

15. Lechner M, Findeiß S, Steiner L, Marz M, Stadler PF, Prohaska SJ. Proteinortho: Detection of (Co-)orthologs in large-scale analysis. BMC Bioinformatics. 2011; 12.

16. Edgar RC MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 2004; 32: 1792-7.

17. Simonsen M, Mailund T, Pedersen CNS. Rapid Neighbour-Joining. In Algorithms in Bioinformatics; Springer Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg, 2008; 113-22.

18. Richter M, Rossellô-Môra R, Oliver Glöckner F, Peplies J. JSpeciesWS: a web server for prokaryotic species circumscription based on pairwise genome comparison. Bioinformatics. 2016; 32: 929-31.

19. Parks DH, Chuvochina M, Waite DW, Rinke C, Skarshewski A, Chaumeil PA. A standardized bacterial taxonomy based on genome phylogeny substantially revises the tree of life. Nat Biotechnol. 2018; 36: 996.

20. Chun J, Oren A, Ventosa A, Christensen H, Arahal DR, da Costa MS, et al. Proposed minimal standards for the use of genome data for the taxonomy of prokaryotes. Int J Syst Evol Microbiol. 2018; 68: 461-6.

21. Richter M, Rossellô-Môra R. Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106: 19126-31.

22. Narayanasamy S, King K, Dennison A, Spelman DW, Aung AK. Clinical characteristics and laboratory identification of Aerococcus infections: an Australian tertiary centre perspective. Hindawi International J Microbiology. 2017; 5684614.

References