CC BY
11УДК 636.5.082.12:575.113
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КУР ПО МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМ ЛОКУСАМ
НОВГОРОДОВА Инна Петровна, канд. биол. наук, ст. научн. сотрудник, ФГБНУ Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста, e-mail: novg-inna2005@yandex.ru
Сохранению генетического разнообразия сельскохозяйственных животных и птиц на сегодняшний день уделяют особое внимание. Обеднение генетического ресурса животноводства в мире может привести к потере ценного генетического материала. Молекулярно-генетические методы заняли решающее место в селекции и генетике как животноводства, так и птицеводства. Появилась возможность изучать популяционно-генетические параметры, проводить анализ происхождения кур, а также генетическую паспортизацию птиц с использованием микросателлитных маркеров (МС). Цель исследований заключалась в оценке уровня генетической дифференциации и филогенетических связей десяти пород кур (n=300): VEL (вельзумер), MEG (мегрула), ERK (ереванская красная), KIRGC (киргизская серая), RODA (род айланд), NEWH (нью гемпшир), BRK (брама куропатчатая), BRT (брама темная), BRS (брама светлая), BRP (брама палевая). Полиморфизм 16-ти микросателлитных локусов изучался на генетическом анализаторе ABI3130xl. Среднее число аллелей в зависимости от породы изменялось от 2-х до 16-ти (локус MCW0111 и MCW0183 у BRK). Частота встречаемости аллелей находилась в пределах от 1,7 до 81,7%. Число информативных аллелей варьировало от 3,56 у VEL до 6,44 у RODA. У 2-х пород из 10 уровень наблюдаемой гетерозигот-ности превышал 0,54. Анализ AMOVA показал, что 96% генетической изменчивости приходились на внутригрупповую изменчивость, в то время как 4% изменчивости составляли межгрупповые различия. Выявлено филогенетическое родство изучаемых пород птиц. Таким образом, проведенные исследования дают наиболее полные сведения о состоянии аллелофонда, генетическом разнообразии и дифференциации девяти пород кур. Полученные данные могут быть использованы при составлении генетических паспортов кур, а также будут полезными в работе, направленной на выявление взаимосвязи генов с хозяйственно-полезными признаками птиц.
Ключевые слова: куры, полиморфизм, микросателлитные маркеры, аллели, породы.
Работа была выполнена в рамках выполнения задания Федерального агентства научных организаций (ФАНО) № АААА-А18-118021590138-1 в 2018 году
Введение
Фенотипические и генотипические показатели имеют важное значение для характеристики генетических ресурсов животных и птиц, т.к. позволяют иметь представление о необходимой информации для эффективного сохранения генофонда. Социально-экономические, экологические проблемы, а также проблемы, связанные с различными заболеваниями, ростом населения и растущим интересом потребителей в продукции животноводства, могут нанести колоссальный вред - утерю чистопородных особей. В свое время селекционное разведение значительно сократило количество пород, доступных в птицеводстве. Куры являются самым распространенным видом домашних птиц, используемых в сельском хозяйстве, т.к. играют существенную роль в обеспечении питания людей высококачественным белком.
В последнее время было проведено много исследований, направленных на изучение характеристики генетического разнообразия кур [1-4]. Ученые предположили, что более точные методы оценки могут быть получены путем геномного отбора при использовании геномной информации с применением большого числа молекулярных маркеров. Знания, полученные в области молекулярной генетики применительно к животноводству, открыли новые возможности для повышения эффективности также и на сельскохозяйственной птице [5]. Молекулярные маркеры, такие как полиморфизм длин рестрикционного фрагмента (RFLP), случайная амплификация полиморфной ДНК ^АРР), минисателлиты и микросателлиты,
являются мощным инструментом для оценки генетической зависимости между популяциями животных и внутри них [6-7].
Микросателлитные маркеры являются наиболее предпочтительными маркерами для оценки генетической изменчивости вследствие того, что они являются многочисленными, беспорядочно распределены в геноме, высоко полиморфны и обладают кодоминантным наследованием, а также низкой скоростью мутации в разных генах [8-9]. Молекулярные исследования позволяют получать дополнительную информацию о фенотипических данных птиц, а также создавать комплексную программу оценки и сохранения чистопородных особей [10-11]. В птицеводстве были успешно использованы разные системы генетических маркеров изменчивости. Определение гетерозиготности и генетических расстояний на основе микросателлитных маркеров считается наиболее удобным методом еще и за счет того, что у кур достаточно много микросателлитных локусов [12].
Применение микросателлитных маркеров стало стандартным методом оценки молекулярной генетики и картирования хромосом курицы. Оценка генетической изменчивости и генетического разнообразия различных пород кур с использованием современных молекулярных методов является очень важным как для программ сохранения, так и для генетического улучшения. Генетическая карта кур содержит более 1900 локусов, из которых около 800 являются высокополиморфными микросателлитными маркерами. Стоит также отметить, что информация о последовательности
© Новгородова И. П., 2018 г
генома кур с более чем 2,8 млн однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) открыла большие возможности как для понимания их биологии, так и идентификации количественных признаков продуктивности (QTL).
Интерес к генетическим маркерам, применяемым для оценки различий кур, возрос и вследствие изучения количественных признаков продуктивности (QTL). Поэтому микросателлитные маркеры идентифицируются как надежные и эффективные маркеры птиц [13,14].
Цель настоящего исследования заключалась в оценке уровня генетической дифференциации и филогенетических связей среди изучаемых пород кур с использованием молекулярных маркеров.
Объекты и методы
Работа была проведена на базе лаборатории молекулярных основ селекции отдела биотехнологии и молекулярной диагностики животных ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. Л. К. Эрнста в 2016-2017 гг. Эксперимент был выполнен на 300 головах кур 10 пород: VEL (вельзумер, n=30), MEG (мегрула, n=30), ERK (ереванская красная, n=30), KIRGC (киргизская серая, n=30), RODA (род айланд, n=30), NEWH (нью гемпшир, n=30), BRK (брама куропатчатая, n=30), BRT (брама темная, n=30), BRS (брама светлая, n=30), BRP (брама палевая, n=30).
Материалом для исследований служили образцы пера (пульпа) кур, предоставленных генофонд-ным стадом ВНИТИП. Геномная ДНК была выделена с помощью наборов «ДНК-Экстран2» (ЗАО «Синтол», Россия) согласно протоколу производителя. В качестве ДНК-маркеров была использована мультиплексная панель из 16 микросател-литных локусов (MCW0111, MCW0067, LEI0094, MCW0123, MCW0081, MCW0069, MCW0104, MCW0183, MCW0295, ADL0112, MCW0037, MCW0034, ADL0268, MCW0222, MCW0014 и LEI0074). Данная панель рекомендована Международным обществом по генетике животных (ISAG) для проведения популяционно-генетических исследований кур. ПЦР-амплификация осуществлялась на термоциклере Eppendorf Mastercycler AG 22331 («Eppendorf», Германия). Вариабельность микросателлитов изучали с помощью генетического анализатора ABI3130xl Genetic Analyzer («Applied Biosystems», Life technologies, США).
Экспериментальная часть
Исходные данные о длине аллелей были получены в программном обеспечении Gene Mapper v. 4 («Applied Biosystems», «Life technologies», США). Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе GenAlEx 6.503 [15], с помощью которой были рассчитаны такие показатели, как среднее число аллелей на локус (Na), эффективное число аллелей (Ne), число информативных аллелей или аллелей с частотой встречаемости более 5 % (Na > 5%), ожидаемая (He) и наблюдаемая (Ho) гетерозиготность, коэффициент инбридинга (FlS). С целью установления источника изменчивости между группами кур проводили анализ молекулярной дисперсии (AMOVA).
Степень генетической дифференциации между породами кур оценивали по показателю FST и значениям генетических дистанций по М. Нею (DN) [6] при парном сравнении. Значения FST представ-
лены посредством анализа главных координат (Principal Coordinates Analysis, PCoA) в программе GenAlEx 6.503. Генетические связи между изучаемыми популяциями были визуализированы с помощью сетей Neighbour Net на основе матрицы генетических дистанций DN в программе SplitsTree 4.14.5 [16].
Результаты и выводы
Общее количество идентифицируемых аллелей у 10 исследуемых пород кур по 16 микроса-теллитным локусам составило 122. Наименьшим числом аллелей на локус характеризовалась порода кур BRK (2 аллеля, локус MCW0111), в то же время и наибольшее число аллелей отмечалось в этой же породе птиц (16 аллелей, MCW0183). Частота встречаемости аллелей находилась в пределах от 1,7 до 81,7%. Эффективное число аллелей (Ne) варьировало от 3,05±0,30 у кур породы MEG до 5,54±0,47 породы RODA. Максимальным генетическим разнообразием по среднему числу аллелей на локус (Na) характеризовались куры породы RODA, что составляло 8,75±0,62. Среднее число эффективных аллелей (Ne) является критерием информативности генетической оценки породных групп. Стоит отметить тот факт, что среднее число информативных аллелей (Na>5%) было наибольшим также у птиц RODA (6,44±0,38) (рис. 1). Наименьшим генетическим разнообразием характеризовались птицы породы MEG, среднее число аллелей, а также число эффективных и информативных аллелей составило соответственно 6,06±0,44; 3,05±0,30 и 3,56±0,33. В среднем по породным группам значение Na составило 7,37 ±0,51.
Для оценки изменчивости пород с учетом уровня аллельного разнообразия определяли уровни фактической Но и ожидаемой гетерозиготности Не, рассчитанные по 16 микросателлитным маркерам. Анализ параметров генетического разнообразия, представленный на рисунке 1, указывает на то, что у всех пород кур, за исключением VEL и MEG, уровень наблюдаемой гетерозиготности (Но) был ниже 0,4. Минимальное значение этого показателя было отмечено в группе птиц ERK (Но=0,23). Максимальное значение было выявлено у кур MEG (Но=0,58). Параметры ожидаемой гетерозиготности (Не) колебались в пределах от 0,62 (птицы MEG) до 0,793 (птицы RODA). Высокое генетическое разнообразие исследуемых пород было выявлено в ходе анализа микросателлитных профилей птиц, который позволил определить специфические (приватные) аллели во всех популяциях. Наличие приватных аллелей, т.е. аллелей, встречающихся только в одной из исследуемых пород, рассматривается в качестве одного из критериев характеристики уникальности популяций и отсутствия интенсивного обмена генами между этой и другими сравниваемыми породами. Следует отметить, что количество приватных аллелей изменялось от 1 (локус MCW0014 у кур RODA с частотой встречаемости 6,7% и локус MCW0104 у кур VEL - 10,0%) до 6 (локусы MCW0081, MCW0183, MCW0034, MCW0222 - по 1,7%, MCW0067 - 6,7%, и LEI0074 - 20,0% у кур MEG). В нашем исследовании не встречалось специфичных аллелей в локусе MCW0037 и MCW0111 ни в одной из иссле-
дуемых пород. Приватные аллели используются высокой частотой у одних пород и редко или со-для паспортизации пород, т.к. они встречаются с всем отсутствуют в других породах.
9
8 7 6
5 IS 4 3 2 1 0
£Na ■ Ne В Na>5% ■ Ho ■ He 8Fis
№ - среднее число аллелей, № - число эффективных аллелей, №>5% - число
информативных аллелей, Но - наблюдаемая гетерозиготность, Не - ожидаемая гетерозиготность, FIS - индекс фиксации Рис. 1 - Показатели информативности исследуемых пород кур
Генетическая принадлежность птиц к соответствующей породе была рассчитана на основании анализа 16 микросателлитных маркеров и была показана вероятность идентификации породной принадлежности особей при условии независимого наследования микросателлитов. Отмечена высокая консолидированность кур в пределах от 63,3 у BRK, BRT и BRC до 100,0% у VEL и MEG. Среднее значение идентичности особей в породных группах составило 81,7%.
У исследуемых пород кур при рассмотрении значений индекса фиксации не было отмечено критических отклонений от генетического равновесия Харди-Вайнберга у птиц MEG (6,5%) и VEL (14,1%). У остальных исследуемых породных групп индекс фиксации варьировал от 51,3 до 68,5%.
Анализ молекулярной дисперсии показал, что
96% генетической изменчивости приходилось на внутригрупповую изменчивость, в то время как 4% изменчивости составляли межгрупповые различия (р<0,01).
В таблице представлены параметры, характеризующие степень дифференциации между изучаемыми породами кур и рассчитанные для каждой пары групп (генетическая дистанция Нея и значения Fst). Согласно классификации, предложенной D. L. Hartl и A. G. Clark [17], значения Fst менее 0,05 свидетельствуют о незначительной, от 0,05-0,15 - об умеренной, 0,15-0,25 - о значительной генетической дифференциации. Большинство значений Fst между изучаемыми выборками пород кур характеризовали значительную (от 0,150 до 0,196) или умеренную (от 0,069 до 0,150) генетическую дифференциацию.
Таблица - Генетическая дифференциация изучаемых пород кур
VEL MEG ERK KIRGC RODA NEWH BRK BRT BRS BRP
VEL 0,000 0,588 0,366 0,419 0,893 0,908 0,799 0,306 0,812 0,478
MEG 0,096 0,000 0,633 0,664 0,645 1,420 0,530 0,618 0,939 0,837
ERK 0,118 0,122 0,000 0,769 0,659 0,978 0,844 0,635 0,765 0,883
KIRGC 0,125 0,133 0,048 0,000 0,712 0,901 0,622 1,005 1,063 0,702
RODA 0,098 0,114 0,075 0,092 0,000 0,637 0,541 0,750 1,443 1,027
NEWH 0,144 0,150 0,088 0,079 0,109 0,000 0,651 0,640 1,044 1,127
BRK 0,170 0,196 0,136 0,130 0,152 0,139 0,000 0,637 1,026 1,158
BRT 0,163 0,160 0,107 0,098 0,121 0,105 0,092 0,000 0,954 0,958
BRS 0,134 0,141 0,085 0,077 0,103 0,095 0,117 0,069 0,000 0,942
BRP 0,122 0,127 0,075 0,078 0,074 0,091 0,116 0,091 0,076 0,000
На графике Neighbour Net (рис. 2) продемонстрированы генетические взаимосвязи изучаемых пород кур. Следует отметить, что птицы пород брама (BRK, BRT, BRS и BRP) выделяются в отдельный кластер. Птицы породы VEL и MEG
формируют две отдельные длинные ветви, это говорит об их генетической обособленности от других пород. Куры пород NEWH, KIRGC, ERK и ROD образуют обособленный кластер.
Рис. 2 - Генетические взаимосвязи изучаемых пород кур на основе матрицы генетических дистанций Нея [18]
Генетическая принадлежность птиц к соответствующей породе была рассчитана на основании анализа 16 микросателлитных локусов, показана вероятность идентификации породной принадлежности особей при условии независимого наследования микросателлитов. Высокая консоли-дированность кур была отмечена в пределах от 63,3 у BRK, BRT и BRC до 100,0% у VEL и MEG. Среднее значение идентичности особей в породных группах составило 81,7%.
Таким образом, в ходе наших исследований была дана оценка генетической дифференциации и генетической взаимосвязи 10 пород кур с использованием мультилокусной системы генетических маркеров. Полученные данные подтверждают актуальность применения микросателлитных маркеров для популяционно-генетических исследований кур. Эти данные могут быть использованы при составлении генетических паспортов изучаемых пород птиц.
Список литературы
1. Wilkinson, S. Characterization of the genetic diversity, structure and admixture of British chicken breeds / S. Wilkinson, P. Wiener, D. Teverson, C.S. Haley and Hocking P.M. // Animal Genetics, 2011. -№43. - S. 552-563.
2. Babar, M.E. Microsatellite marker based genetic diversity among four varieties of Pakistani Aseel Chicken / M.E. Babar, A. Nadeem, T. Hussain, A. Wajid, S.A. Shah, A. Iqbal, Z. Sarfraz and M. Akram //
Pakistan veterinary journal, 2012. - №32 (2). - S. 237-241.
3. Gruszczynska, J. and Michalska, E. Application of chicken microsatellite markers to molecular monitoring of the experimental population
of Japanese quail (Coturnix japonica) // Animal science papers and reports (ANIM SCI PAP REP), 2013. - №31 (1). - S. 73-84.
4. Mamizade, N. Evaluation of genetic diversity in Japanese and English White quail populations using microsatellite markers / N. Mamizade, M.A. Azari, S. Zerehdaran, A.R.K. Ahmadi and S. Naghavian // Poultry Science Journal. - 2013. - №1. - S. 46-54.
5. Toosi, A. Genomic selection in admixed and crossbred populations / A. Toosi, R.L. Fernando, J.C.M.J. Dekker // Journal Animal Sciences, 2010. -№88. - S. 32-46.
6. Aly, O.M. Molecular phenotypic analysis and efficiency of crossing on meat production in local chicken strains / O.M. Aly, M.M. Ahmed S.M. and S.M. Abdel-Rahman // Biotechnology Animal Husband, 2010. - №26. - S. 215-223.
7. Ibrahim, A.M. Genetic characterization of local chicken from Taif region in Saudi Arabia using RAPD markers / A.M. Ibrahim, A.M. Sabry, H.M.M. Mohamed, E.I. El Hallous and A.A. Mohamed A.A. // International Journal of Biosciences, 2015. - №6. - S. 142-148.
8. Rajkumar, U. Genomic Heterogeneity of Chicken Populations in India / U. Rajkumar, B.R. Gupta and R.A. Rajasekhara // Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2008. - №21(12). - S. 1710-1720.
9. Ramadan, G.S. Microsatellite Markers Assisted Selection for High Body Weight in Local Broiler Breeders / G.S. Ramadan, R.E. Moghaieb, A.A. EL-Ghamry, E.M. EL-Komy, F.S. Nassar, M.M. Ghaly and F.K.R. Stino // International Journal of Advanced Research, 2014. - №2(8). - S. 901-910.
10. Bianchi, M. A microsatellites-based survey on the genetic structure of two Italian local chicken
breeds / M. Bianchi, S. Ceccobelli, V. Landi, P. Di Lorenzo, E. Lasagna, M. Ciocchetti, E. §ahin, C. Mugnai, F. Panella and F.M. Sarti // Italian Journal of Animal Science (Ital J Anim Sci), 2011. - №10(39). -S. 205-211.
11. Leroy, G. Gene diversity, agroecological structure and introgression patterns among village chicken populations across North, West and Central Africa / G. Leroy, B.B. Kayang, I.A.K. Youssao, C.V. Yapi-Gnaoré, R. Osei-Amponsah, E. Loukou N'goran, J.-C. Fotsa, K. Benabdeljelil, B. Bed'hom, M. Tixier-Boichard and X. Rognon // BMC Genetics, 2012. -№13. - S. 34.
12. Rudresh, B.H. Microsatellite based genetic diversity study in indigenous chicken ecotypes of Karnataka / B.H. Rudresh, H.N.N. Murthy, M.R. Jayashankar, C.S. Nagaraj, A.M. Kotresh, S.M. Byregowda // Veterinary World. - 2015. - №8 (8). - S. 970-976. doi: 10.14202/vetworld.
13. Lenstra, J.A. Molecular tools and analytical approaches for the characterization of farm animal genetic diversity / J.A. Lenstra, L.F. Groeneveld, H.
Eding, J. Kantanen, J.L. Williams, P. Taberlet, E.L. Nicolazzi, J. Solkner, H. Simianer, E. Ciani, J.F. Garcia, M.W. Bruford, P. Ajmone-Marsan and S. Weigend S. // Animal Genetics, 2012. - №43. - S. 483-502.
14. Farrag, S.A. Genetic Variation Analysis of Sinai Chicken and Japanese Quail Populations Using Microsatellite DNA Markers / S.A. Farrag, M.E. Soltan and A.A. Enab // International Conference on Food and Agricultural Sciences, 2013. - №55. - S. 12-17. DOI: 10.7763/IPCBEE.
15. Dunin I. M., Dankvert A. G. (Red.). Directory of breeds and types of farm animals bred in the Russian Federation. Moscow: VNIIPLEM, 2013.
16. Huson D. H. Application of Phylogenetic Networks in Evolutionary Studies / D. H. Huson, D. Bryant // Molecular Biology and Evolution, 2006. - № 23(2). - S. 254-267.
17. Hartl D. L., Clark A. G. Principles of population genetics, United Kingdom: Sunderland, 1997.
18. Nei M. Genetic distance between populations // American Naturalist, 1972. - № 106. - S. 283-392.
GENETIC DIFFERENTIATION CHICKENS AT MICROSATELLITE LOCI
Novgorodova Inna P., candidate of biological Sciences, Senior Researcher, L.K. Ernst Federal Science Center for Animal Husbandry, e-mail: novg-inna2005@yandex.ru).
Today, special attention is paid to the preservation of genetic diversity of farm animals and birds. Depletion of livestock genetic resources in the world can lead to the loss of valuable genetic material. Molecular genetic techniques have become crucial in breeding and genetics, both in livestock and poultry. There is an opportunity to study population genetic parameters, to analyze the origin of chickens, as well as genetic certification of birds using microsatellite markers (MS). The purpose of the research was to assess the level of genetic differentiation and phylogenetic relationships of 10 breeds of chickens (n=300) (VEL (Welsummer), MEG (Megruli), ERK (Yerevan red), KIRGC (Kyrgyz gray), RODA (Rhode island), NEWH (New Hampshire), BRK (Brahma kuropatkina), BRT (Brahma dark), BRS (Brahma light), BRP (Brahma yellow). Polymorphism of 16 microsatellite loci was studied on the genetic analyzer ABI3130xl. The average number of alleles varied from 2 to 16 depending on the breed (locus MCW0111 and MCW0183 in BRC). The frequency of occurrence of alleles ranged from 1.7 to 81.7%. The number of informative alleles ranged from 3.56 in VEL to 6.44 in RODA. In 2 out of 10 breeds the level of observed heterozygosity exceeded 0.54. AMOVA analysis showed that 96% of genetic variability was due to intra-group variability, while 4% of variability was due to inter-group differences. The phylogenetic relationship of the studied bird species is revealed. Thus, the conducted researches give the most complete data on the condition of allelofond, genetic diversity and differentiation of nine breeds of hens. The obtained data can be used in the preparation of genetic passports of chickens, as well as will be useful in the work aimed at identifying the relationship of genes with economic and beneficial signs of birds.
Key words: chickens, polymorphism, microsatellite markers, alleles, breeds
УДК 632.98
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИНСЕКТИЦИДОВ ПРИ ХРАНЕНИИ ЗЕРНА
ПОЛОЖЕНЦЕВ Валерий Петрович, канд с.-х. наук, доцент кафедры агрономии и агротехноло-гий
ЛУПОВА Екатерина Ивановна, канд. биол. наук, доцент кафедры агрономии и агротехнологий, katya.lilu@mail.ru
ВИНОГРАДОВ Дмитрий Валериевич, д-р биол. наук, профессор, заведующий кафедрой агроно-© Положенцев В. П., Лупова Е. И., Виноградов Д. В., Морозова Н. И., Мысин С. П., 2018 г.
