CC BY
39
Известия ТСХА, выпуск 4, 2006 год
УДК 517
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ СОРТОВ РИСА ПО ШАР МАРКЕРАМ
И.А. ЦВЕТКОВ*, А.Н. ИВАНОВ**, В. И. ГЛАЗКО
Выполнен сравнительный анализ продуктов амплификации ДНК с использованием праймеров PawS5, PawS6 и PawSll, концевых фрагментов ретротранспо-зон подобных элементов семейства R173 у 14 сортов риса. Получены данные о выраженных межсортовых отличиях по сочетанию длин амплифицированных фрагментов ДНК, что свидетелъствует о возможности их использования для генетической паспортизации сортов риса.
Одной из актуальных проблем в селекции культурных растений является подбор молекулярно-генетических маркеров для создания генетического паспорта, выяснения генеалогических взаимоотношений между сортами, а также маркирования главных генов хозяйственно ценных признаков. В этом отношении последнее время особый интерес вызывает новый вариант мо-лекулярно-генетических маркеров,
основанный на изучении фрагментов ДНК, на концах которых находятся последовательности, комплементарные флангу ретротранспозона и его инвертированному повтору (IRAP), либо флангу ретротранспозона и участку микросателлитного локуса (REMAP) [2, 4, 5]. Чтобы оценить эффективность применения оценок полиморфизма IRAP маркеров (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism — полиморфизм фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными терминальными участками ретротранспозона) для сортовой идентификации в настоящей работе выполнен сравнительный анализ спектров таких маркеров у 14 сортов риса при использовании в качестве праймеров фрагментов ретротранспо-зон-подобных элементов одного и того же семейства R173 [1, 7, 8]. Это семейство исходно было описано у ржи (Secale cereale). Показано, что оно включает в себя около 15 тыс.- индивиду-
* Компания «Биоком», Москва.
** ВНИИ Риса, РАСХН, Краснодар.
альных копий на диплоидный геном, рассеяных по всем 7 хромосомам. Размер индивидуальных элементов его представителей варьирует от 3000 до 6000 пар нуклеотидов (п.н.) и 2 области, фланкирующие R173 элементы, несут высокую степень гомологии с флангами одного из ретротранспозонов пшеницы [7-8].
Материалы и методы
В анализ включены 14 сортов риса из коллекции ВНИИ Риса (РАСХН, Краснодар), которые отличались по продолжительности вегетационного периода: раннеспелые сорта — Дальневосточный, Изумруд, Новатор, Садко, Спринт, Фонтан, Факел; среднеспелые — Виола, Лиман, Приморский, Янтарь и позднеспелые — Лидер, Снежинка. Препараты ДНК готовили с помощью набора реагентов <^Шка» (ООО «Компания Биоком», Москва). Для этого 3-дневные проростки отделяли от зерновки и объединив их по 10 шт. гомогенизировали в лизирующем буфере из комплекта набора. ПЦР-смесь использовали готовую на основе «сухого ядра» (ООО «Компания Биоком»), праймеры прибавляли в количестве 20 пкмоль на реакцию. Длина праймеров составляла 18 н., температура отжига варьировала от 50 до 56°С. В качестве праймеров использовали нукле-отидные последовательности, опубли-
кованные в работах [7-8], подобранные для амплификации фрагментов ДНК, на флангах которых находятся участки, комплементарные концевым последовательностям PawS5, PawSб и PawSll ретротранспозон подобных элементов семейства R173. Эти прай-меры успешно применялись для гено-типирования растений [1]. Продукты ПЦР разделяли путем электрофореза в 1,5%-м агарозном геле с трис-борат-ным буфером, окрашивали бромистым этидием, визуализировали в ультрафиолетовом свете с помощью гельдо-кументирующей системы «у^тт>.
Результаты и их обсуждение
Суммарный спектр продуктов амплификации (ампликонов) участков ДНК, фланкированных инвертированным повтором PawS5, полученный на ДНК разных сортов риса, включал 13 основных фрагментов, длиной от 1000 до 200 п.о., которые отчетливо воспроизводились при повторных ампли-фикациях. При ПЦР с этим прайме-ром у разных групп растений одних и тех же сортов не было обнаружено внутрисортовых отличий по основным ампликонам.
В то же время, наблюдаются выраженные межсортовые отличия: количество ампликонов варьировало от 5 (сорта Садко, Фонтан, Янтарь) до 9 (сорта Дальневосточный, Факел, Снежинка, рисунок). В спектрах ампли-конов почти всех исследованных сортов регулярно присутствовали 2 фрагмента с длинами в районе 500450 п.о. (табл. 1). В суммарном спектре ампликонов у 14 исследованных сортов преобладали относительно короткие фрагменты длиной 400-200 п.о. (42 ампликона) по сравнению с более длинными, 1000-700 п.о. (23 амплико-на) (см. табл. 1). В то же время каждый сорт имел уникальное сочетание амп-ликонов. Наиболее сходными по такому сочетанию оказались сорта Приморский и Янтарь; они отличались только по присутствию у сорта Приморский фрагмента длиной около 1000 п.о., не выявленного у сорта Янтарь (см. табл. 1). Эти фрагменты маркируют последовательности ДНК, расположенные между участками, комплементарными прай-меру и его инвертированному варианту. Можно ожидать, что их длина указывает на взаимное расположение копий ретротранспозон-подобного эле-
12 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16
2000
1000
750
500 250 V»? И
40 Е» Г' ' --• т t щ* я-..
Спектр продуктов амплификации, полученный с использованием в качестве праймера последовательности PawS5:1 — маркер молекулярной массы Gene Rulre 1 kb dna Ladder (фрагменты 250, 500, 750, 1000, 2000 и более п.н.), 2 — Виола, 3 — Дальневосточный, 4 — Изумруд, 5 — Лидер, 6 —Лиман, 7 — Новатор, 8 — Приморский, 9 — Рапан, 10 -Садко, 11 — Спринт, 12 — Снежинка, 13 — Факел, 14 — Фонтан, 15 — Янтарь, 16 -отрицательный контроль
Таблица 1
Длины основных продуктов амплификации, выявленных у сортов риса при использовании в качестве праймера последовательности PawS5
Сорт Длины ампликонов (п. о.) Кол-во ампликонов
1000 950 850 750 700 600 500 450 400 350 300 250 200
Раннеспелые:
Дал ь н е восточ н ы й + 0 0 + + 0 + + + + + + 0 9
Изумруд + 0 0 + 0 0 + + 0 + 0 + + 7
Новатор + 0 + 0 0 0 + + 0 + + + + 8
Садко + 0 0 0 + 0 0 + 0 + + 0 0 5
Спринт 0 0 0 0 + 0 + + + + + 0 0 6
Факел 0 0 0 + + 0 + + + + + + + 9
Фонтан + + 0 0 0 0 + + 0 + 0 0 0 5
В сумме 49 ампликонов у 7 сортов; в среднем 7 амппиконов на 1 сорт Среднеспелые:
Виола 000 + 0 + + + 0 + +
Лиман 0000 + + + + + + 0
Рапан 00000 + + + 0 + +
Приморский +0 + 000 + + 0 + 0
Янтарь 00 + 000 + + 0 + 0
В сумме 30 ампликонов у 5 сортов; в среднем 6 ампликонов на 1 сорт Позднеспелые:
Лидер +000 + 0 + + + + 0 + 0
Снежинка +00 + 00 + + + + + + +
В сумме 16 ампликонов у 2 сортов; в среднем 8 ампликонов на 1 сорт
В сумме 23 ампликона В сумме 42 ампликона
длиной в 1000-700 п. о. длиной в 400-200 п. о.
0 +
+ + +
6 7 6 6 5
мента, локализованных в комплементарных цепях ДНК. Судя по полученным данным, расстояние между такими копиями достаточно короткое по сравнению с длиной самого элемента (3000-6000 п.о., [7]), от 1000 до 200 п.о., преимущественно в районе 500-200 п.о., что позволяет предполагать кластерную организацию таких повторов в геноме риса. Интересно отметить, что использование того же праймера PawS5 в исследованиях разных таксонов растений позволило получить сходную с рисом картину распределения длин продуктов амплификации у сортов картофеля, но не у подсолнечника, у которого большинство полученных ампликонов оказалось длиннее 1000 п.о. [1].
Разнообразие сортов по продуктам амплификации свитетельствует о том, что инсерции / делеции таких фрагментов достаточно активно происходят в рассмотренных сортах риса.
Высокая скорость эволюции генома риса, связанная с транспозирующими-ся элементами, достаточно подробно
описана в литературе [6]. Показано, что скорость делеций и инсерций транс-позирующихся элементов у риса в 2 раза выше, чем средний уровень синонимичных замен по структурным генам. Повышенная мобильность членов семейства R173 обнаружена по внутрисортовой изменчивости их присутствия/отсутствия у сорта ржи в связи с продолжительностью хранения семян [3].
По-видимому, именно высокая скорость эволюции транспозирующихся последовательностей в геноме риса и может объяснять уникальность сочетания продуктов амплификации фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором PawS5 для каждого из 14 исследованных сортов риса.
В нашей работе у тех же сортов риса был выполнен сравнительный анализ спектров продуктов амплификации, полученных при использовании в качестве праймеров пары PawS6 и PawSll, маркирующих расстояние между ин-серциями в альтернативных цепях ДНК
Можно ожидать, что сортовая специфика спектров ампликонов, их относительно повышенное или пониженное количество по сравнению с другими сортами может в определенной степени отражать потенциальную генетическую стабильность сорта, поскольку она тесно ассоциирована с актами инсерций/делеций элементов семейства R173. В этой связи интересно отметить, что по суммарному количеству выявленных ампликонов (см. табл. 1,2) наибольшее их количество наблюдается у сортов Дальневосточный и Снежинка, один из которых, Дальневосточный, относительно недавно ин-тродуцирован в Краснодарский край. Однако этот вопрос, очевидно, нуждается в дальнейших исследованиях.
Выполненные исследования свидетельствуют о высокой сорт-специфичной изменчивости сайтов инсерции элементов семейства R173 в геноме риса. Использование в качестве праймера последовательности RawS5 позволяет получать относительно простые, хорошо воспроизводимые спектры продуктов амплификации, удобные для их
Таблица 2
Длины продуктов амплификации, выявленных у сортов риса при использовании в качестве праймеров последовательностей PawS6 + PawS11
Сорт Длины ампликонов (п. о.) Кол-во ампликонов
1900 1000 950 900 650 600 400
Раннеспелые:
Дальневосточный + + 0 + 0 + + 5
Изумруд + 0 0 0 0 0 0 1
Новатор + 0 0 0 0 + 0 2
Садко + 0 0 0 0 0 0 1
Спринт 0 0 0 0 0 0 0 0
Факел 0 0 0 0 0 0 + 1
Фонтан + + + + + + 0 6
В сумме 16 ампликонов у 7 сортов; в среднем 2,3 ампликона на 1 сорт
Среднеспелые:
Виола + + 0 0 0 0 0 2
Лиман + 0 + + 0 + + 5
Рапан + 0 0 0 + + 0 3
Приморский + 0 + + + 0 0 4
Янтарь + + 0 0 + 0 0 3
В сумме 17 ампликонов у 5 сортов; в среднем 3,5 ампликона на 1 сорт
Позднеспелые:
Лидер + + 0 + + + 0 5
Снежинка + + + + 0 0 + 5
В сумме 10 ампликонов у 2 сортов; в среднем 5,0 ампликона на 1 сорт
2 разных членов семейства R173. Полученные данные представлены в табл. 2. Количество четко выявляемых продуктов амплификации в этой системе оказалось существенно меньше (7), а длина их заметно больше (от 1900 до 400 п.о.), чем в случае использования в качестве праймера одной последовательности PawS5. У сорта Спринт продуктов амплификации в этой системе получить не удалось, у 5 сортов выявлены 1-2, у остальных — 3-6 ампликонов. Каждый сорт и по этим амп-ликонам имел уникальный, сорт-специфичный спектр, позволяющий отличать один сорт от другого по присутствию/ отсутствию отдельных фрагментов ДНК. Таким образом, и по распределению сайтов инсерции этих 2 элементов семейства R173 наблюдается выраженная межсортовая изменчивость.
По спектрам продуктов амплификации, полученным с использованием в качестве одного праймера PawS5 и 2 — PawS6 и PawSll, не удалось обнаружить выраженных различий между группами сортов по продолжительности вегетационного периода (табл. 1, 2).
применения при сортовой идентификации исследованных сортов риса. Использование 2 последовательностей в качестве праймеров (PawS6 и PawSll) относительно менее эффективно в связи с меньшим количеством продуктов амплификации в спектрах и возможностью их отсутствия у отдельных сортов. Тем не менее, и в этом случае выявляется сорт-специфичность спектров ампликонов у исследованных сортов риса. В общем, эта система оказывается достаточно удобной для исследований молекулярно-генетической дифференциации между сортами риса и использования полученных данных в прикладных и теоретических исследованиях.
Работа выполнялась при частичной финансовой поддержке РФФИ (грант 06-04-96788-р_юг_а)
ЛИТЕРАТУРА
1. Зайцев B.C., Хавкин Э.Е. Идентификация генотипов растений с помощью ПЦР-анализа рассеянных повторяющихся последовательностей R173 // Докл. РАСХН, 2001. № 2. С. 3-5. — 2. Календарь Р.В., Глазко В.И. Типы молекуляр-но-генетических маркеров и их применение / / Физиология и биохимия культурных растений, 2002. Т. 34. № 4. С. 141-156. — 3. Chwedorzewska K.J, Bed-narek Р.Т, Puchalski J. // Cell Mol Biol Lett, 2002. V. 7. N. 2A. P. 569-576. — 4. Flavell A.J., Knox M.R., Pearce S.R. // Plant J., 1998. V. 16. P. 643-650. — 5. Kalen-dar R., Grob Т., Regina M. et al. // Theor. Appl. Genet., 1999. V. 98. P. 704-711. — 6. Ma J., Bennetzen J.L. // PNAS, 2004. V. 101. N. 34. P. 12404-12410. — 7. Rogow-sky P.M., Liu J.Y., Manning S. et al. // Plant Mol Biol, 1992. V. 20, N. 1. P. 95102. — 8. Rogowsky P.M., Shepherd K.W., Langridge P. // Genome, 1992. V. 35. N. 4. P. 621-626.
Статья поступила
12 октября 2006 г.
SUMMARY
The comparative analysis of amplification product DNA spectra, which were received with the use as primers PawS5, PawS6 and PawSll, the end fragments of retrotransposon -like elements of family R173, in 14 rice varieties was carried out. The data about expressive differentiation between rice varieties on the combination of amplification products with different length of DNA fragments were obtained. It demonstrated the possibility to use these fragments for genetic identification of rice varieties.
