CC BY
14
18 МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»
Г.Г. Варванина1, А.В. Смирнова12, А.С. Гуляев13, И.Е. Трубицына1, Л.В. Винокурова1, К.К. Носкова1 ИССЛЕДОВАНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ МАТРИКСНОЙ МЕТТАЛЛОПРОТЕАЗЫ 9-ГО ТИПА И ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 1ГБУЗ МКНЦДЗМ, Москва, Россия; 2ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Россия; 3ИБГ РАН, Москва
Введение. Хроническое воспаление является фоном для развития неопластического роста, в частности хронические панкреатиты (ХП) наиболее частая причина развития рака поджелудочной железы (РПЖ). Факторы ремоде-лирования межклеточного матрикса (матриксная металлопротеаза 9-го типа, или ММР-9) и связанная с ними система регуляции синтеза эпидермального фактора роста EGF в настоящее время изучены недостаточно.
Цель исследования — определить концентрацию ММР-9 и EGF в крови пациентов с заболеваниями ПЖ. Кровь для исследования наиболее доступна, а выбранные параметры определены ввиду их значимости как при воспалении, так и при опухолевом росте.
Материалы и методы. 72 пациента с ХП и РПЖ, средний возраст 54 ± 12 лет (46 мужчин и 26 женщин). Для анализа данных пациенты были разделены на 4 группы: группа контроля — 13 (без патологий ПЖ); РПЖ — 16, ХП с постнекротическими кистами — 23, ХП без кистозных образований — 37. В сыворотке крови определяли концентрацию ММП-9 и EGF. Концентрацию белков в крови определяли методом ELISA. Статистический анализ данных проводили непараметрическим методом Манна-Уит-ни и post-hoc теста Дунна для попарного сравнения концентрации MMP-9 в экспериментальных группах, где для коррекции p-уровня значимости использован метод Холма. Достоверность различий считали существенной прир < 0,05.
Результаты. Выявлено достоверное повышение уровня ММП-9 в сыворотке крови пациентов с РПЖ по сравнению с группой контроля р = 0,008. Между группами контроля и ХП (группа с кистами и без) р = 0,044. Статистически значимых различий между остальными группами не найдено. При сравнении группы с ХП (с кистами и без) и группой контроля была установлена статистически значимая разница концентрации показателя EGF (р = 0,004).
Заключение. Исследование изменения концентрации ММР-9 и EGF является перспективной темой для дальнейшего изучения хронического воспаления как фактора опухолевого роста.
Г.Г. Варванина1, А.С. Гуляев12, А.В. Смирнова13, Л.В. Винокурова1
ГЕНДЕРНОЕ РАЗЛИЧИЕ КОЛИЧЕСТВА СЫВОРОТОЧНЫХ МАТРИКСИНОВ И ИХ ИНГИБИТОРА ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
1ГБУЗ МКНЦ ДЗМ, Москва, Россия; 2ИБГ РАН, Москва, Россия;
3ФГБУ«РОНЦим. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Россия
Введение. Причины развития хронического панкреатита (ХП) у мужчин и женщин различны. Вопрос гендер-ных отличий в показателях активного процесса воспалительного ремоделирования межклеточного матрикса, как фонового состояния для возникновения опухолей, является актуальным.
Цель исследования — определить концентрацию ММР-2, ММР-9 и TIMP-2 в крови пациентов с ХП и уточнить наличие гендерных различий.
Материалы и методы. Кровь пациентов, страдающих ХП более 7 лет (75 человек, из них женщины — 44, мужчины — 31), и практически здоровых людей (13 человек). Выделены сравнимые по количеству подгруппы: киста, рак предстательной железы (РПЖ), ХП. Белки определяли в плазме венозной крови методом ELISA. Статистический анализ различий медианных значений при различных заболеваниях и в контроле проводили с помощью теста Кра-скелла-Уоллиса, для множественных попарных сравнений использовали post-hoc тест Дунна с поправкой Холма; для расчета коэффициента корреляции использовали ранговый тест Спирмена. Расчеты проводили в среде R (пакеты stats, PMCMR, ggplot2).
Результаты. При сравнении групп пациентов с ХП, состоявших как из мужчин, так и из женщин, была установлена статистически значимая разница концентрации MMP-9 (р = 0,012) и TIMP-2 (р = 0,03) с практически здоровыми людьми. При сравнении групп были определены изменения ММР-9 для групп контроля и РПЖ, а также практически здоровых и всех типов пациентов с ХП (группа с ХП и с кистами) р = 0,008 и 0,044 соответственно, и для TIMP-2 при сравнении группы пациентов с кистов и ХП. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена между концентрацией TIMP-2 и MMP-2 во всей выборке пациентов равен р = 0,37 (S = 74490, p = 0,0004), однако эти коэффициенты для TIMP-2, MMP-2 и MMP-9 статистически незначимы. Коэффициент линейной регрессии TIMP-2 по MMP-2 был статистически значим, но невелик, так же как и коэффициент детерминации: 82,77 + 0,17, R2 = 0,12, p < 0,001 для всех коэффициентов. При анализе по отдельности группы женщин и мужчин установлено существование гендерной специфики: у женщин ранговый коэффициент корреляции Спирмена между TIMP-2 и MMP-2 существенно выше, чем в смешанной выборке, и составляет р = 0,62 (S = 4380,7, p < 0,0001), в то время как у мужчин никакой существенной зависимости между этими показателями не наблюдали.
Заключение. В выбранной нами популяции течение воспалительного процесса ПЖ у женщин и мужчин различается. Реакция межклеточных факторов ремоделирования
Спецвыпуск / том 16 / 2017
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»
19
зависит от пола пациента, что должно учитываться для разработки алгоритмов диагностики и создания панелей диагностических систем для раннего выявления рака ПЖ при ХП.
А.А. Вартанян, О.С. Бурова, М.А. Барышникова ВОВЛЕЧЕНИЕ АУТОФАГИИ В ВАСКУЛОГЕННУЮ МИМИКРИЮ ПРИ МЕЛАНОМЕ
ФГБУ«РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
Введение. Аутофагия рассматривается как катаболиче-ский процесс удаления отработанных органелл, долгоживу-щих белков, патогенов и продуктов распада с помощью двухмембранных аутофагосом, в результате которого клетка самообновляется и поддерживает жизнеспособность. Аутофагия сопровождает жизнедеятельность нормальной клетки на протяжении всего времени ее существования и, по всей видимости, является элементом клеточной защиты. В последние годы получены доказательства существования альтернативной системы кровоснабжения опухоли — васкуло-генной мимикрии (ВМ): формирование опухолевыми клетками в отсутствие эндотелиальных клеток васкулярных каналов, ограниченных базальной мембраной.
Цель исследования — выявить взаимосвязь между ау-тофагией и ВМ.
Материалы и методы. В работе были использованы 2D-и 3D-культивирование клеток меланомы, выведенных в клеточную линию из операционного материала пациентов с диссеминированной меланомой, электрофорез и Вестерн блот, нокдаун гена с помощью малых интерферирующих РНК, проточная цитофлуориметрия.
Результаты. Об уровне активации аутофагии в клетках меланомы судили по экспрессии LC-3B — маркера необратимой стадии аутофагии. В клеточной линии меланомы с мутацией в BRAFV600E LC-3B экспрессировали 22 ± 2 % клеток, а в клеточной линии меланомы дикого типа этот белок экспрессировали 94 ± 5 % клеток. Блокирование аутофагии 3-Ма, ингибитором инициации аутофагии, приводило к заметному снижению способности клеток меланомы формировать в 3D-культуре сосудисто-подобные структуры (СПС). Блокирование поздней стадии аутофа-гии (слияния фагофор с лизосомами) хлорокином также ингибировало формирование СПС. Полученные результаты были подтверждены нокдауном гена BECN1, участвующего в инициации аутофагии, и гена ATG5 — маркера функционально активной аутофагосомы. Нокдаун гена BECN1 в клетках меланомы, формирующих СПС, малыми интерферирующими РНК снижал уровень белка beclinl на 70—75 % и блокировал формирование СПС на Матри-геле. Клетки меланомы с нокдауном гена ATG5 на Матри-геле «ошаривались», но сохраняли способность мигрировать и узнавать друг друга, формирование СПС не наблюдалось.
Заключение. Полученные данные свидетельствуют о том, что аутофагия активно участвует в формировании СПС. Мы предполагаем, что аутофагия в прогрессии опухоли выполняет двойную функцию — снижает эффективность химиотерапии и способствует формированию дополнительной васкулярной сети, ВМ, которая может частично
компенсировать недостаточно быстрое развитие в опухоли кровеносной сети.
П.И. Васильчиков, А.Д. Перенков, Д.В. Новиков, С.В. Шумилова, Н.А. Новикова, В.В. Новиков РЕКОМБИНАНТНЫЙ ИММУНОТОКСИН ПРОТИВ МУЦИНА 1 НА ОСНОВЕ SCFV МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ИКО25 И РОТАВИРУСНОГО ЭНТЕРОТОКСИНА NSP4
ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород, Россия
Введение. Одним из перспективных направлений в терапии онкологических заболеваний является использование антител против опухолеассоциированных антигенов. Ранее в РОНЦ им. Н.Н. Блохина были получены монокло-нальные антитела (МКА) мыши ИКО25, специфичные к Муцину l (MUCl) человека, для которых показана возможность использования в иммунотерапии опухолей. В клетках E. coli нами был получен рекомбинантный аналог антител против MUCl, представляющий собой объединенные в одну молекулу вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепей (scFv) МКА ИКО25. Для усиления противоопухолевого действия scFv был слит с фрагментом молекулы ротавирусного энтеротоксина NSP4, что привело к получению иммунотоксина scFv-NSP4. Согласно литературным данным, NSP4 обладает мембранодестабили-зирующим действием и способностью индуцировать апоптоз в клетках линий колоректального рака (HT — 29) и рака тела матки (HeLa).
Цель исследования — изучить характер взаимодействия иммунотоксина scFv-NSP4 с клеточными линиями, экс-прессирующими и не экспрессирующими MUCl.
Материалы и методы. Культуры клеток MCF-7, Colo-205, Caco-2, предоставленные РОНЦ им. Н.Н. Бло-хина, выращивали по стандартному протоколу. Иммуно-токсин scFv-NSP4 экспрессировали в E. mli и очищали хроматографически. Полученный препарат scFv-NSP4 и МКА ИКО25 (РОНЦ им. Н.Н. Блохина) метили активированным эфиром флуоресцентного красителя Cy-5 и методом проточной цитометрии, оценивали взаимодействие с клетками линий MCF-7, Colo-205 и Caco-2.
Результаты. Показано, что иммунотоксин scFv-NSP4 взаимодействовал с 99,2 и 98 % клеток линий Colo-205 и MCF-7, экспрессирующих MUCl, соответственно. Флуоресценция клеток линии Caco-2, не экспрессирующих MUCl, регистрировалась лишь в 0,33 % случаев, что, вероятно, связано с неспецифическим взаимодействием. При этом уровень флуоресценции рекомбинантного им-мунотоксина scFv-NSP4 на поверхности клеток линии Colo-205 был в l,8 раз выше, чем на поверхности клеток линии MCF-7. Полученные данные совпадали с результатами окрашивания клеток с использованием МКА ИКО25. Следует отметить, что уровень флуоресценции клеток, окрашенных рекомбинантным иммунотоксином, в среднем в 2,5 раза превышал уровень флуоресценции клеток, окрашенных МКА ИКО25.
Заключение. Таким образом, рекомбинантный иммунотоксин scFv-NSP4 проявлял сходную с МКА ИКО25 специфичность связывания с MUCl антигеном на поверхности опухолевых клеток. Повышенный уровень флуорес-
Спецвыпуск/ том 16 / 2017
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
