CC BY
71
ПЧЕЛОВОДСТВО
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ И РАСПРОСТРАНЕНИЕ ВИРУСОВ
МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ APIS MELLIFERA L. НА ТЕРРИТОРИИ УДМУРТИИ
GENETIC DIFFERENTIATION OF HONEY BEE POPULATIONS IN UDMURTIA
УДК 638.145
А.Е. Калашников1, И.В. Масленников2, Л.М. Колбина2, И.Г.Удина1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Москва
2 ГНУ Удмуртский НИИСХ Россельхозакадемии
Kalashnikov A.E.1, Maslennikov I.V.2, Kolbina L.M.2, Udina I.G.1
1 N.I. Vavilov Institute of General Genetics RAS,
2 Udmurt Scientific Research Institute of Agriculture RAAS
Ключевые слова: митохондриальная ДНК, кубитальный индекс; породы пчел, медоносная пчела; Apis mellifera L., РНК-содержащие вирусы пчел, вирус деформации
крыла, Varroa destructor
Key words: mitochondrial DNA; cubital index; honey bee breed; purity of the breed; honey bee; Apis mellifera L.; RNA-containing viruses of honey bee; deformed wing virus; Varroa destructor
Аннотация
Представлены данные о генетической дифференциации популяций пчел среднерусской породы на территории Удмуртии по результатам анализа кубитального индекса крыла и вариабельности фрагмента мтДНК межген-ного локуса COI-COII. Также приведена информация о распространении РНК-содержащих вирусов пчел.
Summary
The purity of the Central Russian (dark forest honey bee) breed of honey bee Apis mellifera L. has estimated in Udmurtia region by analyses of wing cubital index and variability of the fragment of the mtDNA interlocus region COI-COII. The dissemination of RNA-containing viruses of honey bees in Udmurtia has evaluated.
Введение
Медоносная пчела Apis mellifera L. охарактеризована по морфологическим признакам и особенностям поведения [1]. Пчелы среднерусской породы A. m. mellifera широко распространены на территории России, в том числе на территории Удмуртии [2, 3] и Башкортостана [4]. Эти пчелы зимостойки, устойчивы к ряду заболеваний. Значение кубитального индекса (КИ) стандарта породы находится в пределах 0,60-0,65 [5].
В России, как и в Европе и Северной Америке, под воздействием антропогенного фактора произошла гибридизация A. m. mellifera с подвидами медоносной пчелы, распространенными в более южных широтах. Если в Европе произошла гибридизация подвида A. m. mellifera в основном с подвидами A. m. сar-nica и A. m. ligustica [6], то в России с подвидами A. m. carnica, A. m. ligui-stica и A. m. caucasica [2, 3, 4, 7]. Ин-трогрессия южных пород отрицательно влияет на приспособленность пчел к природным условиям, а также на иммунитет, в связи с чем повышается восприимчивость пчел к заражению эктопаразитами, увеличивается распространение ряда заболеваний пчел, в том числе вирусных [7].
Заражение пчел клещом V. destructor является предрасполагающим фактором для инфицирования пчел вирусами [8, 9, 10]. Клещ является резервуаром для вирусов пчел и способствует распространению вирусной инфекции [8, 9]. Из обнаруженных вирусов медоносной пчелы шесть вирусов вызывают тяжелые последствия при инфицировании вплоть до гибели пчелиных семей, среди них вирус деформации крыла (DWV), вирус острого (ABPV) и хронического паралича (CBPV), а также кашмирский вирус (KBV), вирус мешотчатого расплода (SBV) и вирус черных маточников (BQCV) [8].
Целью данной работы являлось описание дифференциации популяций пчел на территории Удмуртии
при помощи морфометрического анализа (по данным анализа кубитального индекса) (КИ), описание генетической дифференциации пчел при помощи анализа вариабельности межгенного локуса С0-1-С0-11 митохондриального генома пчелы (мтДНК), а также изучение распространения РНК-содержащих вирусов пчел.
Материалы и методы
В работе использованы пчелы среднерусской породы с территории Удмуртии. Для морфометрического анализа и изучения вариабельности мтДНК отобраны пробы пчел в следующих районах: д. Красный Яр (1UD_S) (N=11), д. Б. Уча (2UD_S) (N=24), д. Моторки (3UD_S) (N=23), г. Ижевск (4UD_S) (N=8), д. Ус (5UD_S) (N=7) (Воткинский и Мож-гинский, и Завьяловские районы). Образцы для изучения РНК-содержа-щих вирусов пчел собраны на пасеке, расположенной на 9 км Якшур-Бодь-инского тракта (Завьяловский район): всего собрано 90 пчел (из 30 семей, образцы которых в дальнейшем анализе объединены в пулы по 3 пчелы в каждом).
Рассмотрение породной принадлежности при помощи морфометри-
ческого анализа (КИ) проводили по методике, рекомендованной ГНУ НИИ пчеловодства РАСХН. Значение КИ рассчитывали в долях от единицы (по литературным данным иногда указывается обратная величина 1/КИ, либо КИ в %). [5].
Геномная ДНК выделялась при помощи набора Diatom DNA prep 400 (Изоген, Россия). Выделение РНК проводили с применением набора Trizol (Изоген, Россия). Так как генетический материал вируса представлен РНК, то на первом этапе анализа после выделения пула РНК проводили ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскриптазой) при помощи набора GenPack RT-PCR Core (Изоген, Россия) для получения кДНК с матрицы РНК. Полученная кДНК служит матрицей на последующих этапах ПЦР-анализа с помощью набора ScreenMix (Изоген, Россия). В реакции ПЦР мтДНК использовали праймеры CO-I/II [10]. В реакции ОТ-ПЦР применялись праймеры ABPV, BQCV, CBPV, DWV, KBV и SBV [8]. ПЦР мтДНК проводили при помощи набора ScreenMix (Евроген, Россия).
Определение типа породы (северный или южный тип) проводилось при помощи ПЦР анализа вариабельности межгенного локуса COI-
COII мтДНК пчел [2, 3, 4, 10]. Эта область мтДНК содержит элемент Р длиной 54 п.н. и вариабельное количество элементов Q, по которым и отличаются пчелы южных популяций от северных. Рассматриваемая область митохондриального генома расположена между 3' - областью гена COI и 5' - областью гена COI I. Известно, что в этой области у пчел южных пород содержится один элемент Q (длина 196 п.н.), а у пчел северных популяций два и более элемента Q.
Математическую и статистическую обработку результатов проводили при помощи программы Excel (Microsoft, США). Обработку фотографий проводили в программе Corel X13 (Corel, США).
Результаты и обсуждение
Среднее значение КИ для популяции является показателем гибридизации пород: для южных пород оно при гибридизации увеличивается в большую сторону от стандарта [5], предварительно свидетельствуя о гибридизации со среднерусской породой, а для среднерусской породы уменьшается в меньшую сторону, указывая на метизацию последней с южными породами [2, 3, 4, 10]. Однако необходимо учитывать, что среднее значение КИ является усредненным показателем и поэтому характеризует соответствие выборки породному стандарту по морфометрическим показателям в целом. Средние значения КИ пчел из удмуртских
популяций 14UD_S, 15UD_S,
16UD_S, 17UD_S и 18UD_S также были меньше стандарта породы на 17, 7, 7, 8 и 10% соответственно (табл. 1).
Результат анализа митохондриальной ДНК межгенного локуса С01/С011 представлен в Табл. 1.
Рассмотрим каждую выборку пчел одновременно с позиции морфометрического анализа(КИ)и молекулярно-генетического анализа вариабельности мтДНК, это позволяет наиболее точно охарактеризовать соответствие породе рассматриваемой выборки или выявить факт ее гибридного происхождения.
Для популяций пчел 1-5UDS средняя оценка КИ>0,55, что свидетельствует об их принадлежности к среднерусской породе по данным морфометрического анализа. Однако, по данным анализа вариабельности длины межгенного локуса С01—С011 не наблюдалось гибридизации с южными породами для выборок 2-4UDS, а для 1UDS и 5UDS отмечена гибридизация с южными породами. Интересно, что в одном образце выборки 2UDS отмечена гетероплазмия PQ/p3xQ (Табл. 1). Таким образом, можно констатировать факт гибридного происхождения части пчел в выборках 1UDS и 5UDS и отсутствие межпородной гибридизации пчел в выборках 2-4UDS.
Отмечено снижение среднего значения КИ на 5,25% и выявление ми-тотипа PQ, характерного для южных пород, что наблюдали ранее также
Таблица 1. Морфометрические показатели и частоты митотипов пчел
№ п/п № выбор- ки N КИ Довери- тельный интервал (P=0,05) CV КИ мин КИ макс Варианты митотипов
350PQ 546PQQ 546/796 PQQ/ P3xQ
14 1UD_S 11 0,499 ±0,037 0,125 0,409 0,600 0,1538 0,8462
15 2UD_S 24 0,557 ±0,040 0,178 0,318 0,750 0,9600 0,0400
16 3UD_S 23 0,557 ±0,030 0,132 0,429 0,722 1,0000
17 4UD_S 8 0,550 ±0,034 0,089 0,500 0,632 1,0000
18 5UD S 7 0,537 ±0,053 0,134 0,450 0,625 0,6000 0,4000
и для пчел из урбанизированных районов республики Башкортостан [4] со степенью гибридизации, достигающей 50%. Однако, как в удаленных районах Удмуртии с низкой плотностью населения (выборки 2UDS и 3UDS), так и в лесных районах Башкортостана (бурзятинская популяция, заповедник Шулган-Таш) [4], отмечена крайне высокая степень чисто-породности среднерусской пчелы (частота митотипа PQQ не менее
0,99), что выдвигает эти популяции на роль резервуара среднерусской породы, который надо сохранять.
Для изучения распространения РНК-содержащих вирусов в Удмуртии отобраны образцы биологического материала на пасеках, где погибло не менее 20% пчелиных семей, и не менее 37% поражены вароозом. Обнаружено, что наиболее распространенным является вирус деформации крыла (DWV) (7 случаев, 23,3%), который наиболее часто встречается в семьях пчел, пораженных V. destructor [8, 9]. С более низкой частотой выявляется вирус острого паралича пчел (ABPV) (4 случая, 13,3%) и мешотчатого расплода
(SBV) (4 случая, 13,3%). Количество пчел, у которых обнаружено одновременное присутствие не менее 2-х вирусов, составило 4 случая (13,3%), не менее 3-х вирусов - 1 случай (3,3%). Отмечена одновременная инфекция вирусами DWV и SBV, а также DWV и АВРУ
В работах О. Береней и Дж. Миранда с соавторами также выявлены инфекции одновременно вирусами DWV и APBV; DWV и ABPV и SBV; DWV и SBV и ABPV; DWV и ABPV и SBV и BQCV; DWV и ABPV и BQCV; DWV и SBV; DWV и BQCV; DWV и SBV и BQCV [8, 9]. Можно предположить, что смешанные вирусные инфекции могут вызывать гибель пчелиных семей и при определенных обстоятельствах приводить к коллапсу пчелиных семей.
Выводы
Таким образом, на основе результатов оценки принадлежности пчел к среднерусской породе одновременно при помощи морфометрического анализа и молекулярно-генетического анализа вариабельности
межгенного локуса С01-С011 мтДНК, нами выявлены чистопородные выборки пчел и выборки гибридного происхождения, а также охарактеризован уровень гибридизации с южными породами. Выявлены популяции пчел среднерусской породы, которые необходимо сохранять. Установлено, что в Удмуртии присутствует инфицирование пчел РНК-со-держащими вирусами, которые могут приводить к гибели пчел. Выявлены РНК-содержащие вирусы пчел: вирус деформации крыла, вирус острого паралича, мешотчатого расплода. В большинстве выборок наблюдается комбинированная инфекция, которая повышает риск гибели пчелиной семьи.
Работа выполнена в рамках реализации мероприятий 1.1-1.5 федеральной целевой программы “Научные и научно-педагогические кадры инновационной России” на 20092013 годы, соглашение № 8088 от 23 июля 2012 г. между Министерством образования и науки Российской Федерации и Российской академией наук и Федеральным государственным бюджетным учреждением науки Институтом общей генетики им.
H.И. Вавилова Российской Академии наук. Работа также поддержана грантом Всемирного Фонда защиты пчел (World Save Bee Fund e.V.) «Мониторинг эпидемиологической ситуации и оценка причин коллапса пчелиных семей в Удмуртской Республике» (соглашение о поддержке научных и научно-практических проектов № 01-ЦФ/Г).
Литература
I. Кузьмичев В.Е., Гришин О.С. Изучение корреляции морфологических и этологических признаков местной популяции медоносной пчелы // Известия калужского общества изучения природы:книга восьмая. Сборник научных трудов. 2008. КГПУ С.194-219.
2. Непейвода С.Н., Колбина Л.М., С.Л. Воробьева, Санникова Н.В., Масленников И.В., Ильясов Р.А., Ни-коленко А.Г. Анализ дифференциации популяции Apis mellifera в Удмуртии // Пчеловодство. 2011. №10. С.12-13.
3. Колбина Л.М., Непейвода С.Н., Воробьева С.Л., Санникова Н.А., Масленников И.В., Ильясов Р.А., Ни-коленко А.Г. Генетическая дифференциация популяции медоносной пчелы Apis mellifera L. В Удмуртской республике // Аграрная наука Северо-Востока. №6. 2011. С.46-48.
4. Никоноров Ю.М., Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Николенко А.Г., Вахитов В.А. Использование метода ПЦР для контроля чистопородности пчелосемей Apis mellifera mellifera L. в условиях Южного Урала // Генетика. 1998. Т.34. №11. С.1574-1577.
5. Бородачев А.В., Бурмистров А.н., Касьянов А.И., Кривцова Л.С., Кривцов Н.И., Лебедев В.И., Мартынов
А.Г., Соловьева Л.Ф., Харитонов Н.Н. Методы проведения научно-исследовательских работ в пчеловодстве // Рыбное, НИИП. 2002. С.1-154.
6. Guillemaud T., Ciosi M., Lombaert
E., Estoup A. Biological invasions in agricultural settings: Insights from evolutionary biology and population genetics // C. R. Biologies. 2011. V.334. P.237-246.
7. Кривцов Н.И., Горячева И.И., Удина И.Г., Бородачев А.В., Монахова М.А. Идентификация пород и популяций медоносной пчелы с использованием метода ПЦР // Сельскохозяйственная биология. 2010. № 6. С.26-29.
8. Berenyi O., Bakonyi N., Derakhshi-far I., Koglberger H., Nowotny N. Occurrence of six honey bee viruses in diseased Austrian apiaries // Appl Envir Microbiol. 2006. V.72. N.4. P.2414-2420.
9. Miranda J.R., Cordoni G., Budge G. The acute bee paralysis virus- Kashmir bee virus- Israeli acute paralysis virus complex // J Invertebr Pathol. 2010. V.103. N.1. P.30-47.
10. Удина И.Г., Кунижева С.С., Гришечкин А.Е., Калашников А.Е., Учаева В.С., Кривцов Н.И., Злобин
B.И Обнаружение вируса деформации крыла у медоносной пчелы Apis mellifera L. на пасеках в Московской области методом ОТ-ПЦР // Вопросы вирусологии. 2010, №5.
C.37-40.
