CC BY
5
УДК 598.279.23:575.2(470.4) doi:10.21685/2307-9150-2021-4-9
Генетическая дифференциация поволжской популяции орла-могильника (Aquila heliaca, Falconiformes, Accipitridae) по результатам анализа гена cyt b
М. Д. Симаков1, М. В. Корепов2, А. А. Кузьмин3, С. В. Титов4
1,4Пензенский государственный университет, Пенза, Россия 2Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова, Ульяновск, Россия 3Пензенский государственный технологический университет, Пенза, Россия
1maksimakov@bk.ru, 2korepov@list.ru, 3kuzmin-puh@yandex.ru, 4svtitov@yandex.ru
Аннотация. Актуальность и цели. Несмотря на подробную изученность изменчивости контрольного региона мтДНК орлов-могильников в поволжской популяции, должного внимания второму, менее изменчивому в филогенетическом плане мито-хондриальному маркеру - cyt b, уделено не было. Поэтому исследования полиморфизма гена cyt b в поволжской популяции A. heliaca на фоне уже имеющихся данных по изменчивости мтДНК являются актуальными и полезными для уточнения популя-ционной дифференциации орлов-могильников на уровне региональных гнездовых групп. Целью работы было изучение уровня полиморфизма и выявление специфических генетических и экологических черт поволжской популяции орла-могильника (А. heliaca) на территории Ульяновской области по данным анализа изменчивости гена cyt b митохондриальной ДНК. Материалы и методы. Материал для генетических исследований был получен из проб (n = 15) линных перьев орлов-могильников, собранных в Ульяновской области. ДНК выделяли по стандартной методике фенол-хлороформной экстракции после обработки материала протеиназой К и SDS. Для генетического анализа полиморфизма фрагмента гена cyt b (977 пн) использовали оригинальные праймеры - AqH Cyt b D (5 -GAAAGTCCCACCCTCTGCT-3') и AqH Cyt b R (5 '-GCTCCAATTAGAGGGAAGAG-3'). Полимеразноцепную реакцию (PCR) проводили в 25 мкл стандартной реакционной смеси при температуре отжига 60 °С. Секвенирование фрагментов контрольного региона мтДНК (n = 15) проводили на секвенаторе ABI 3500 (Applied Biosystems). Гаплотипическое и нуклеотид-ное разнообразие изучали с помощью программы DnaSP 5.10.01. Для реконструкции филогенетических отношений использовали методы максимального правдоподобия (ML) в программе MEGA X. Медианная сеть (Median Joining) митохондриальных гаплотипов была построена в программе PopART с использованием алгоритма TCS. Полученные нуклеотидные последовательности выявленных гаплотипов мтДНК по нуклеотидным последовательностям гена cyt b орла-могильника были депонированы в GenBank NCBI под номерами OL421575-OL421587. Для статистической обработки результатов для всех тестов был установлен уровень значимости p < 0,05. Результаты. Полученные в ходе нашего исследования данные по скрытому полиморфизму митохондриального гена cyt b географически изолированных гнездовых групп орла-могильника на территории Ульяновской области свидетельствуют о гап-лотипическом разнообразии и специфичности поволжской популяции A. heliaca. Максимальное число специфических гаплотипов отмечается в северо-восточной и южной гнездовых группах поволжской популяции, приуроченных к наиболее фрагментированным лесостепным и степным участкам Ульяновской области (Hap 3,
© Симаков М. Д., Корепов М. В., Кузьмин А. А., Титов С. В., 2021. Контент доступен по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 License / This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.
Hap 6, Hap 7 - 60 % и Hap 9, Hap 10, Hap 11 - 43 % соответственно). При этом самым распространенным в поволжской популяции гаплотипом является Hap 4, который формирует основу как гаплогруппы AqH_1 (= G1), так и каждой из выделенных географических гнездовых групп (NE - 40 %, C - 33 %, S - 57 %). В то же время таких выраженных различий в долевой гаплотипической структуре групп оказалось недостаточно для обнаружения статистически достоверно значимой генетической дифференциации ульяновской субпопуляции поволжской популяции орла-могильника. Выводы. Полученные данные по изменчивости фрагмента гена cyt b свидетельствуют, что уровень полиморфизма орла-могильника является низким, а популяция, регистрируемая на территории Ульяновской области, является достаточно однородной.
Ключевые слова: Aquila heliaca, ген cyt b, мтДНК, гаплотипическое разнообразие, поволжская популяция
Для цитирования: Симаков М. Д., Корепов М. В., Кузьмин А. А., Титов С. В. Генетическая дифференциация поволжской популяции орла-могильника (Aquila heliaca, Falconiformes, Accipitridae) по результатам анализа гена cyt b // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. 2021. № 4. С. 92-106. doi:10.21685/2307-9150-2021-4-9
Genetic differentiation of the Volga population of the eastern imperial eagle (Aquila heliaca, Falconiformes, Accipitridae) based on the cyt b gene analysis results
M.D. Simakov1, M.V. Korepov2, A.A. Kuzmin3, S.V. Titov4
1,4Penza State University, Penza, Russia ^Ulyanovsk State Pedagogical University named after I.N. Ulyanov, Ulyanovsk, Russia 3Penza State Technological University, Penza, Russia
1maksimakov@bk.ru, 2korepov@list.ru, 3kuzmin-puh@yandex.ru, 4svtitov@yandex. ru
Abstract. Background. Despite the study of the variability of the mtDNA control region of the esternimperial eagles in the Volga population, due attention was not paid to cyt b, the second mitochondrial marker. Therefore, studies of cyt b gene polymorphism in Volga population of Aquila heliaca, taking into account the available data on mtDNA variability, are relevant and useful. This is necessary to clarify the population differentiation of imperial eagles at the level of regional breeding groups. The purpose of the research is to study the level of polymorphism of the imperial eagle (A. heliaca) on the territory of the Ulyanovsk region according to the analysis of the variability of the cyt b gene of mitochondrial DNA. In addition, it was supposed to identify specific genetic and ecological traits of the Volga population. Materials and methods. The material for genetic studies was obtained from samples (n = 15) of linn feathers of imperial eagles collected in the Ulyanovsk region. DNA was isolated according to the standard procedure of phenol-chloroform extraction after treatment of the material with proteinase K and SDS. Original primers - AqH Cyt b D (5'-GAAAGTCCCACCCTCTGCT-3') and AqH Cyt b R (5'-GCTCCAATTAGGGAAGAG-3') were used for genetic analysis of polymorphism of the cyt b gene fragment (977 bp). The polymerase chain reaction (PCR) was carried out in 25 ц1 of a standard reaction mixture at an annealing temperature of 60 °C. Fragments of the mtDNA control region (n = 15) were sequenced using an ABI 3500 sequencer (Applied Biosystems). Haplotypic and nu-cleotide diversity were studied using the DnaSP 5.10.01 program. Maximum likelihood (ML) methods in the MEGA X program were used to reconstruct phylogenetic relationships. The Median network (Median Joining) of mitochondrial haplotypes was built in the
PopART program using the TCS algorithm. The obtained nucleotide sequences of mtDNA haplotypes of the cyt b gene of the imperial eagle were deposited in GenBank NCBI -OL421575-OL421587. For statistical processing of the results, the significance level p < 0.05 was set for all tests. Results. The data obtained in the course of the study on the latent polymorphism of the mitochondrial cyt b gene of geographical breeding groups of the imperial eagle on the territory of the Ulyanovsk region indicates the haplotypic diversity and specificity of the Volga population of A. heliaca. The maximum number of specific haplotypes is observed in the northeastern and southern breeding groups of the Volga population. They are confined to the most fragmented forest-steppe and steppe areas of the Ulyanovsk region (Hap 3, Hap 6, Hap 7 - 60 % and Hap 9, Hap 10, Hap 11 - 43 %, respectively). At the same time, the most common haplotype in the Volga population is Hap 4. It forms the basis of haplogroup AqH_1 (= G1) and each of the selected geographical breeding groups (NE - 40 %, C - 33 %, S - 57 %). Such pronounced differences in the shared haplotypic structure of the groups were insufficient to detect statistically significantly genetic differentiation of the Ulyanovsk subpopulation of the Volga population of the imperial eagle. Conclusions. The obtained data on the variability of the cyt b gene fragment indicate that the level of polymorphism of the imperial eagle is low, and the population recorded in the Ulyanovsk region is fairly homogeneous.
Keywords: Aquila heliaca, cyt b gene, mtDNA, haplotype diversity, Volga region population
For citation: Simakov M.D., Korepov M.V., Kuzmin A.A., Titov S.V. Genetic differentiation of the Volga population of the eastern imperial eagle (Aquila heliaca, Falconiformes, Accipitridae) based on the cyt b gene analysis results. Izvestiya vysshikh uchebnykh zavedeniy. Povolzhskiy region. Estestvennye nauki = University proceedings. Volga region. Natural sciences. 2021;(4):92-106. (In Russ.). doi:10.21685/2307-9150-2021-4-9
Одним из самых редких видов дневных хищных птиц в Поволжье является орел-могильник (Aquila heliaca, Savigny 1809). В некоторых регионах Поволжья (Пензенская область, Республика Мордовия, Чувашская республика и др.) отмечены лишь единичные его встречи [1-3]. Орел-могильник включен в Красную книгу Российской Федерации (категория 2, У, III -сокращающий численность, уязвимый вид, требующий общих мер охраны) и Красный список МСОП (VU - уязвимый вид) [4]1. Вследствие своего пале-арктического распространения в пустынных, степных и лесостепных ландшафтах от Словакии на западе до Забайкалья на востоке и особенностей биотопической приуроченности [5] этот крупный вид хищных птиц формирует не всегда четко ограниченные региональные популяции (западную, карпатскую, днепро-донскую, прикаспийскую, поволжскую и южно-уральскую и др.). При этом в зависимости от существующих региональных условий A. heliaca может образовывать достаточно большие гнездовые группы. Одним из примеров такой группы является поволжская популяция орла-могильника, ядро которой располагается на территории Ульяновской области [6, 7]. Такие региональные особенности распространения способствуют формированию некоторой генетической дифференциации и возникновению заметных генетических различий обособленных гнездовых групп орлов.
Изучение генетической дифференциации географически обособленных популяций орлов-могильников проводили на уровне изменчивости митохонд-риальной и микросателлитной ДНК. Первые исследования были посвящены
1 Об утверждении Перечня объектов животного мира, занесенных в Красную книгу Российской Федерации : приказ Министерства природных ресурсов и экологии РФ от 24 марта 2020 г. № 162. URL: www.garant.ru
изучению видовой генетической дифференциации и филогении пяти европейских орлов рода Aquila (A. clanga, A. pomarina, A. chrysaetos, A. heliaca, A. adalberti) по уровню изменчивости гена мтДНК cyt b [8]. В результате этих исследований были выявлены надежные видовые различия у изученных таксономических форм по данному молекулярно-генетическому маркеру.
Недавние наши исследования мтДНК (D-loop) в поволжской популяции орлов-могильников (Ульяновская область) выявили ее генетическую обособленность относительно западных и восточных евразийских популяций. Из восьми гаплотипов мтДНК орлов-могильников, обнаруженных на территории области, шесть гаплотипов (RA, RB, RC, RD, RE, RF) для поволжской популяции оказались специфичными, а пять - D, E, F, R, S - такими же, как митотипы, обнаруженные в Словакии, Венгрии и Казахстане [9, 10]. В последних исследованиях [10] было показано, что на уровне поволжской популяции существует более мелкая градация на локальные гнездовые группы: татарстанскую (RTat) и четыре ульяновские - северо-западную (Ul-NW), северо-восточную (Ul-NE), центральную (Ul-C) и южную (Ul-S).
Несмотря на столь подробную изученность изменчивости контрольного региона мтДНК орлов-могильников в поволжской популяции, должного внимания второму менее изменчивому в филогенетическом плане митохондри-альному маркеру - cyt b уделено не было. Поэтому исследования полиморфизма гена cyt b в поволжской популяции A. heliaca на фоне уже имеющихся данных по изменчивости мтДНК являются актуальными и необходимыми для уточнения популяционной дифференциации орлов-могильников на уровне региональных гнездовых групп.
Целью работы было изучение уровня полиморфизма и выявление специфических генетических и экологических черт поволжской популяции орла-могильника (А. heliaca) на территории Ульяновской области по данным анализа изменчивости гена cyt b митохондриальной ДНК.
Материалы и методы
Материал для генетических исследований был получен из проб (n = 15) линных перьев орлов-могильников, собранных в Ульяновской области (табл. 1, рис. 1). При изучении генетической дифференциации поволжской популяции А. heliaca кроме упомянутых выше генетических проб в аналитическую выборку (n = 20) были включены секвенсы фрагментов мтДНК (cyt b) орлов-могильников (n = 5), полученных в исследованиях других авторов (Z73465, EU345506, AJ604488, AY987285, KU646835) [8, 11-14].
ДНК выделяли из линных перьев взрослых птиц, преимущественно маховых и рулевых, собранных под гнездами орлов, а также из пульпы и крови птенцов (использовали полностью) [15] по стандартной методике фенол-хлороформной экстракции после обработки материала протеиназой К и SDS [16, 17].
Для генетического анализа полиморфизма фрагмента гена cyt b (977 пн) использовали оригинальные праймеры - AqH Cyt b D (5-GAAAGTCCCA CCCTCTGCT-3') и AqH Cyt b R (5-GCTCCAATTAGAGGGAAGAG-3'), подобранные по последовательности AJ604488, депонированной в GenBank NCBI [12]. Полимеразно-цепную реакцию (PCR) проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ трис-HCl (рН 8,9), 20 мМ сульфат аммония,
20 мкМ ЭДТА, 150 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, смесь дезок-синуклеозидтрифосфатов (200 мкМ каждого), 2 мМ хлористый магний, 15 пмоль каждого из праймеров, 2 ед. активности Taq-полимеразы и 0,1-0,2 мкг ДНК при температуре отжига 60 °C.
Таблица 1
Образцы ДНК орлов-могильников (Aquila heliaca 8ау.) поволжской популяции, использованные в исследовании
Номер образца Адрес Координаты
AqH1 Ульяновская область, Барышский район, с. Калда N 53.738056 E 47.567222
AqH7 Ульяновская область, Барышский район, с. Смольково N 53.726219 E 47.648741
AqH12 Ульяновская область, Новомалыкский район, с. Средняя Якушка N 54.154342 E 49.842140
AqH17 Ульяновская область, Чердаклинский район, с. Старое Матюшкино N 54.363333 E 49.168611
AqH24 Ульяновская область, Мелекесский район, пос. Лесной N 54.276944 E 49.173889
AqH26 Ульяновская область, Старомайнский район, с. Татарское Урайкино N 54.420000 E 49.282222
AqH27 Ульяновская область, Кузоватовский район, с. Порецкое N 53.819671 E 47.918599
AqH30 Ульяновская область, Радищевский район, пос. Соловчиха N 52.976389 E 47.804167
AqH34 Ульяновская область, Радищевский район, с. Димитриевка N 52.993909 E 47.736327
AqH36 Ульяновская область, Радищевский район, пос. Соловчиха N 53.001944 E 47.771944
AqH39 Ульяновская область, Радищевский район, пос. Соловчиха N 52.976236 E 47.803679
AqH41 Ульяновская область, Радищевский район, пос. Соловчиха N 53.000278 E 47.888889
AqH43 Ульяновская область, Радищевский район, с. Новая Лава N 53.000278 E 47.888889
AqH59 Ульяновская область, Радищевский район, с. Ореховка N 52.948056 E 48.223056
AqH60 Ульяновская область, Старомайнский район, с. Красная Река N 54.599722 E 49.127778
Секвенирование фрагментов контрольного региона мтДНК (n = 15) проводили на секвенаторе ABI 3500 (Applied Biosystems) с использованием набора реактивов BigDye® Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kits при первоначальной подготовке проб в амплификаторе SimpliAmp™ Thermal Cycler. Нуклеотидные последовательности были прочитаны и отредактированы
с помощью программы BioEdit 7.1.3.0 [18, 19]. Выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли по алгоритму ClustalW в программе Mega X с обязательной доводкой вручную [20].
Рис. 1. Места сбора перьев орлов-могильников (Aquila heliaca 8ау.) в Ульяновской области. Гнездовые группы: NW - северо-запад, КБ - северо-восток, С - центр, S - юг Ульяновской области
Гаплотипическое и нуклеотидное разнообразие изучали с помощью программы DnaSP 5.10.01 [21]. Для реконструкции филогенетических отношений использовали методы максимального правдоподобия (ML) в программе MEGA X [22]. Статистическая достоверность порядка ветвления оценивалась с помощью бутстрэп-анализа 1000 альтернативных деревьев (процент бутстрэпа, %). Модель, наилучшим образом описывающая эволюционные изменения исследуемых последовательностей, была определена в программах MEGA X на основе байесовского информационного критерия (BIC). Медианная сеть (Median Joining) митохондриальных гаплотипов была построена в программе PopART [23] с использованием алгоритма TCS [24].
Полученные нуклеотидные последовательности выявленных гаплотипов мтДНК по нуклеотидным последовательностям гена cyt b орла-могильника были депонированы в GenBank NCBI под номерами OL421575-OL421587 (табл. 2).
Таблица 2
Выявленные в Ульяновской области гаплотииы (митотииы, 977 ин) мтДНК (су! Ь) орлов-могильников
Гагшотип Нуклеотвдные замены и номера их позиций в последовательности Образцы ДНК (Ульяновская область) Номера депонированных последовательностей (аепВапкЖ:В1)
444444555788 5223678005955 92120388375889 8 6 9 8 9 2 9 0 5
Нар 1 ОСАСССАААОСОТТТАТ - ¿73465, =ЕШ45506
Нар 2 ......• • • Л 1' • • - АГ604488
Нар 3 ...........А ■ ■ С АдНбО АУ987285, ОЬ421575*
Нар 4 ...........А..... АяН1, 17, 24, 30, 36,39, 43 ОЬ421576*- С)Ь421580*
Нар 5 ■ О О О Т С С ■ О Л..... АяН7 ОЬ421581*
Нар б ......а ■ с с ■ а..... АяН12 ОЬ421582*
Нар 7 ...........АСА- ■ АяН26 ОЬ421583*
Нар 8 ......Л..... АяН27 ОЬ421584*
Нар 9 ■ С: д ..... АяН34 ОЬ421585*
Нар 10 ...........А ■ ■ А АяН41 ОЬ421586*
Нар 11 А..........А..... АяН59 ОЬ421587*
Примечание. *Гаплотипы, впервые обнаруженные в Поволжье (Ульяновская область). Во второй колонке указаны характерные нуклео-тидные замены и номер их позиций в последовательности.
Для статистической обработки результатов для всех тестов был установлен уровень значимости p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Исследования фрагментов мтДНК (977 пн) орлов-могильников поволжской популяции (n = 15) и уже известных последовательностей cyt b (n = 5, NCBI) позволили выявить 11 гаплотипов и уточнить гаплотипическое и нук-леотидное разнообразие А. heliaca в Поволжье по данному молекулярно-генетическому маркеру (DnaSP 5.10.01) (табл. 2). При этом в ходе генетического анализа было установлено, что депонированная последовательность KU646835, ошибочно признанная как фрагмент гена cyt b А. heliaca [14], принадлежит беркуту (А. chrysaetos). Последовательности Z73465 [8] и EU345506 [11] соответствуют гаплотипу Hap 1, AJ604488 [12] - Hap 2, а AY987285 [13] - Нар 4.
Число сегрегирующих сайтов составило 17, число мутаций - 17. Число сайтов с однократными заменами - 16 (поз. 9, 52, 421, 422, 430, 463, 488, 503, 555, 798, 858, 859, 892, 905 пн), число информационных сайтов - 1 (поз. 478 пн). Было выделено 11 гаплотипов (h), гаплотипическое разнообразие (Hd) составило 1,00, нуклеотидное разнообразие (Pi) - 0,20321, среднее число нуклео-тидных различий (k) - 3,455 (табл. 2). При этом выявлена низкая дисперсия разнообразия гаплотипов (0,0015; Fu's Fs statistic = -8,955, Strobeck's S statistic - 1,00), а вероятность того, что число гаплотипов равно только одиннадцати, составляет ноль процентов. Тест на нейтральность происходящих микроэволюционных событий указывает на достоверный избыток одиночных гап-лотипов и прохождение популяций через «бутылочное горлышко» с последующим подъемом численности (Tajima's D = 1,813, p < 0,05; Fu and Li's D = -2,306, p < 0,02 и Fu and Li's F = -2,469, p < 0,05). Вероятность существования такой демографической ситуации в поволжской популяции орла-могильника подтверждают данные по многолетней динамике численности и числа гнездовых пар могильников, указывающие на быстрое увеличение в последние десятилетия числа гнездящихся пар А. heliaca в Ульяновской области [6, 7, 25].
В выделенных географических гнездовых группах орлов-могильников (рис. 1) присутствуют как широко распространенные, так и специфические гаплотипы. Для всех гнездовых групп орлов характерно преобладание гапло-типа Hap 4. В северо-восточной гнездовой группе (n = 5) его доля составляет 40 %, в центральной (n = 3) - 33 %, в южной (n = 7) - 57 %. Для северовосточной группы специфическими гаплотипами оказались Hap 3, Hap 6 и Hap 7; для центральной - Hap 5 и Hap 8; а для южной - Hap 9, Hap 10 и Hap11. Выявленное долевое преобладание в географически обособленных гнездовых группах орлов-могильников четырех гаплотипов мтДНК объясняет большие нуклеотидные различия при сравнении северо-восточной группы с центральной (k = 4,667, % = 0,275) и менее выраженные различия при ее сравнении с южной (k = 2,000, % = 0,118) и при парном сравнении центральной и южной групп (k = 2,000, % = 0,118).
Для изучения полиморфизма митохондриальной ДНК орла-могильника был проведен ML-анализ последовательностей фрагментов гена cyt b мтДНК
(977 пн), представляющих гаплотипы орла-могильника (п = 15). В качестве внешней группы была использована последовательность гена су( Ь беркута [14]. Наиболее подходящей для описания филогенетических отношений между гаплотипами при построении дендрограммы оказалась Hasegawa -^Ыш - Yano модель (НОТ) - ^ = -1745,26, BIC = 3852,19; AICc = 3564,68. Для описания уровня эволюционной дифференциации и разнообразия гапло-типов была использована Татига - Nei модель (Т№3).
На дендрограмме, иллюстрирующей филогенетические отношения гап-лотипов гена су( Ь мтДНК орла-могильника, выявляются две слабо выраженные гаплогруппы (рис. 2).
Рис. 2. Дендрограмма филогенетических взаимоотношений гаплотипов орлов-могильников Aquila heliaca на основе анализа последовательностей гена cyt b мтДНК (977 пн) методом максимального правдоподобия (ML) (Hasegawa-Kishino-Yano models). Внешняя группа - беркут (A. chrysaetos). Цифры в узлах указывают на уровень бутстреп-поддержки (1000 бутстреп-реплик), справа выделены цветом и указаны выделенные гаплотипы. Сокращения мест локализации проб: MIGR - пролет, NE - северо-восток, C - центр, S - юг Ульяновской области. Гаплогруппы - AqH_1 и AqH_2 (фото орла-могильника на рис. 2 © М. Корепов)
В первую гаплогруппу (AqH_1) вошли 9 последовательностей аналитической выборки (60 %) четырех выявленных гаплотипов - Hap 3, Hap 4, Hap 10, Hap 11. Во вторую гаплогруппу (AqH_2) объединены только четыре последовательности четырех специфических гаплотипов - Hap 5, Hap 6, Hap 8, Hap 9.
При рассмотрении гаплотипического состава выделенных в филогенетическом анализе гаплогрупп орла-могильника заметна определенная закономерность. Первую гаплогруппу (AqH_1) формируют гаплотипы мтДНК, характеризующиеся (относительно Hap 1) одной или двумя нуклеотидными заменами. Вторая гаплогруппа (AqH_2), напротив, состоит из гаплотипов, имеющих от 2 до 8 нуклеотидных замен. При этом последовательности фрагмента гена cyt b мт ДНК, вошедшие во вторую гаплогруппу, очевидно, сближает общая замена G-A в 478 позиции (табл. 2).
Наибольший уровень средней эволюционной дивергенции (р-дистан-ция) по парам последовательностей был обнаружен в гаплогруппе орла-могильника AqH_2 - 0,464 ± 0,153 %. Для гаплогрупп AqH_1 этот показатель оказался значительно ниже - 0,062 ± 0,036 %. Оценка средней эволюционной дистанции между гаплогруппами A. heliaca показала, что она, ожидаемо, усредняется: AqH_1/AqH_2 - 0,365 ± 0,130 %. Результаты анализа среднего эволюционного разнообразия (л) выделенных гаплогрупп свидетельствуют о низком уровне их дифференциации. Были получены только показатели для всей выборки и при сравнении секвенсов внутри групп - 0,0022 ± 0,0007 и 0,0026 ± 0,0008 соответственно. Показатели разнообразия при межгрупповом сравнении и значение коэффициента эволюционной дифференциации гапло-типов орла-могильника не имеют статистического смысла, что также указывает на низкую дифференциацию географически обособленных гнездовых групп.
Для уточнения кластеризации анализируемых гаплотипов орлов-могильников, полученных в ходе филогенетического анализа, и выяснения микроэволюционных событий между ними была построена медианная сеть гапло-типов cyt b мтДНК, выявленных в поволжской популяции, и маркерных гап-лотипов, не обнаруженных в ней (рис. 3). Сеть построена на основании 17 сегрегирующих и 1 информативного сайтов. Нуклеотидное разнообразие (л) вошедших в сеть последовательностей составило 0,1367, коэффициент дифференциации (FST) - 0,0758 (p < 0,189), а тест Таджимы выявил генетическую структуру изучаемых гаплогрупп орлов-могильников, свидетельствующую о широком представительстве редких гаплотипов и прохождении поволжской популяции через состояние «бутылочного горлышка» с последующим подъемом численности - T's D = -2,098, при p = 0,012. В целом она подтверждает данные, полученные выше при анализе последовательностей фрагментов гена cyt b мтДНК в программе MEGA.
Результаты медианного теста указывают на существование двух генетически близких (1 нуклеотидная замена) гаплогрупп последовательностей фрагмента гена cyt b мтДНК, соответствующих группам c мéньшей (G1) и большей (G2) изменчивостью гаплотипов. В гаплогруппу G1 объединяются гаплотипы с небольшим количеством замен (0-3) относительно Hap 1, а ее состав соответствует составу филогенетической группы AqH_1 с добавлением Hap 1 и Hap 7. В гаплогруппу G2 вошли гаплотипы с большим числом замен (3-8), которые в филогенетическом анализе сформировали группу AqH_2, с добавлением Hap 2.
G1
Нар 11
G2
I sample
о M1GR
О UR-NE
О UR-C
О UR-S
Рис. 3. Медианная сеть гаплотипов, построенная на основе последовательностей фрагмента cyt b мтДНК (977 пн) орлов-могильников Aquila heliaca (n = 17).
Поперечные штрихи на ветвях показывают количество мутационных событий. Цвета обозначают образцы гаплотипов с различной географической принадлежностью: MIGR - гаплотипы, не выявленые в Поволжье (NCBI GeneBank), NE - северо-восток Ульяновской области, С - центр Ульяновской области, S - юг Ульяновской области. Размер круга пропорционален числу особей, а доли пропорциональны частотам гаплотипов. Цветными эллипсами обозначены гаплогруппы (G1 и G2)
Полученные в ходе нашего исследования данные по скрытому, в некотором смысле, полиморфизму митохондриального гена cyt b географически изолированных гнездовых групп орла-могильника на территории Ульяновской области позволили сформулировать некоторые выводы о гаплотипиче-ском разнообразии и специфичности поволжской популяции A. heliaca. Максимальное число специфических гаплотипов отмечается в северо-восточной и южной гнездовых группах поволжской популяции, приуроченных к наиболее фрагментированным лесостепным и степным участкам Ульяновской области (Hap 3, Hap 6, Hap 7 - 60 % и Hap 9, Hap 10, Hap 11 - 43 % соответственно). На участках локализации таких гнездовых групп биотопические условия потенциально подходят для географического закрепления некоторых генетических линий. При этом самым распространенным в поволжской популяции гаплотипом является Hap 4, который формирует основу как гаплогруппы AqH_1 (= G1), так и каждой из выделенных географических гнездовых групп (NE - 40 %, C - 33 %, S - 57 %). В то же время таких выраженных различий в долевой гаплотипической структуре гнездовых групп оказалось недостаточным для обнаружения статистической достоверно значимой генетической дифференциации ульяновской субпопуляции поволжской популяции орла-могильника. Таким образом, по полученным данным изменчивости фрагмента гена cyt b уровень полиморфизма орла-могильника является низким, а популяция, регистрируемая на территории Ульяновской области, является достаточно однородной.
Список литературы
1. Красная книга Пензенской области : в 2 т. 2-е изд. Пенза ; Воронеж : Воронежская областная тип. - Изд-во им. Е. А. Болховитинова, 2019. Т. 2. Животные. 264 с.
2. Красная книга Республики Мордовия : в 2 т. Саранск : Мордовское книжное изд-во, 2005. Т. 2. Животные. 336 с.
3. Красная книга Чувашской Республики. Т. 1. Ч. 2. Животные. Чебоксары : ИПК Чувашия, 2011. 372 с.
4. Красная книга Российской Федерации (животные). М. : Товарищество научных изданий КМК, 2008. 855 с.
5. Белик В. П., Галушин В. М. Популяционная структура ареала орла-могильника в Северной Евразии // Королевский орел: Распространение, состояние популяций и перспективы охраны орла-могильника (Aquila heliaca) в России : c6. науч. тр. М. : Союз охраны птиц России, 1999. С. 129-139.
6. Корепов М. В. Распространение и численность могильника (Aquila heliaca, Fal-coniformes, Accipitridae) в центральной части Приволжской возвышенности // Зоологический журнал. 2012. Т. 91, № 2. С. 190-201.
7. Корепов М. В., Бородин О. В. Солнечный орел (Aquila heliaca) - природный символ Ульяновской области. Ульяновск : Поволжье, 2013. 213 с.
8. Seibold I., Helbig A. J., Meyburg B.-U. [et al.]. Genetic Differentiation and Molecular Phytogeny of European Aquila Eagles according to Cytochrome b Nucleotide Sequences // Eagle Studies. World Working Group on Birds of Prey (WWGBP). Berlin, London & Paris / eds.: B.-U. Meyburg, R. D. Chancellor. 1996. P. 1-15.
9. Корепов М. В., Стрюков С. А., Корепова Д. А. [и др.]. Генетическая дифференциация и полиморфизм поволжской популяции орла-могильника (Aquila heliaca, Fal-coniformes, Accipitridae) по данным анализа митохондриальной ДНК // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. 2017. № 3. С. 3-15. doi:10.21685/2307-9150-2017-3-1
10. Симаков М. Д., Корепов М. В., Стрюков С. А. [и др.]. Новые данные к полиморфизму поволжской популяции орла-могильника (Aquila heliaca, Falconiformes, Accipitridae) по результатам анализа митохондриальной и микросателлитной ДНК // Russian Journal of Ecosystem Ecology. 2021. Vol. 6 (3). doi:10.21685/2500-0578-2021-3-2
11. Wink M., Elsayed A.-A., Gonzalez J., Olsen J. Phylogenetic relationships in the Bonelli's eagle (Hieraaetus fasciatus) species complex based on nucleotide sequences of mitochondrial and nuclear marker genes. Heidelberg, Baden-Wuerttemberg, Germany, 2016.
12. Helbig A. J., Kocum A., Seibold I., Braun M. J. A multi-gene phylogeny of aquiline eagles (Aves: Accipitriformes) reveals extensive paraphyly at the genus level // Mol. Phylogenet. Evol. 2005. Vol. 35 (1). P. 147-164.
13. Lerner H. R., Mindell D. P. Phylogeny of eagles, Old World vultures, and other Accipitridae based on nuclear and mitochondrial DNA // Mol. Phylogenet. Evol. 2005. Vol. 37 (2). P. 327-346.
14. Zhou L., Dong Y. Complete mitochondrial genome of Aquila heliaca. Hefei, Anhui, China, 2017.
15. Vili N., Nemeshazi E., Kovacs S. [et al.]. Factors affecting DNA quality in feathers used for non-invasive sampling // Journal of Ornithology. 2013. Vol. 154. P. 587-595.
16. Arrigi F. E., Bergendahl G., Mandel M. Isolation and characterization of DNA from fixed cells and tissues // Exp. Cell. Res. 1968. № 50. P. 47-53.
17. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. URL: www.cshlpress.com
18. Hall T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucleic Acids Symposium Series. 1999. Vol. 41. P. 95-98.
19. BioEdit 7.2. URL: https://bioedit.software.informer.com
20. Multiple Sequence Alignment. URL: http://www.ebi.ac.uk/clustalw
21. Librado P., Rozas J. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data // Bioinformatics. 2009. Vol. 25. P. 1451, 1452.
22. Kumar S., Stecher G., Li M. [et al.]. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms // Molecular Biology and Evolution. 2018. Vol. 35. P. 1547-1549.
23. Leigh J. W., Bryant D., Nakagawa S. POPART: full feature software for haplotype network construction // Methods in Ecology and Evolution. 2015. Vol. 6 (9). P. 1110-1116. doi:10.1111/2041-210x.12410
24. Clement M., Posada D., Crandall K. A. TCS: a computer program to estimate gene genealogies // Molecular Ecology. 2000.Vol. 9 (10). P. 1657-1659. doi:10.1046/j.1365-294x.2000.01020.x
25. Бородин О. В., Смирнова С. Л., Свиридова Т. В. [и др.]. Современное состояние орла-могильника в Ульяновской области // Королевский орел: Распространение, состояние популяций и перспективы охраны орла-могильника (Aquila heliaca) в России : сб. науч. тр. М. : Союз охраны птиц России, 1999. С. 68-73.
References
1. Krasnaya kniga Penzenskoy oblasti: v 2 t. = The Red Book of Penza region: in 2 volumes. 2nd ed. Penza; Voronezh: Voronezhskaya oblastnaya tip. - Izd-vo im. E.A. Bol-khovitinova, 2019;2:264. (In Russ.)
2. Krasnaya kniga Respubliki Mordoviya: v 2 t. = The Red Book of the Republic of Mordovia: in 2 volumes. Saransk: Mordovskoe knizhnoe izd-vo, 2005;2:336. (In Russ.)
3. Krasnaya kniga Chuvashskoy Respubliki. T. 1. Ch. 2. Zhivotnye = The Red Book of the Chuvash Republic. Volume 1. Part 2. Animals. Cheboksary: IPK Chuvashiya, 2011:372. (In Russ.)
4. Krasnaya kniga Rossiyskoy Federatsii (zhivotnye) = The Red Book of the Russian Federation (animals). Moscow: Tovarishchestvo nauchnykh izdaniy KMK, 2008:855. (In Russ.)
5. Belik V.P., Galushin V.M. Population structure of the range of the Imperial Eagle in Northern Eurasia. Korolevskiy orel: Rasprostranenie, sostoyanie populyatsiy i perspek-tivy okhrany orla-mogil'nika (Aquila heliaca) v Rossii: sb. nauch. tr. = Royal Eagle: Distribution, population status and prospects for the conservation of the Eastern Imperial Eagle (Aquila heliaca) in Russia: collected papers. Moscow: Soyuz okhrany ptits Rossii, 1999:129-139. (In Russ.)
6. Korepov M.V. Distribution and abundance of the Eastern imperial eagle (Aquila heliaca, Falconiformes, Accipitridae) in the central part of the Volga Upland. Zoologicheskiy zhurnal = Zoological journal. 2012;91(2):190-201. (In Russ.)
7. Korepov M.V., Borodin O.V. Solnechnyy orel (Aquila heliaca) - prirodnyy simvol Ul'yanovskoy oblasti = The solar eagle (Aquila heliaca) is a natural symbol of the Ulyanovsk region. Ul'yanovsk: Povolzh'e, 2013:213. (In Russ.)
8. Seibold I., Helbig A.J., Meyburg B.-U. [et al.]. Genetic Differentiation and Molecular Phytogeny of European Aquila Eagles according to Cytochrome b Nucleotide Sequences. Eagle Studies. World Working Group on Birds of Prey (WWGBP). Berlin, London & Paris. 1996:1-15.
9. Korepov M.V., Stryukov S.A., Korepova D.A. [et al.]. Genetic differentiation and polymorphism of the Volga region population of the imperial eagle (Aquila heliaca, Falconiformes, Accipitridae) according to mitochondrial DNA analysis. Izvestiya vysshikh uchebnykh zavedeniy. Povolzhskiy region. Estestvennye nauki = University proceedings. Volga region. Natural sciences. 2017;(3):3-15. (In Russ.). doi:10.21685/2307-9150-2017-3-1
10. Simakov M.D., Korepov M.V., Stryukov S.A. [et al.]. New data on the polymorphism of the Volga region population of the imperial eagle (Aquila heliaca, Falconiformes, Accipitridae) based on the results of the analysis of mitochondrial and microsatellite DNA. Russian Journal of Ecosystem Ecology. 2021;6(3). (In Russ.). doi:10.21685/ 2500-0578-2021-3-2
11. Wink M., Elsayed A.-A., Gonzalez J., Olsen J. Phylogenetic relationships in the Bonelli's eagle (Hieraaetus fasciatus) species complex based on nucleotide sequences of mitochondrial and nuclear marker genes. Heidelberg, Baden-Wuerttemberg, Germany, 2016.
12. Helbig A.J., Kocum A., Seibold I., Braun M.J. A multi-gene phylogeny of aquiline eagles (Aves: Accipitriformes) reveals extensive paraphyly at the genus level. Mol. Phylogenet. Evol. 2005;35(1):147-164.
13. Lerner H.R., Mindell D.P. Phylogeny of eagles, Old World vultures, and other Accipi-tridae based on nuclear and mitochondrial DNA. Mol. Phylogenet. Evol. 2005;37(2): 327-346.
14. Zhou L., Dong Y. Complete mitochondrial genome of Aquila heliaca. Hefei, Anhui, China, 2017.
15. Vili N., Nemeshazi E., Kovacs S. [et al.]. Factors affecting DNA quality in feathers used for non-invasive sampling. Journal of Ornithology. 2013;154:587-595.
16. Arrigi F.E., Bergendahl G., Mandel M. Isolation and characterization of DNA from fixed cells and tissues. Exp. Cell. Res. 1968;(50):47-53.
17. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Available at: www.cshlpress.com
18. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 1999;41:95-98.
19. BioEdit 7.2. Available at: https://bioedit.software.informer.com
20. Multiple Sequence Alignment. Available at: http://www.ebi.ac.uk/clustalw
21. Librado P., Rozas J. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics. 2009;25:1451,1452.
22. Kumar S., Stecher G., Li M. [et al.]. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution. 2018;35: 1547-1549.
23. Leigh J.W., Bryant D., Nakagawa S. POPART: full feature software for haplotype network construction. Methods in Ecology and Evolution. 2015;6(9):1110-1116. doi:10.1111/2041-210x.12410
24. Clement M., Posada D., Crandall K.A. TCS: a computer program to estimate gene genealogies. Molecular Ecology. 2000;9(10):1657-1659. doi:10.1046/j.1365-294x.2000. 01020.x
25. Borodin O.V., Smirnova S.L., Sviridova T.V. [et al.]. The current state of the imperial eagle in the Ulyanovsk region. Korolevskiy orel: Rasprostranenie, sostoyanie popu-lyatsiy i perspektivy okhrany orla-mogil'nika (Aquila heliaca) v Rossii: sb. nauch. tr. = Royal Eagle: Distribution, population status and prospects for the conservation of the Imperial Eagle (Aquila heliaca) in Russia: collected papers. Moscow: Soyuz okhrany ptits Rossii, 1999:68-73. (In Russ.)
Информация об авторах / Information about the authors
Максим Дмитриевич Симаков Maxim D. Simakov
инженер-исследователь лаборатории Research engineer of the laboratory
молекулярной экологии и систематики of molecular ecology and systematics
животных, Пензенский государственный of animals, Penza State University
университет (Россия, г. Пенза, (40 Krasnaya street, Penza, Russia) ул. Красная, 40)
E-mail: maksimakov@bk.ru
Михаил Владимирович Корепов
кандидат биологических наук, доцент кафедры биологии и химии, Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова (Россия, г. Ульяновск, площадь Ленина, 4/5)
E-mail: korepov@list.ru
Mikhail V. Korepov
Candidate of biological sciences, associate professor of the sub-department of biology and chemistry, Ulyanovsk State Pedagogical University named after I.N. Ulyanov (4/5 Lenina square, Ulyanovsk, Russia)
Антон Алексеевич Кузьмин кандидат биологических наук, доцент кафедры биотехнологии и техносферной безопасности, Пензенский государственный технологический университет (Россия, г. Пенза, проезд Байдукова / ул. Гагарина, 1 А/11)
E-mail: kuzmin-puh@yandex.ru
Anton A. Kuzmin
Candidate of biological sciences, associate professor of the sub-department of biotechnology and technosphere security, Penza State Technological University (1A/11 Baidukova lane / Gagarina street, Penza, Russia)
Сергей Витальевич Титов
доктор биологических наук, профессор, декан факультета физико-математических и естественных наук, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40)
E-mail: svtitov@yandex.ru
Sergey V. Titov
Doctor of biological sciences, professor, dean of the faculty of physics, mathematics and natural sciences, Penza State University (40 Krasnaya street, Penza, Russia)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов / The authors declare no conflicts of interests.
Поступила в редакцию / Received 05.10.2021
Поступила после рецензирования и доработки / Revised 19.11.2021 Принята к публикации / Accepted 02.12.2021
