CC BY
12Вестник РГАТУ, 2022, т.14, № 2, с. 125-134 Vestnik RGATU, 2022, Vol.14, № 2, рр 125-134
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ НАУКИ
Научная статья
УДК 619:[591.11]:636.2
DOI: 10.36508/RSATU.2022.54.2.015
ГЕНЕРАЦИЯ АФК В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПОД ДЕЙСТВИЕМ «IN VIVO» И «IN VITRO» СВЕРХМАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ
Арина Сергеевна Федотова1 ' Галина Владимировна Манарская2, Светлана Вениаминовна Тарских3
ФГБОУ ВО «Красноярский государственный аграрный университет», г. Красноярск, Россия 2Институт вычислительного моделирования СО РАН, г. Красноярск, Россия МНЦ исследований экстремальных состояний организма, Федеральный исследовательский центр «(Красноярский научный центр СО РАН», г. Красноярск, Россия
ikrasfas@mail.ru
2mgv@icm.krasn.ru
3s.tarskikh@inbox.ru
Аннотация.
Проблема и цель. Цель исследования - сравнительная оценка активности генерации первичных и вторичных радикалов кислорода в венозной крови крупного рогатого скота при хроническом воздействии на организм поглощенной дозы 1,33 мГр/год и острого облучения венозной крови животных «<in vitro» в дозе 1,33 мГр.
Методология. Объект исследования: кинетика продукции активных форм кислорода в образцах периферической крови крупного рогатого скота. Работа проведена в 2019-2021 годах в хозяйствах и частных подворьях центральных районов Красноярского края. Исследования проведены в научно-исследовательском испытательном центре ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ и Красноярском научном центре СО РАН.
Результаты. На основании сравнительного анализа параметров хемилюминесцентной кинетики генерации кислородных радикалов (амплитуды максимальной активности, времени достижения максимумов хемилюминесцентной кинетики, суммарной продукции первичных и вторичных радикалов за 180 минут) и расчетного индекса активации выявлено близкое сходство кинетики продукции первичных и вторичных радикалов в периферической крови крупного рогатого скота при поглощенной дозе внешнего облучения 1,33 мГр/год и облучении крови «in vitro» в дозе 1,33мГр. В периферической крови развивается одинаковый эффект изменения образования свободных радикалов кислорода. Установлено, что индекс активации генерации вторичных радикалов при облучении «in vivo» и «in vitro» статистически равнозначен. Идентичное течение процесса образования АФК позволяет проводить экстраполяцию данных кинетики генерации АФК при облучении крови «in vitro» в малых дозах на кинетику образования АФК в крови животных при воздействии на них радиации в диапазоне малых доз.
Заключение. Выявленные тесные корреляционные зависимости между генерацией активных форм кислорода в периферической крови при облучении «in vivo» в дозе 1,33 мГр/год и облучением «invitro» в дозе 1,33 мГр дают право применять облучение образцов крови «in vitro» в качестве модели естественных процессов.
Ключевые слова: АФК, периферическая кровь, свободные радикалы, малые дозы, крупный рогатый скот
Для цитирования: Федотова А.С., Макарская Г.В., Тарских С.В. Генерация АФК в периферической крови крупного рогатого скота под действием «in vivo» и «in vitro» сверхмалых доз ионизирующе-
© Федотова А.С., Макарская Г.В., Тарских С.В., 2022 г.
U-
го излучения // Вестник Рязанского государственного агротехнологического университета имени П.А. Костычева. 2022.Т14, №2. Р 125-134 (in Russ.).https://doi.org/10.36508/RSATU.2022.54.2.015
Original article
ROS GENERATION IN PERIPHERAL CATTLE BLOOD UNDER «IN VIVO» AND «IN VITRO»
LOW DOSES IONIZING RADIATION
Arina S. Fedotova1, Galina V. Makarskaya2, Svetlana V. Tarskih3
FSEIHPE Krasnoyarsk State Agrarian University, Krasnoyarsk, Russia,
Senior Researcher of Environmental Monitoring technologies Department, Institute of Computational Modeling, Siberian Branch Academy of Science, Krasnoyarsk, Russia
institute of Extreme Conditions of the Body, Federal Research Centre «Krasnoyarsk Science Centre of the Siberian Branch of the Russian Academy of Science», Krasnoyarsk
ikrasfas@mail.ru
2mgv@icm.krasn.ru
3s.tarskikh@inbox.ru
Abstract.
Problem and purpose. The aim is comparative evaluation of primary and secondary oxygen generation in cattle peripheral blood under chronic exposure of the absorbed dose 1,33 mGr/year and acute venous blood radiation 1,33 mGr/year «in vitro».
Methods. The object of study is the kinetics of generation of reactive oxygen forms in cattle peripheral blood samples. The study was held in 2019-2021in private farmsteads in central regions of Krasnoyarsk krai. The studies were carried out at the research and testing center of the Krasnoyarsk State Agrarian University and the Krasnoyarsk Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences. Results. On the basis of a comparative study of chemiluminescent kinetics of oxygen radicals generation (maximum activity amplitude, chemiluminescent kinetics peak time, total production of primary and secondary radicals in 180 minutes) and calculated activation index it has been established that there is a close similarity of the production kinetics of primary and secondary radicals in cattle peripheral blood under the absorbed dose 1,3 mGr/year of external radiation and blood radiation 1,33 mGr/year «in vitro». In peripheral blood there is the same effect of free oxygen radical formation alteration. It has been established that activation index of secondary radical generation under «in vivo» radiation equals to «in vitro» radiation. The identical process of ROS (reactive oxygen species) formation allows to hold extrapolation of the generation kinetics of ROS data under blood radiation «in vitro» in low doses to the generation kinetics of ROS in cattle blood under the impact of low doses radiation.
Conclusion.The identified close correlation between ROS generation in peripheral blood under 1,33 mGr/ year «in vivo» radiation and 1,33 mGr/year «in vitro» radiation allows to apply the radiation of blood samples «in vitro» as a model of natural processes.
Key words: ROS, peripheral blood, free radicals, low doses, cattle.
For citation: Fedotova A.S., Makarskaya G.V., Tarskikh S.V Generation of ROS in the peripheral blood of cattle under the influence of "in vivo" and "in vitro" ultra-low doses of ionizing radiation // Bulletin of the Ryazan State Agrotechnological University named after P.A. Kostychev. 2022.T14, No.2. With Р 125- 134 https://doi. org/ 10.36508/RSATU.2022.54.2.015
Введение
Изучение воздействия ионизирующих излучений на биологический объект является актуальным на протяжении более 100 лет. На заре становления науки радиобиологии учеными активно исследовалось воздействие ионизирующего излучения в дозах, способных вызвать патологические изменения в органах и тканях. В начале XX века советскими учеными были установлены поражающие дозы облучения, создана классификация лучевой болезни, выявлены закономерности обмена радиоактивных веществ в организме животных, разработаны средства и способы удаления радиоизотопов с шерстного покрова сельскохозяйственных животных, сформированы основы биологического действия радиоактивных излучений, описаны первичные процессы лучевого пораже-
ния высоких доз радиации. В последующее время создано представление о механизмах природной и модифицированной радиорезистентности, проведена разработка путей поиска эффективных радиозащитных препаратов, что имело колоссальное теоретическое и практическое значение для радиоэкологии.
Международное рассмотрение проблем радиобиологии в первый раз было осуществлено в 1955 г. на Женевской конференции по мирному использованию атомной энергии. К этому моменту общепланетарной проблемой явилось увеличение радиационного фона Земли. В связи с этим возникла необходимость изучения особенностей создавшейся радиационной обстановки, ее влияния на биосферу, изыскания мероприятий по обеспечению радиационной безопасности. Малые дозы
облучения воздействуют на значительную часть биосферы планеты с середины XX века, ученые все больше внимания уделяют вопросу воздействия малых доз облучения. Проблема воздействия низких доз радиации привлекает внимание медиков, радиоэкологов, ветеринарных врачей, радиобиологов. В настоящее время имеются разные взгляды ученых в оценке величины малых доз радиации по воздействию на биологический объект. Согласно данным третьей главы научного доклада «Краткое изложение проблемы воздействия радиации в малых дозах на состояние здоровья» научного Комитета Организации Объединённых Наций по действию атомной энергии, к малым дозам ионизирующего излучения относятся дозы: менее 200мГр для человека, меньше 500 мГр для млекопитающих; низкая дозовая мощность - 0,1 мГр/мин в среднем за один час для гамма и рентгеновских лучей [1].
Имеет место теория беспорогового воздействия ионизирующего излучения на биологический объект. Согласно теории при воздействии радиации в любой дозе увеличивается число злокачественных новообразований и генетических перестроек в организме. Часть ученых в своих исследованиях указывают на отсутствие влияния малых доз на го-меостаз животных. В некоторых работах есть данные об адаптации биоты в эволюционном процессе к действию малых доз радиации. Существует множество работ о стимулирующем действии на биологический объект ионизирующих излучений в значениях, принадлежащих диапазону малых доз. В 1980 г. Т.Д. Люкки предлагает понятие «радиационный гормезис» - процесс стимуляции и возникновения благоприятного эффекта при воздействии малых доз радиации. Радиационному гормезису посвящено множество работ [2].
При оценке малых доз радиации важно учитывать значение поглощенной дозы за единицу времени и пространственно-временное распределение ионизирующего излучения в биологическом объекте. При воздействии низких поглощенных доз в клетках и тканях организма одновременно с процессами повреждения идут восстановительные процессы, интенсивность этих процессов зависит от большого количества факторов, главным из которых является мощность поглощенной дозы. При хроническом облучении часть лучевых повреждений не восстанавливается, в результате происходит накопление патологических изменений в клетках, что приводит к изменению функций тканей и органов.
В настоящее время нет единого мнения о патогенезе малых доз ионизирующего излучения в клетках и тканях. Существует гипотеза, что при воздействии низких доз радиации дегенеративные процессы в клетках и тканях компенсируются ре-паративными, что закреплено в генотипе организма. Эта гипотеза может быть основой для определения границ воздействия низких поглощенных доз радиации на биологический объект.
В регионах с радиоактивным загрязнением территорий животные подвергаются хроническому комбинированному радиационному воздей-
ствию: внешнему и внутреннему облучению от поступающих в организм радионуклидов. Вопросам влияния радиации на гомеостаз организма, гематологические и биохимические показатели крови сельскохозяйственных и диких животных, обитающих на загрязненной территориях, посвящено достаточно много работ. Опасность низких поглощенных доз радиации можно оценить, рассчитав поглощенную дозу облучения. Однако оценить дозу облучения, воздействующую на организм, затруднительно, так как авторы приводят чаще всего плотность загрязнения техногенными радионуклидами или их удельную активность в объектах агробиоценозов [3, 4].
В настоящее время исследователи ведут работы по оценке влияния малых доз на состояние тканей, органов, систем организма. В исследованиях Александрова Ю.А. в 2017 г. по оценке влияния малых доз внешнего гамма-излучения на иммунологический статус организма овец определенно, что внешнее облучение овец в диапазоне 25-100 Р повышает уровень иммуноглобулинов класса 1дМ, снижает содержание антител класса ^ и 1дА. Автором выявлено стимулирующее действие двукратного гамма-облучения в дозе 90 Р и 100 Р на иммунобиологическую реактивность организма овец [5]. Александровым Ю. А. в 2016 году установлен эффект радиационного гормезиса у овец при облучении в дозе от 25 до 75 Р, но дозы 75-100 Р снижают количество лейкоцитов в периферической крови овец [6].
Шевченко Т.С. с соавторами оценивали влияние значительных доз внешнего гамма-облучения на клинические и гематологические показатели крови овец. При действии поглощенной дозы в 2-4 Гр у животных возникла лучевая болезнь легкой, средней степени тяжести, при этом авторами установлено снижение количества лимфоцитов на 30 % при дозе 4 Гр, на 15 % при дозе 2 Гр [7].
Алесиной М.Ю. с соавторами выявлено отсутствие влияния внешнего облучения в дозе 0,07 Гр/сут на популяцию В- лимфоцитов в периферической крови крыс. При внешнем гамма-облучении в дозе 0,12;0,2 и 0,3 Гр/сут в течение 30-130 сут. снижается популяция В-лимфоцитов, уменьшается количество 1дМ и увеличи-
вается содержание 1дА в сыворотке крови крыс [12]. Этой же работой определенно отсутствие количественных изменений гемоглобина, СОЭ, эритроцитов и лейкоцитов у норок двух- и трехлетнего возраста при внешнем облучения в дозе 0,16 мР/ч-0,1 мР/час. Авторами отмечено, что в венозной крови коров, содержащихся в хозяйствах на границе зоны Чернобыльской атомной электростанции, уменьшается на 25 % уровень гематокрита, количество гемоглобина, незначительно (на 1 %) снижается содержание лейкоцитов и эритроцитов, понижается на 4 % количество общего белка. В крови отдельных коров были обнаружены атипичные клетки, на фоне нейтро-пении была выявлена устойчивая эозинофилия и базофилия, во всех пробах периферической крови регистрировались юные нейтрофилы [8].
Аклеевым А.А. с соавторами изучена адгезив-
ная способность нейтрофилов крови человека при воздействии внешнего гамма-излучения «in vitro» в дозах: 0,1; 0,25; 1 и 4 Гр. В результате работы констатировано, что облучение «in vitro» уменьшает адгезивную способность нейтрофилов пропорционально поглощенной дозе, минимальная доза при этом составляет 0,25 Гр [9].
Нами ранее были проведены исследования по оценке активности генерации активных форм кислорода (АФК) в крови крупного рогатого скота при облучении «in vivo» и «in vitro» в дозе 1,5 мГр [10].
В оценке влияния поглощенных доз в значениях, принадлежащих диапазону малых доз ионизирующих излучений, нужны экспериментальные данные и создание теоретических основ о принципах действия низких поглощенных доз радиации на всех уровнях организации организма.
При воздействии любого вида ионизирующего излучения на организм млекопитающих одним из адаптационных механизмов являются структурно-функциональные изменения, которые определяют метаболический гомеостаз организма. К основным структурно-функциональным изменениям относят процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ). Процесс пОл является основой изменений структуры и функции мембран клеток в рамках физиологической нормы и воздействии стрессовых факторов. Возможность ответной реакций организма определяется его адаптацией. Неизменность процесса перекисного окисления липидов в организме животных при физиологической норме создается физико-химической системой нормализации процессов окисления и восстановления в липидах мембран клеток. У лабораторных мышей изучено изменение в липидах печени при воздействии низкоинтенсивного рентгеновского излучения в низких дозах, выявлена значительная чувствительность значений системы регуляции ПОЛ к действию радиации в малых дозах [14].
В работах установлена противоположная зависимость между значениями ПОЛ и значением поглощенной дозы, определена разная восприимчивость и возможность к восстановлению значений физико-химической системы нормализации ПОЛ после действия повреждающих факторов [11].
Процессы генерации АФК клетками организма являются чувствительными к воздействию даже слабых доз ионизирующего излучения [15,16]. Высокочувствительные хемилюминесцентные методы позволяют адекватно отражать состояние свободнорадикальных процессов, это дает возможность выявить их незначительные изменения при различных физиологических состояниях. В настоящее время хемилюминесцентные методы широко используются для мониторинга антиокси-дантных и прооксидантных свойств биологических систем. Хемилюминесцентным методом определены степень воздействия малых доз облучения на кинетику генерации свободных форм кислорода в периферической крови овец [17], трансгенерационное усиление продукции аФк клетками костного мозга белых крыс, обитающих в зоне отчуждения ЧАЭС. По хемилюминесцентной кинетике продук-
ции АФК клетками венозной крови КРС выявлено сходство изменения функциональной активности клеток при действии 1,5 мГр облучения «in vivo» и «in vitro»[10].
Цель работы - сравнительная оценка активности генерации первичных и вторичных радикалов кислорода в венозной крови крупного рогатого скота при хроническом воздействии на весь организм поглощенной дозы 1,33 мГр/год и острого облучения венозной крови животных «in vitro» в дозе 1,3 мГр.
Для реализации цели поставлены задачи: отбор проб периферической крови у животных, находящихся при воздействии поглощенной дозы 1,33 мГр/год, с последующим определением продукции АФК в крови (воздействие «in vivo»); отбор проб периферической крови у животных, находящихся под воздействием глобального техногенного фона с последующим ее облучением в дозе 1,33 мГр, (облучение «in vitro») и определение уровня и интенсивности продукции аФк. Определение корреляционной зависимости между показателями хе-милюминесценции в образцах «in vivo» и «in vitro».
Материалы и методы исследования
Работа проведена в 2019-2021 годах, материал для исследований - венозная кровь молочных коров, содержащихся на территории с повышенным радиационным гамма-фоном, обусловленным присутствием техногенных радионуклидов в объектах окружающей среды. В этих условиях животные получали облучение «in vivo», поглощенная доза составляла 1,33 мГр/год. Контрольные пробы были отобраны от коров, содержащихся под воздействием фонового (естественного облучения), характерного для Красноярского края (доза 0,93 мГр/год). Для исследования образцов крови, облученной «in vitro» в дозе 1,3 мГр, отбирались пробы у крупного рогатого скота, содержащегося под воздействием естественного облучения с последующим облучением на установке, укомплектованной источником Cs-137. Оценку кинетики генерации активных форм кислорода выполняли хемилюминесцентным методом по В.М. Земскову с соавторами [12] в варианте для крови КРС [13]. Хемилюминесцентный анализ выполнен на 36-ка-нальном аппаратурно-программном комплексе «Хемилюминометр 3604-ПЭВМ» (СКТБ «Наука», г. Красноярск СО РАН). В роли ХЛ-зондов использовали люцигенин и люминол. Исследовали хемилюминесцентную кинетику спонтанной продукции свободных кислородных радикалов клетками периферической крови и активированной in vitro частицами латекса, оценивая по параметрам: амплитуде максимальной активности (Imax, имп./с); времени достижения максимума (Tmax, мин); свето-сумме (S, имп. за 180 мин); индексу активации (ИА = S /S , усл. ед.). Время записи хемилюминес-
акт спонт' J n / I-
центной кривой составляло180 мин., температура в регистрационной камере +38о С. Статистическая обработка цифрового материала проведена методом вариационной статистики с помощью прикладных программ Microsoft Office Excel 2007. Различия параметров ХЛ считали достоверными
при Р < 0, 05. Корреляционную зависимость устанавливали для кинетических кривых методом Пирсона и непараметрическим методом с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена.
Результаты исследований и их обсуждение
Хемилюминесцентным методом установлен достоверно (Р<0,05) более короткий временной период формирования первого пика спонтанной генерации первичных люцигенинзависи-мых радикалов в пробах, облученных «in vitro» (рис. 1А). Время фиксации первого максимума спонтанной продукции первичных АФК клетками периферической крови при воздействии «in vivo» в дозе 1,33 мГр/год зарегистрировано на 24,83±2,02 мин, при облучении «in vitro» - на 16,33±2,03 мин. Время достижения второго максимума спонтанной хемилюминесценции «in vivo» и «in vitro» статистически не отличалось, Tmax(II) во всех пробах в среднем приходилось на 151±9,7 мин.
При антигенактивированной продукции люци-генинзависимых радикалов выявлено достоверное (Р<0,05) ускорение формирования первого пика первичных радикалов в пробах «in vitro».При воздействии «in vitro» время достижения первого максимума хемилюминесценции регистрировалось на 19,67±0,33 мин., при облучении «in vivo» на - 27,33±2,65 мин. Статистически не различимо время формирования второго пика ХЛ при
воздействии ионизирующего излучения «in vivo» и «in vitro», в среднем он регистрировался на 146,5±8,5 мин. Более короткое время образования первых пиков генерации люцигенинзависимых супероксидных радикалов при воздействии ионизирующего излучения на кровь «in vitro», очевидно, связано как с непосредственно ионизационным процессом, так и с активацией их ферментативного образования. При облучении «in vivo» воздействию меньших по мощности доз подвергается в целом весь многоклеточный сложно организованный организм и система крови в его составе.
Время образования пиков вторичных люминол-зависимых радикалов имело такую же тенденцию (рис. 1Б). При спонтанной генерации выявлено достоверное (Р<0,05) ускорение формирования Imax(I): при облучении «in vitro» - 14,33±4,3 мин, при воздействии «in vivo» - 23,73±1,9 мин. Статистически одинаково время формирования второго пика генерации вторичных радикалов в пробах «in vivo» и «in vitro» - 157,6±6,8 мин. При активации хемилюминесценции частицами латекса во всех пробах первый максимум регистрировался на 27,7±3,1 мин, второй - на 144,9±3,8 мин. Это свидетельствует об одинаковом течении процесса образования вторичных радикалов в периферической крови.
Рис. 1 - Хемилюминесцентная кинетика генерации первичных люцигенинзависимых (А) и вторичных люми-нолзависимых (Б) АФК клетками периферической крови коров при остром «in vitro» облучении крови в дозе
1,33 мГр и накопленной «in vivo» годовой дозе в 1,33 мГр/год (Chemiluminescent kinetics of generation of primary lucigenin-dependent (A) and secondary luminol-dependent (B) ROS by peripheral blood cells of cows during acute "in vitro" blood irradiation at a dose of 1.33 mGy and accumulated
"in vivo" annual dose of 1.33 mGy/year)
Амплитуда максимума (1тах(1),имп./с) спонтанной генерации первичных радикалов в крови при облучении «in vitro» была достоверно (Р<0,01) ниже, чем в контрольных пробах и пробах «in vivo» (Р<0,05) (рис. 2), что обуславливается резким увеличением активности супероксиддисмутазы в крови, сохраняющимся до 2-х суток после облучения [18]. При усилении фагоцитоза частицами латекса амплитуда максимумов (Imax, IImax имп./с) в пробах, облученных «in vitro», увеличивается, тогда как в пробах «in vivo» достоверно (Р < 0,05) снижается, что может быть связано с более высокой актив-
ностью всего комплекса антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, каталазы, глута-тионпероксидазы и общего глутатиона) [18] при фагоцитарной активности клеток в крови животных, находящихся в под воздействием повышенного радиационного уровня.
Величина амплитуды (1тах, имп./с) максимумов спонтанной и активированной продукции люцигенинзависимых АФК в пробах контроля принадлежит диапазону нормальных значений и отражает реакцию клеток крови на антигенное воздействие.
Рис. 2 - Значения амплитуды максимумов люцигенин усиленной хемилюминесцентной кинетики
генерации АФК клетками крови (Amplitude values of the maxima of lucigenin enhanced chemiluminescent kinetics of ROS generation by
blood cells)
При генерации вторичных радикалов (таб.1) амплитуда первого пика (1тах(1),имп./с) при спонтанной и активированной Хл реакции в пробах «in vitro» и «in vivo» статистически не отличается. Высота первых пиков генерации антигенак-тивированной хемилюминесценции достоверно ниже в пробах «in vivo» (Р < 0,05), в пробах «in vitro» (Р < 0,01) по сравнению с контролем.
В пробах «in vitro» и «in vivo» значение амплитуды второго пика (1тах(11),имп./с) спонтанной генерации находилось m одном диапазоне изменчивости, при этом значение высоты амплитуд было достоверно выше по отношению к контролю.
При введении частиц латекса возрастает высота вторых пиков (I (11),имп./с) генерации вторич-
ных радикалов; наиболее ярко это наблюдается в пробах контроля: высота пика при спонтанной ХЛ -268,7±61, при активированной ХЛ - 1726,3±173,8. Высота вторых пиков антигенактивированной ХЛ реакции достоверно ниже в пробах «in vivo» (Р < 0,01), в пробах «in vitro» (Р < 0,5) по сравнению с контролем. Отмечено, что в образцах, облученных «in vitro», наблюдается статистически значимое (Р < 0,01) увеличение амплитуды второго пика ХЛ кривой по сравнению с пробами «in vivo». Антиоксидантная система контроля в крови животных, пролонгировано облучающихся в малых дозах, более активна, что проявляется в сдерживании активности формирования второго максимума радикалообразования в их крови.
Таблица 1 - Значения амплитуды максимумов люминол усиленной хемилюминесцентной кинетики
генерации АФК клетками крови
Хемилюминесцентная реакция Проба I (1),имп./с max I (11),имп./с max
спонтанная Контроль 463,4±67,5 268,7±61
In vivo 570,3±97,2 457,2±88,9*
In vitro 363,5±19,2 478,3±78,9**
активированная Контроль 1474,6±171,5 1726,3±173,8
In vivo 769,7±156,9*** 855,6±224,6***
In vitro 932,3±189,6** 1403,7±30,3*
Примечание: * - Р < 0,1 ** - Р < 0,05, *** - Р < 0,01 по сравнению с контролем
В пробах «in vitro» спонтанно генерируется достоверно меньше (Р < 0,01) первичных радикалов, чем в контрольных пробах и пробах «in vivo» острое внешнее воздействие радиации в малых дозах приводит к снижению функциональной активности клеток крови. При введении частиц латекса в контрольных пробах достоверно увеличивается продукция первичных радикалов, в пробах «in vivo» достоверно снижается (Р < 0,05); суммарное количество сокращается на 30 % вслед за снижением активности первого максимума респираторного взрыва (рис. 1, 2). В пробах «in vitro»
не выявлено статистически значимого изменения количестве первичных радикалов в ответ на антигенную стимуляцию. При воздействии малых поглощенных доз в периферической крови образуется достоверно (Р < 0,01) меньше антиген активированных первичных радикалов по сравнению с пробами контроля, при этом в пробах «in vivo» и «in vitro»образуется статистически одинаковое количество АФК.
В пробах «in vitro» и «in vivo» спонтанно генерируется статистически одинаковое суммарное количество вторичных радикалов (рис 3). В про-
бах, подвергшихся воздействию малых доз облучения, спонтанно генерируется меньше АФК по сравнению с контролем, наиболее ярко этот процесс протекает в пробах «in vitro» (Р < 0,5). При активации фагоцитарной деятельности клеток периферической крови введением частиц латекса
и
□ кй чтрйль (сИйит ЧЛ; □ :П VI ™ {infli-: ХЛ)
□ кОяТрОЛ* ■ in vi Щ (4>ЛнЫ£11|
суммарная генерация АФК в каждой пробе возрастает. При этом суммарное количество вторичных люминолзависимых радикалов в крови, облученной «in vitro», достоверно (P < 0,05) выше его значения для крови животных, облученных «in vivo»
□ i n vilrO ((ПСШ- ХЛ)
□ i fWiWC (í ВТи(. ХЛ)
АффЯЕ^нин ЛнОммнфЛ
Рис. 3 - Светосумма хемилюминесценции первичных, вторичных радикалов кислорода при спонтанной и антигенактивированной генерации (Light sum of chemiluminescence of primary, secondary oxygen radicals during spontaneous
and antigen-activated generation)
По полученным данным рассчитан индекс активации (ИА), который отражает способность клеток крови (нейтрофилов, моноцитов) к увеличению генерации АФК в ответ на антигенную стимуляцию (табл. 2). Индекс активации при продукции люминолзависимых АФК в пробах крови при облучении «in vivo» и «in vitro» принадлежит одному диапазо-
ну изменчивости и статистически не различается. Аналогичное увеличение генерации первичных люцигенинзависимых АФК отмечалось только при облучении крови «in vitro». Для животных, получавших годовую дозу облучения в 1,3 мГр/год, характерно снижение индекса активации первичных люцигенинзависимых АФК.
Таблица 2 - Значения индекса активации кинетики образования АФК клетками крови
Вид АФК Вид облучения Индекс активации,усл. ед
Люцигенин зависимые Контроль 1,72 ± 0,17
In vivo 0,75 ± 0,07
In vitro 2,92 ± 1,19
Люминол зависимые Контроль 6,46 ± 1,02
In vivo 3,75 ± 1,13
In vitro 3,16 ± 0,71
Оценка корреляционной связи между кинетикой генерации АФК (по 181 точке в каждой) в контрольных и опытных пробах (табл. 3) выявила снижение уровня скоррелированности между контролем и опытом как в «in vivo», так и в «in vitro» вариантах в среднем на 0,2 единицы. При этом уровень корреляционной связи между кинетикой генерации АФК в крови при облучении «in vivo» и «in vitro» выше, чем с их собственными контролями. Исключение составляет достоверное отличие кинетики спонтанной генерации первичных люцигенинзависимых радикалов «in vivo» и « in vitro».
Между спонтанной, активированной генерацией вторичных радикалов и активированной про-
дукцией первичных радикалов в венозной крови коров при облучении «in vivo» в дозе 1,33 мГр/ год и облучением «in vitro» в дозе 1,33 мГр установлена высокая функциональная связь по шкале Чеддока; в результате расчета значение ранговой корреляции Спирмена установлена прямая высокая корреляционная зависимость (r - 0,91,0). Между спонтанной продукцией радикалов в венозной крови коров при облучении «in vivo» в дозе 1,3 мГр/год и облучением «in vitro» в дозе 1,3 мГр. выявлена умеренная (коэффициент ранговой корреляции Спирмена 0,5) прямая корреляционная связь.
Таблица 3 - Значения индекса корреляционной связи кинетики генерации АФК в крови коров из контрольной зоны (доза облучения 0,93 мГр/год), зоны с повышенным радиационным фоном (доза облучения 1,33 мГр/год), образцов крови коров контрольной зоны, облученных в дозе 1,33 мГр «in vitro»
in vivo in vitro
контроль опыт
люминол люцигенин люминол люцигенин
актив спонт актив спонт актив спонт актив спонт
лю- актив 0,845 0,601
_й л о ср 1- н ми-нол спонт 0,777 0,544
in vitro люци- актив 0,876 0,850
о генин спонт 0,838 0,492
лю- актив 0,649 0,698
ми-нол спонт 0,482 0,708
in vivo ь ы люци- актив 0,627 0,912
п о генин 0,796 0,268
Заключение
В результате работы констатировано, что кинетика продукции люцигенин- и люминолзависимых АФК в пробах венозной крови крупного рогатого скота при поглощенной дозе 1,33 мГр/год и облучении проб «in vitro» 1,33 мГр имеет близкое сходство. В периферической крови развивается одинаковый эффект изменения образования свободных радикалов кислорода. Идентичное течение процесса генерации вторичных люминолзависимых АФК и антигенактивированной генерации первичных люцигенинзависимых, аналогичное их количество, дает возможность выполнять экстраполирование значений суммарной продукции АФК при облучении крови «in vitro» в низких поглощенных дозах на кинетику образования АФК в крови животных при облучении в диапазоне малых доз. Существование корреляционной связи между продукцией активных форм кислорода в периферической крови при облучении «in vivo» в дозе 1,33 мГр/год и облучении «in vitro» в дозе 1,33 мГр позволяет использовать облучение проб периферической крови «in vitro» как модель естественных процессов.
Список источников
1. Ионизирующее излучение: источников и биологические эффекты: доклад на Генеральной Ассамблее ООН. - 2010. - Т1.- С 61- 63.
2. Чукова Ю.П. Радиационный гормезис: физический смысл и значимость для естествознания / Ю.П. Чукова //Ядерно-физические исследования и технологии в сельском хозяйстве: сборник докладов международной научно-практической конференции, Обнинск, 16-18 сентября 2020 г. Обнинск: ФГБНУ ВНИИРАЭ. - 2020.- С. 103-109.
3. Михеева Е.А. Влияние малых доз ионизирующего излучения на показатели крови крупного рогатого скота / Е.А. Михеева // Зоотехния - 2006. - № 7. - С. 24-26
4. Орлов Д.Ю. Изучение особенностей гематологических показателей новорожденных телят в условиях техногенного загрязнения /Д.Ю. Орлов // Биотика - 2015. - № 6(7). - С. 93-98.
5. Александров Ю. А. Влияние малых доз ионизирующих излучений на иммунологическую реактивность млекопитающих при многократных воздействиях / Ю.А. Александров // Вестник Марийского государственного университета - 2017. - Т. 3. - № 1 (9). - С. 7-12.
6. Александров Ю. А. Влияние малых доз коротковолновых электромагнитных излучений на продуктивные и гематологические показатели овец / Ю.А. Александров // Вестник Марийского государственного университета - 2016. Т. 2. № 2 (6) С. 7-9.
7. Шевченко Т.С. Влияние внешнего Y-облучения на общее содержание белка в лимфоцитах и тромбоцитах овец / Т.С. Шевченко // Сельскохозяйственная биология - 2013. - №4. - С 115-120.
8. Алесина М.Ю. Радиобиологические эффекты в различных органах и тканях животных в зоне радионуклидного загрязнения в результате аварии на ЧАЭС / М.Ю. Алесина, В.И. Рясенко, П.И. Рымаренко // ЧПКП «Прогресс» г. Киев, НПО «Припять» г. Чернобыль. г. Киев. - 1994. - С 6-16.
9. Аклеев А. А. Влияние радиационного воздействия на показатели адгезивной способности нейтрофилов периферической крови / А.А. Аклеев, А.Н. Гребенюк, О.А. Глуминина // Вестник Челябинского государственного университета. -2013. № 7 (298). - Биология. - Вып. 2. - С. 91-93.
10. Федотова А.С. Активные формы кислорода в периферической крови крупного рогатого скота при облучении «in vivo» и «in vitro» в дозе 1,5 мГр / А.С. Федотова, Г.В. Макарская, С.В. Тарских // Экологический мониторинг: методы и подходы: материалы Международной сателлитной конференции
«Экологический мониторинг: методы и подходы» и ХХ Международного симпозиума «Сложные системы в экстремальных условиях». Красноярск, 20-24 сентября 2021 г. - Электрон. дан. (4 Mb). -Красноярск : Сиб. федер. ун-т. - 2021. - С 230-232.
11. Шишкина Л.Н. Формирование биологических последствий воздействия ионизирующего излучения в малых дозах на организм / Л.Н. Шишкина, М.А. Климович, М.В. Козлов // Материалы Международной конференции (Сыктывкар, Республика Коми, Россия, 17-21 марта 2014 г.). Сыктывкар. - 2014. - С. 270-274.
12. Земсков В.М. Изучение функционального состояния фагоцитов человека (кислородный метаболизм и подвижность клеток): Методические рекомендации / В.М. Земсков, А.А. Барсуков // М.: Институт иммунологии МЗ СССР - 1988.- 20 с.
13. Еремина И.Ю., Макарская Г.В., Тарских С.В. Возрастные особенности кислородного метаболизма клеток крови крупного рогатого скота / И.Ю. Еремина, Г.В. Макарская, С.В. Тарских //Вестник КрасГАУ - 2010. - вып. 11. - С.128-135.
14. Klimovich M.A. Sensitive Indices of the Murine Liver Lipids to the Action of Low Intensity X-Ray Radiation at Low Doses / M.A. Klimovich, M.V. Kozlov,
L.N. Shishkina // New Steps in Physical Chemistry, Chemical Physics and Biochemical Physics. N.-Y.: Nova Science Publishers. - 2013. - Chapter 27. - C. 239-263.
15. Alesina M.U. The formation of radio biological effects under chronic internal and external radiation in low doses of experimental animals /M.U. Alesina // International magazine of radiation medicine. - 1999. - T. 2. - C. 92-99.
16. Vladimirov Yu.A. Free radicals and cell chemiluminiscence / Yu.A. Vladimirov, E.V. Proskurnina Vladimirov U.A., Proscurnina E.V. // Biochemistry (Moscow). - 2009. - T. 74. - № 13. - C. 1545-1566.
17. Fedotova A.S. An impact of low doses radiation on the kinetics of reactive oxygen species generation in sheep peripheral blood / A.S. Fedotova, G.V. Makarskaya, S.V. Tarskikh, E.G. Turitcyna, V.A. Kolesnikov // lOPConf. Ser.: EarthEnviron. Sci. -2020. - 412:052016
18. Kataoka T. Study of antioxidative effects and anti-inflammatory effects in mice due to low-dose X-irradiation or radon inhalation /T. Kataoka // Journal of Radiation Research. - 2013. - T.54. - S.587-596.
Вклад авторов:
Все авторы внесли эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
References
1. loniziruyushchee izluchenie: istochnikov i biologicheskie effekty: doklad na General'noj Assamblee OON.
- 2010. - T1.- S 61-62
2. Chukova Yu.P. Radiacionnyjgormezis: fizicheskij smysl iznachimost'dlya estestvoznaniya/Yu.P. Chukova // YAderno-fizicheskie issledovaniya i tekhnologii v sel'skom hozyajstve: sbornik dokladov mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii, Obninsk, 16-18 sentyabrya 2020 g. Obninsk: FGBNU VNIIRAE. - 2020.
- S. 103-109.
3. Miheeva E.A. Vliyanie malyh doz ioniziruyushchego izlucheniya na pokazateli krovi krupnogo rogatogo skota / E.A. Miheeva //Zootekhniya - 2006. - № 7. - S. 24-26
4. Orlov D.YU. Izuchenie osobennostej gematologicheskih pokazatelej novorozhdennyh telyat v usloviyah tekhnogennogo zagryazneniya/D.YU. Orlov//Biotika - 2015. - № 6(7). - S. 93-98.
5. Aleksandrov YU. A. Vliyanie malyh doz ioniziruyushchih izluchenij na immunologicheskuyu reaktivnost' mlekopitayushchih pri mnogokratnyh vozdejstviyah / Yu.A. Aleksandrov// Vestnik Marijskogo gosudarstvennogo universiteta - 2017. - T. 3. - № 1 (9). - S. 7-12.
6. Aleksandrov YU. A. Vliyanie malyh doz korotkovolnovyh elektromagnitnyh izluchenij na produktivnye i gematologicheskie pokazateli ovec / Yu. A. Aleksandrov //Vestnik Marijskogo gosudarstvennogo universiteta
- 2016. - T. 2. - № 2 (6). - S. 7-9
7. Shevchenko T.S. Vliyanie vneshnego Y-oblucheniya na obshchee soderzhanie belka v limfocitah i trombocitah ovec. /T.S. Shevchenko //Sel'skohozyajstvennaya biologiya - 2013. - №4. - S 115-120.
8. Alesina M.Yu. Radiobiologicheskie effekty vrazlichnyh organah i tkanyah zhivotnyh vzone radionuklidnogo zagryazneniya v rezul'tate avarii na CHAES. / M.Yu. Alesina, V.I. Ryasenko, P.I. Rymarenko // CHPKP «Progress» g. Kiev, NPO «Pripyat'» g. CHernobyl'. Kiev. - 1994. - S 6-16.
9. Akleev A. A. Vliyanie radiacionnogo vozdejstviya na pokazateli adgezivnoj sposobnosti nejtrofilov perifericheskojkrovi/A. A.Akleev, A. N.Grebenyuk, O. A. Gluminina//Vestnik Chelyabinskogo gosudarstvennogo universiteta. - 2013. - № 7 (298). - Biologiya. - № 2. - S. 91-93.
10. Fedotova A.S. Aktivnye formy kisloroda v perifericheskoj krovi krupnogo rogatogo skota pri obluchenii «invivo» i «invitro» v doze 1,5 mGr/A.S. Fedotova, G.V. Makarskaya, S.V Tarskikh S.V // Ekologicheskij monitoring: metody i podhody: materialy Mezhdunarodnoj satellitnoj konferencii «Ekologicheskij monitoring: metody i podhody» i HKH Mezhdunarodnogo simpoziuma «Slozhnye sistemy v ekstremal'nyh usloviyah». Krasnoyarsk, 20-24 sentyabrya 2021 g. - Elektron. dan. (4 Mb). - Krasnoyarsk: Sib. feder. un-t. - 2021. - S. 230-232.
11. Shishkina L.N. Formirovanie biologicheskih posledstvij vozdejstviya ioniziruyushchego izlucheniya v malyh dozah na organizm / L.N. Shishkina, M.A. Klimovich, M.V. Kozlov //Materialy Mezhdunarodnoj konferencii (Syktyvkar, Respublika Komi, Rossiya, 17-21 marta 2014 g.). Syktyvkar. - 2014. - S. 270-274.
12. Zemskov V.M. The studying of functional condition of human phagocytes (oxygen metabolism and cells mobility): method. recommendations /.V.M. Zemskov, A.A. Barsukov // M.: Institute of Immunology M3 USSR. - 1988. - 20 s.
13. Eremina I.YU., Makarskaya G.V., Tarskih S.V. Vozrastnye osobennosti kislorodnogo metabolizma kletok krovi krupnogo rogatogo skota /I.Yu. Eremina, G.V. Makarskaya, S.V. Tarskikh //Vestnik KrasGAU -2010. - № 11. - S.128-135.
14. Klimovich M.A. Sensitive Indices of the Murine Liver Lipids to the Action of Low Intensity X-Ray Radiation at Low Doses /M.A. Klimovich, M.V. Kozlov, L.N. Shishkina //New Steps in Physical Chemistry, Chemical Physics and Biochemical Physics. N.-Y.: Nova Science Publishers. - 2013. - Chapter 27. - S. 239-263.
15. Alesina M.U. The formation of radio biological effects under chronic internal and external radiation in low doses of experimental animals / M.U. Alesina // International magazine of radiation medicine. - 1999. - № 2. - S. 92-99.
16. Vladimirov Yu.A. Free radicals and cell chemiluminiscence / Yu.A. Vladimirov, E.V. Proskurnina Vladimirov U.A., Proscurnina E.V. // Biochemistry (Moscow). - 2009. - Т. 74. - № 13. - С. 1545-1566.
17. Fedotova A.S. An impact of low doses radiation on the kinetics of reactive oxygen species generation in sheep peripheral blood / A.S. Fedotova, G.V. Makarskaya, S.V. Tarskikh, E.G. Turitcyna, V.A. Kolesnikov // IOPConf. Ser.: EarthEnviron. Sci. - 2020. - 412:052016.
18. Kataoka T. Study of antioxidative effects and anti-inflammatory effects in mice due to low-dose X-irradiation or radon inhalation /T. Kataoka // Journal of Radiation Research. - 2013. - T.54. - S.587-596.
Contribution of the authors:
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication.
The authors declare that there is no conflict of interest.
Информация об авторах
Федотова Арина Сергеевна, канд. биол. наук, доцент, ФГБОУ ВО «Красноярский государственный аграрный университет», г. Красноярск, Россия, krasfas@mail.ru
Макарская Галина Владимировна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник отдела технологий мониторинга природной среды, Институт вычислительного моделирования СО РАН, г. Красноярск, Россия, mgv@icm.krasn.ru.
Тарских Светлана Вениаминовна, вед. инженер МНЦ исследований экстремальных состояний организма, Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный центр СО РАН», г. Красноярск, s.tarskikh@inbox.ru
Information about the authors
Fedotova Arina S, PhD of Biological Sciences, Associate Professor at the Department, FSEI HPE Krasnoyarsk State Agrarian University, Krasnoyarsk, Russia, krasfas@mail.ru.
Makarskaya Galina V., PhD of Biological Sciences, Senior Researcher of Environmental Monitoring technologies Department, Institute of Computational Modeling, Siberian Branch Academy of Science, Krasnoyarsk, Russia, mgv@icm.krasn.ru.
Tarskih Svetlana V., Chief Engineer in Research Institute of Extreme Conditions of the Body, Federal Research Centre «Krasnoyarsk Science Centre of the Siberian Branch of the Russian Academy of Science», Krasnoyarsk, s.tarskikh@inbox.ru
Статья поступила в редакцию 20.03.2022; одобрена после рецензирования 01.06.2022; принята к публикации 10.06.2022
The article was submitted 20.03.2022; approved after reviewing 01.06.2022; accepted for publication10.06.2020.
