CC BY
21
УДК 575.174.015.3:582.475
Хвойные бореальной зоны. 2019. Т. XXXVII, № 1. С. 68-73
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОПУЛЯЦИЙ PICEA OBOVATA L.
В РЕГИОНАХ СИБИРИ
Е. А. Шилкина, А. А. Ибе, М. А. Шеллер, Т. В. Сухих
Центр защиты леса Красноярского края - филиал ФБУ «Российский центр защиты леса» Российская Федерация, 660036, Красноярск, Академгородок, 50а, корп. 2 E-mail: shilkinaea@rcfh.ru
Представлены результаты исследования генетического разнообразия ели сибирской, произрастающей в регионах Сибири. Установлено, что основная доля генетической изменчивости приходится на внутрипопуляци-онную изменчивость (93 %). Четко прослеживается распределение исследованных популяций на 2 основных кластера по генетическим дистанциям.
Ключевые слова: ель сибирская, генетическое разнообразие, дифференциация.
Conifers of the boreal area. 2019, Vol. XXXVII, No. 1, P. 68-73
GENETIC DIFFERENTIATION OF PICEA OBOVATA L. POPULATIONS IN THE REGIONS OF SIBERIA
E. A. Shilkina, A. A. Ibe, M. A. Sheller, T. V. Sukhikh
Centre of Forest Health of Krasnoyarsk Krai - Branch of the FBI "Russian Center of Forest Health" 2 build., 50a, Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russian Federation E-mail: shilkinaea@rcfh.ru
The results of the genetic diversity study of Siberian spruce growing in the regions of Siberia are presented. It was revealed that major share of genetic variability accounts for intra-population variation (93%). The distribution of the studied populations into 2 main clusters at genetic distance is apparent.
Keywords: Siberian spruce, genetic diversity, differentiation.
ВВЕДЕНИЕ
Ель сибирская (Picea obovata Ledeb.) - один из доминантных видов темнохвойных лесов России. Её ареал простирается от севера Европейской части России до тихоокеанского побережья (Черепанов, 1995). Однако, несмотря на широкий ареал обитания и наличие исследований генетической изменчивости вида, многие вопросы о структуре, генетическом разнообразии, внутри- и межвидовой дифференциации P. obovata остаются открытыми. В настоящее время для исследования генетической изменчивости и пространственной подразделенности видов наиболее часто используются различные типы генетических маркеров [5; 6; 11]. Среди них широкое распространение получили микросателлитные локусы ДНК. Они представляют собой тандемные повторы коротких нуклеотид-ных мотивов, сравнительно равномерно рассеянных по геному. С их помощью можно получать данные о многолокусных генотипах индивидов, рассчитывать основные показатели внутривидовой изменчивости и описывать популяционные процессы [4; 8; 11; 12; 16].
Целью данной работы являлось получение данных по генетическому разнообразию, популяционной структуре и дифференциации ели сибирской, произ-
растающей в Сибири, с помощью микросателлитного анализа ядерной ДНК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектами исследования послужили выборки из 9 популяций ели сибирской, произрастающей в естественных насаждениях на территориях Красноярского края, Томской, Кемеровской, Иркутской областей и республики Тыва. Название выборок и их местоположение представлены в табл. 1, на рис. 1.
Объем популяционных выборок составил 32 дерева. Тотальная ДНК была выделена из 100-200 мг высушенной хвои. Выделение ДНК проводили по модифицированному СТАВ-методу [9].
Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с пятью парами микросателлитных праймеров - EATC1B02, EATC1B03, UAPgAG105, Pa 33, Pa 36. ПЦР ставили с применением коммерческого набора реактивов «ScreenMix» (ЗАО «Евроген», Россия). Амплификацию производили на термоцикле Т100 Thermal Cycler (производство BioRad). Характеристика отобранных для исследования микросателлитных локусов и условия ПЦР-амплификации приведены в табл. 2.
Таблица 1
Географическое расположение исследованных выборок ели сибирской
Название выборки Район расположения Географические координаты Лесорастительные зоны и их состав (Приказ Минприроды России от 18 августа 2014 года № 367)
Хор-Тагнанская Иркутская область, Заларин-ское лесничество 53,13 с. ш. 101,28 в. д. Южно-Сибирская горная зона, Алтае-Саянский горно-таежный район
Назимовская Красноярский край, Енисейское лесничество 59,66 с. ш. 90,80 в. д. Таежная зона, Западно-Сибирский южно-таежный равнинный район
Степная Красноярский край, Каратуз-ское лесничество 53,56 с. ш. 92,54 в. д. Южно-Сибирская горная зона, Алтае-Саянский горнотаежный район
Курагинская Красноярский край, Кура-гинское лесничество 53,80 с. ш. 93,86 в. д. Южно-Сибирская горная зона, Алтае-Саянский горнотаежный район
Ижморская Кемеровская область, Иж-морское лесничество 55,94 с. ш. 86,52 в. д. Таежная зона, Западно-Сибирский южно-таежный равнинный район
Аргат-Юльская Томская область, Улу-Юльское лесничество 57,83 с. ш. 86,09 в. д. Таежная зона, Западно-Сибирский южно-таежный равнинный район
Нибегская Томская область, Верхнекет-ское лесничество 58,28 с. ш. 84,74 в. д. Таежная зона, Западно-Сибирский средне-таежный равнинный район
Балгазинская Республика Тыва 50,91 с. ш. 95,01 в. д. Южно-Сибирская горная зона Алтае-Саянский горно-лесостепной район
Тоджинская Республика Тыва 52,33 с. ш. 95,97 в. д. Южно-Сибирская горная зона Алтае-Саянский горнотаежный район
Рис. 1. Карта-схема расположения исследуемых выборок Р. оЪога1а
Таблица 2
Характеристика микросателлитных локусов, отобранных для анализа генетической изменчивости ели сибирской
№ п/п Локус Мотив t, °C отжига Ожидаемые размеры ампликона, п. н. Число аллелей Литературный источник
1 EATC1B02 (ATC)7 (AT)3 57 197-215 5 Scotti ea, 2002; Экарт и др., 2014
2 EATC1E03 (CAT)4 CGT(CAT)8 57 134-209 5 Scotti ea, 2002
3 UAPgAG105 (AG) 11 53 161-171 5 Hodgetts ea, 2001; Rungis ea, 2004; Экарт и др., 2014
4 Pa 33 (CGG)n 62 107-119 2 Fluch ea, 2011
5 Pa 36 (CGG)n 62 185-197 4 Fluch ea, 2011
Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 6 % полиакриламидном геле с использованием трис-ЕБТА-боратного электродного буфера и окрашивали в растворе бромистого этидия. Визуализацию ПЦР-продуктов проводили в ультрафиолетовом свете с помощью системы гель-документирования. Анализ данных осуществляли с применением программы Vilber Lourmat Bio Capt v.12.5.0.0. Расчет показателей генетического разнообразия вели в программе GenAlEx6 [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе анализа электрофоретических спектров ам-пликонов пяти ядерных микросателлитных локусов в 9 выборках ели сибирской выявлено от 2-х до 8 ал-лельных вариантов. Все 5 проанализированных локу-сов оказались полиморфными. Примеры электрофо-реграмм, демонстрирующих изменчивость изучаемых микросателлитных локусов, представлены на рис. 2. Наибольшее аллельное разнообразие было установлено в локусах EATC1E03 и UAPgAG105. Наименее изменчивым оказался локус Pa 33, наследуемость которого определялась двумя аллельными вариантами. Среднее число аллелей на локус варьировало в выборках от 2,6 до 4,4, эффективное число аллелей - от 1,765 до 2,398, значения наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности от 0,344 до 0,525 и от 0,307 до 0,510 соответственно (табл. 3).
Средние значения этих показателей для изученных выборок составили: NA = 3,511; NE = 2,157; HO = 0,438; HE = 0,428. Наибольшее эффективное число аллелей на локус выявлено в Хор-Тагнанской выборке (2,398), наименьшее - в Тоджинской (1,765). В пяти исследованных выборках ели сибирской выявлен дефицит гетерозиготных генотипов.
Структура и степень генетической подразделенно-сти выборок ели сибирской были определены с помощью показателей F - статистик Райта [10]. Для каждого из 5 полиморфных локусов были рассчитаны коэффициенты инбридинга особи относительно попу-
ляции инбридинга особи относительно вида и инбридинга популяции относительно вида в целом Из данных, представленных в табл. 4, видно, что значение коэффициента Fis у локусов ЕАТС1В02, ЕАТС1Е03, UAPgAG105, Ра 33 являются отрицательными, что указывает на избыток гетерозиготных генотипов. У локуса Ра 36 значение данного показателя указывает на недостаток гетерозиготных генотипов. Анализ популяционной структуры с помощью индекса Fst показал, что на межпопуляционную генетическую изменчивость приходится 7 % выявленной в выборках изменчивости.
Оставшаяся изменчивость (93 %) представлена внутри выборок (табл. 4). Отмечено, что столь низкий уровень межпопуляционной дифференциации в целом характерен для хвойных [1; 2; 7].
Оценка генетических различий между изученными выборками была рассчитана по методу Нея (ЭМ [13]. Значение данного показателя в исследованных выборках варьирует от 0,014 до 0,143 (табл. 5). По данным Крутовского с соавторами [3], величина генетического расстояния между популяциями в целом для хвойных находится в пределах 0,008-0,013. Таким образом, полученные результаты говорят о высоком уровне генетической дифференциации исследованных выборок (рис. 3).
На основе генетических дистанций (Э) построена дендрограмма, отражающая генетические взаимоотношения между исследуемыми выборками ели сибирской (рис. 4). Согласно данной диаграмме, выборки распределены в два основных кластера. Первый кластер сформирован Аргат-Юльской и Нибегской выборками (Томская область), второй - всеми остальными, которые подразделяются на 3 группы. В первую группу входит Хор-Тагнанская выборка, произрастающая на территории Иркутской области, во вторую - выборки, расположенные на севере Красноярского края и Кемеровской области, в третью - выборки из Республики Тыва и южных районов Красноярского края.
Рис. 2. Электрофореграммы ядерных микросателлитных локусов Ра 36 и ЕАТС1Е03 у ели сибирской.
Цифрами 191, 197, 134, 137, 161 на электрофореграммах Ра 36 и ЕАТС1Е03 обозначены аллели амплифицированных
фрагментов ДНК; М - электрофоретический стандарт
Таблица 3
Показатели генетической изменчивости исследованных выборок ели сибирской
Выборка Но Не Е
Аргат-Юльская 3,000 1,949 0,394 0,365 0,065
Балгазинская 3,200 2,004 0,425 0,410 -0,047
Ижморская 3,800 2,306 0,438 0,450 0,002
Курагинская 4,400 2,310 0,481 0,490 0,007
Назимовская 3,200 2,280 0,500 0,462 -0,052
Нибегская 3,400 2,101 0,400 0,406 0,039
Степная 3,800 2,302 0,431 0,456 0,036
Тоджинская 2,600 1,765 0,344 0,307 -0,067
Хор-Тагнанская 4,200 2,398 0,525 0,510 -0,033
В среднем для всех изученных 3,511±0,257 2,157±0,156 0,438±0,039 0,428±0,036 -0,006±0,026
выборок
Примечание: NA - число аллелей на локус; NE - эффективное число аллелей на локус; Но - наблюдаемая гетерозигот-ность; НЕ - ожидаемая гетерозиготность; Е - индекс фиксации Райта, ± - стандартная ошибка.
Таблица 4
Значения показателей ^-статистик Райта
Локус Ев Еа р3т
ЕАТС1В02 -0,077 0,077 0,143
ЕАТС1Е03 -0,022 0,062 0,083
UAPgAG105 -0,039 -0,029 0,010
Ра 33 -0,040 -0,011 0,028
Ра 36 0,102 0,181 0,088
среднее -0,015±0,031 0,056±0,037 0,070±0,024
Таблица 5
Генетические расстояния М. Нея (ОМ) между изученными выборками ели сибирской
Выборка Назимовская Хор-Тагнанская Ижморская Аргат-Юльская Нибегская Балгазинская Тоджинская Степная Курагинская
Назимовская 0,000
Хор-Тагнанская 0,075 0,000
Ижморская 0,034 0,057 0,000
Аргат-Юльская 0,099 0,050 0,063 0,000
Нибегская 0,136 0,082 0,094 0,014 0,000
Балгазинская 0,026 0,051 0,028 0,086 0,114 0,000
Тоджинская 0,069 0,055 0,049 0,080 0,123 0,025 0,000
Степная 0,077 0,052 0,081 0,117 0,134 0,025 0,042 0,000
Курагинская 0,060 0,048 0,059 0,112 0,143 0,025 0,035 0,016 0,000
♦ Назимов ♦ Балгазинск: екая ► Ижморская
♦ Тоджин< ♦ Курагинская ♦ Степная ♦ Api ш-Юльская кая ♦ Нибегская ♦ Хор-Тагнанская
Координата 1
Рис. 3. Проекция популяций ели сибирской на плоскости двух координат (РСА-анализ) Назимовская -
Ижморская Хор-Тагнанская Балгазинская Степная Курагинская Тоджинская Аргат-Юльская Нибегская
0,00
0,02
0,04 0,06 0,08
генетическое расстояние
0,10
0,12
Рис. 4. Дендрограмма, построенная по генетическим расстояниям Нея [14] с использованием попарной невзвешенной кластеризации (БРОМА)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в результате исследования полиморфизма ДНК девяти выборок ели сибирской, произрастающих в Иркутской, Кемеровской, Томской областях, Красноярском крае и Республике Тыва, выявлено их генетическое разнообразие по пяти ядерным микросателлитным локусам и высокая степень генетической дифференциации. Основная доля выявленной генетической изменчивости приходится на внутрипопуляционную изменчивость (93 %). Четко прослеживается распределение исследованных выборок на 2 основных кластера по генетическим дистанциям. Отмечена значительная дифференциация выборок Томской области от всех остальных.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИИ СПИСОК
1. Гончаренко Г. Г. Генный поток в природных популяциях сосен (Палеарктика) // Лесоведение. 2002. № 4. С. 30-36.
2. Коршиков И. И., Пирко Я. В. Генетическая изменчивость и дифференциация болотных и суходольных популяций сосны горной (Pinus mugo Turra) в высокогорье Украинских Карпат // Генетика. 2002. Т. 38, № 9. С. 1235-1241.
3. Генетическая изменчивость сибирской кедровой сосны P. sibirica. Сообщение IV. Генетическое разнообразие и степень генетической дифференциации между популяциями / К. В. Крутовский, Д. В. Политов, Ю. П. Алтухов и др. // Генетика. 1989. Т. 25, № 11. С. 2009-2032.
4. Разработка микросателлитных маркеров лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) на основе полногеномного de novo секвенирования / Н. В. Ореш-кова, Ю. А. Путинцева, В. В. Шаров и др. // Генетика. 2017. Т. 53, № 11. С. 1278-1284.
5. Генетическая дифференциация популяций ели на северо-западе России по результатам маркирования микросателлитных локусов / Е. К. Потокина, Л. В. Орлова, М. С. Вишневская и др. // Генетика популяций и эволюция. 2012. Т. X, № 2. С. 40-49.
6. Применение различных типов генетических маркеров для оценки уровня внутривидовой дифференциации ели сибирской / А. К. Экарт, С. А. Семери-кова, В. Л. Семериков и др. // Сибирский лесной журнал. 2014. № 4. С. 84-91.
7. Дифференциация популяций ели сибирской (Picea obovata Ledeb.) на южном Урале / Ю. А. Янба-ев, З. Х. Шигапов, В. П. Путенихин и др. // Генетика. 1997. Т. 33, № 9. С. 1244-1249.
8. Morphological and molecular diversity among Italian populations of Quercus petraea (Fagaceae) / P. Bruschi, G. G. Vendramin, F. Bussotti et al. // Annals Botany. 2003. Vol. 91, № 6. P. 707-716.
9. A genetic linkage map for Pinus radiate based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers / M. E. Devey, J. C. Bell, D. N. Smith et al. // Theor. Appl. Genet. 1996. Vol. 92, № 6. Р. 673-679.
10. Guries R. P., Ledig F. T. Gene diversity and population structure in pitch pine (Pinus rigida Mill.) // Evolution. 1982. Vol. 36. P. 387-402.
11. Development of microsatellite markers for white spruce (Picea glauca) and related species / R. B. Hod-getts, M. A. Aleksiuk, A. Brown et al. // Theor. Appl. Genet. 2001. № 102. P. 1252-1258.
12. Genetic diversity within and among Pinus pinaster populations: comparison between AFLP and microsatellite markers / S. Mariette, D. Chagne, C. Lezier et al. // Heredity. 2001. № 86. Р. 469-479.
13. Nei M. Genetic distance between populations // Amer. Natur. 1972. Vol. 106. P. 283-291.
14. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. 1978. Vol. 89. P. 583-590.
15. GenAlEx V6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research / R. Pea-kall, P. E. Smouse // Molecular Ecology Notes. 2006. Vol. 6, № 1. P. 288-295.
16. Identification and characterization of microsatel-lites in Norway spruce (Picea abies K.) / A. Pfeiffer, A. M. Oli-vieri, M. Morgante // Genome. 1997. Vol. 40. P. 411-419.
REFERENCES
1. Goncharenko G. G. Gennyy potok v prirodnykh populyatsiyakh sosen (Palearktika) // Lesovedeniye. 2002, № 4, S. 30-36.
2. Korshikov I. I., Pirko Ya. V. Geneticheskaya izmenchivost' i differentsiatsiya bolotnykh i sukhodol'-nykh populyatsiy sosny gornoy (Pinus mugo Turra) v
vysokogor'ye Ukrainskikh Karpat // Genetika. 2002, T. 38, № 9, S. 1235-1241.
3. Geneticheskaya izmenchivost' sibirskoy kedrovoy sosny P. sibirica. Soobshcheniye IV. Geneticheskoye razno-obraziye i stepen' geneticheskoy differentsiatsii mezhdu populyatsiyami / K. V. Krutovskiy, D. V. Politov, Yu. P. Altukhov i dr. // Genetika. 1989, T. 25, № 11, S. 2009-2032.
4. Razrabotka mikrosatellitnykh markerov listvennitsy sibirskoy (Larix sibirica Ledeb.) na osnove polno-genomnogo de novo sekvenirovaniya / N. V. Oreshkova, Yu. A. Putintseva, V. V. Sharov i dr. // Genetika. 2017, T. 53, № 11, S. 1278-1284.
5. Geneticheskaya differentsiatsiya populyatsiy eli na severo-zapade Rossii po rezul'tatam markirovaniya mikrosatellitnykh lokusov / E. K. Potokina, L. V. Orlova, M. S. Vishnevskaya i dr. // Genetika populyatsiy i evolyutsiya. 2012, T. X, № 2, S. 40-49.
6. Primeneniye razlichnykh tipov geneticheskikh mar-kerov dlya otsenki urovnya vnutrividovoy differen-tsiatsii eli sibirskoy / A. K. Ekart, S. A. Semerikova, V. L. Seme-rikov i dr. // Sibirskiy lesnoy zhurnal. 2014, № 4, S. 84-91.
7. Differentsiatsiya populyatsiy eli sibirskoy (Picea obovata Ledeb.) na yuzhnom Urale / Yu. A. Yanbayev, Z. Kh. Shigapov, V. P. Putenikhin i dr. // Genetika. 1997, T. 33, № 9, S. 1244-1249.
8. Morphological and molecular diversity among Italian populations of Quercus petraea (Fagaceae) / P. Bruschi, G. G. Vendramin, F. Bussotti et al. // Annals Botany. 2003, Vol. 91, № 6, P. 707-716.
9. A genetic linkage map for Pinus radiate based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers / M. E. Devey, J. C. Bell, D. N. Smith et al. // Theor. Appl. Genet. 1996, Vol. 92, № 6, R. 673-679.
10. Guries R. P., Ledig F. T. Gene diversity and population structure in pitsh pine (Pinus rigida Mill.) // Evolution. 1982, Vol. 36, P. 387-402.
11. Development of microsatellite markers for white spruce (Picea glauca) and related species / R. B. Hodgetts, M. A. Aleksiuk, A. Brown et al. // Theor. Appl. Genet. 2001, № 102, P. 1252-1258.
12. Genetic diversity within and among Pinus pinaster populations: comparison between AFLP and microsatellite markers / S. Mariette, D. Chagne, C. Lezier et al. // Heredity. 2001, № 86, R. 469-479.
13. Nei M. Genetic distance between populations // Amer. Natur. 1972, Vol. 106, P. 283-291.
14. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. 1978, Vol. 89, P. 583-590.
15. GenAlEx V6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research / R. Peakall, P. E. Smouse // Molecular Ecology Notes. 2006, Vol. 6, № 1, P. 288-295.
16. Identification and characterization of microsatel-lites in Norway spruce (Picea abies K.) / A. Pfeiffer, A. M. Oli-vieri, M. Morgante // Genome. 1997. Vol. 40. P. 411-419.
© Шилкина Е. А., Ибе А. А., Шеллер М. А., Сухих Т. В., 2019
Поступила в редакцию 11.01.2019 Принята к печати 08.02.2019
