CC BY
43
7. Fleiszer D., Mac Farlone J., Murrey D. et al. //Lancet. — 1978. — N
1430, —P. 552—553.
8. Freeman H., Spiller G., Kim Y. //Cancer Res. — 1980. — Vol. 40. —
P. 2661-2665.
9. Furukava K., Yamamoto I., Tanida M. et al. //Cancer. — 1995. — N
6.-P. 1508-1515.
© Коллектив авторов, 2000 УДК 612.11:616-006
Л. Ю. Андреева, Н. Н. Тупицын, Г. Ш. Овумян,
К. Л. Чимишкян, 3. Г. Кадагидзе, В. В. Птушкин,
В. И. Кострыкина, Л. Ф. Морозова, В. Б. Ларионова,
Е. Г. Турнянская, Д. М. Мхеидзе, Н. В. Жуков, А. М. Гарин
ГЕМОПОЭТИЧЕСКИЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКИ В КРОВИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ: ВЗАИМОСВЯЗЬ КОЛОНИЕОБРАЗОВАНИЯ И ЭКСПРЕССИИ CD34
НИИ клинической онкологии
Стволовая гемопоэтическая клетка (СГК) — клетка, способная полноценно и длительно поддерживать гемопоэз после облучения и токсических воздействий [1]. Аутологичная пересадка мононуклеарных клеток крови, обогащенных фракцией СГК, обеспечивает сокращение периода критической цитопении у онкологических больных после курсов высокодозной химиотерапии.
В норме СГКлибо практически отсутствуют в периферической крови, либо присутствуют в незначительных количествах (менее 1 %). СГК могут поступать в циркуляторное русло в период восстановления гемопоэза после цитопении, индуцированной цитостатиками, а также на фоне применения гемо-поэтических факторов роста (ГФР). Гемопоэтические предшественники, поступающие в кровь из костного мозга под влиянием ГФР или в период выхода из цитопении, носят название мобилизованных СГК, или периферических стволовых клеток (ПСК). Они могут быть собраны, криоконсерви-рованы и в дальнейшем использованы для аутологичной трансплантации в качестве гематологической поддержки [13].
Периферическая кровь как источник СГК применяется в последнее время все чаще [4, 5, 9], так как обладает рядом преимуществ по сравнению с костным мозгом: (упрощение процедуры сбора, возможность мониторинга и соответственно набор достаточного количества материала).
Поскольку пул гемопоэтических предшественников неоднороден, то часто данные клетки называют клетками-предшественницами гемопоэза (КПГ), термин СГК определяет только родоначальную истинно стволовую клетку.
КПГ обладают способностью формировать клеточные колонии in vivo и in vitro, поэтому клетки пула КГТГ иначе называют колониеобразующими единицами (КОЕ). СГК формируют колонии из бластных клеток (КОЕ-бластов), из 40—1000 бластных клеток без терминальной дифференцировки,
4. Palustran protection from MNNG-induced carcinogenesis in rats was seen only as a significant reduction in cases developing multiple gastrointestinal lesions.
Поступила 16.04.99 / Submitted 16.04.99
L.Yu.Andreyeva, N.N.Tupitsyn, G.Sh.Ovumyan, K.L.Chimishkyan, Z.G.Kadagidze, V.V.Ptushkin, V.N.Kostrykina, L.F.Morozova, VB.Larionova,
E. G. Turnyanskaya, D.M.Mkheidze, N. V.Zhukov, A.M. Garin
BLOOD HEMOPOIETIC PRECURSORS IN CANCER PATIENTS: RELATIONSHIP OF COLONY FORMATION AND CD34 EXPRESSION
Institute of Clinical Oncology
Human stem hemopoietic cells (SHC) can maintain full-value hemopoiesis for a long time after exposure to radiation and toxic agents [1]. Autologous transplantation of blood mononuclears enriched with SHC reduces critical cytopenia time in cancer patients after high-dose chemotherapy.
Normally the SHC are absent or present at small amounts (less than 1%) in peripheral blood. Circulatory SCH may be found in patients recovering after cytostatic-induced cytopenia and as a result of administration of hemopoietic growth factors (HGF). Hemopoietic precursors penetrating into blood from bone marrow under the HGF effect or during recovery from cytopenia are referred to as mobilized SHC or peripheral stem cells (PSC). They may be harvested, exposed to cryopreservation and used later for autologous transplantation as hematological support [13].
Peripheral blood as a source of SHC is currently applied more widely [4,5,9] because it has certain advantages over bone marrow such as simpler harvesting, the possibility of monitoring and availability of sufficient amount of material.
Since the hemopoietic precursor, pool is not uniform these cells are usually referred to as hemopoietic precursor cells (HPC) while the term SHC is used to define the initial true hemopoietic cell.
The HPC can form cell colonies in vivo and in vitro and therefore are termed colony-forming units (CFU). The SHC form colonies from blast cells (CFU-blasts), i.e. 40-1000 blasts without terminal differentiation generated after reinoculation. The same cells form 8- and 12-day splenic colonies in vivo. It is SHC that assure the long-term recovery of impaired hemopoiesis [7,8].
There are also polypotent cells, colony forming units of granulocyte-erythroid-macrophage-megakaryocyte lineage
образуемые при вторичных пересевах. Эти же клетки формируют in vivo как 8-, так и 12-дневные селезеночные колонии. Именно СГК обеспечивают длительное восстановление травмированного гемопоэза [7, 8].
Кроме СГК, выделяют полипотентные клетки — грану-лоцитарно-эритроцитарно-макрофагально-мегакариоци-тарные колониеобразующие единицы (КОЕ-ГЕММ), дающие начало 5 росткам гемопоэза, включая Т-лимфоидный. Бипотентные КПГ, относящиеся к разряду коммитирован-ных в отношении миелоидиого ростка, способны к диффе-ренцировке по 2 направлениям. С точки зрения характеристики трансплантационного гемопоэтического материала наибольшее значение имеет количество бипотентных колониеобразующих единиц гранулоцитов-макрофагов (КОЕ-ГМ), определяющих быстрое восстановление гранулоци-тарного ростка [11]. Также различают унипотентные КПГ: клоногенные предшественники для гранулоцитов (КОЕ-Г), для макрофагов (КОЕ-М) и ряд других, обладающие однонаправленностью дифференцировки. Эритроидные предшественники формируют 2 типа колоний: более ранние — БОЕ-Э (бурстобразующие единицы) образуются на 18—20-й день от посева в культуру и более зрелые КОЕ-Э образуются к 10—12-му дню от посева.
Степень дифференцировки КПГ может быть оценена также по экспрессии ряда мембранных антигенов. Общим для всех клеток данного пула является экспрессия CD34-антигена [10]. По мере дифференцировки КПГ уровни экспрессии молекулы CD34 снижаются, и клетка приобретает маркеры CD38, HLA-DR, CD71, а на конечных стадиях созревания и линейно специфичные антигены — CD33, CD13, CDЮ, CD7 [4]. Оценка количества С034+-клеток отражает полноценность трансплантируемого материала.
Методы определения колониеобразующей способности клеток и количественного определения КПГ на основании экспрессии С034-антигена нашли широкое применение в клинической практике. Оба метода позволяют оценить содержание клеток-предшественниц в гемопоэтическом материале и являются взаимодополняющими. Оценка роста колоний отражает функциональную активность (степень пролиферативной активности и направленность дифференцировки), но результаты теста доступны только через 7—14 дней. Определение числа СБ34+-клеток является более быстрым (1—2 ч) методом количественной оценки КПГ. Степень функциональной активности в этом случае может быть определена лишь косвенно. В работе представлены данные по сопоставлению колониеоб-разования и иммуновыявления С034+-клеток.
Материалы и методы. Анализировали 217 образцов гемопоэтической ткани: 111 образцов периферической крови, взятой за день и в дни проведения больному процедуры сбора фракции мононуклеаров, обогащенных КПГ (цитаферез), и 106 образцов продукта цитафереза.
Цитаферез проводили на сепараторе клеток крови «Baxter CS3000 plus».
Группа больных состояла из 37 человек (мужчины — 17, женщины — 20, средний возраст 34,7 года).
Клинический диагноз больных: лимфогранулематоз — у 16, Т-клеточная лимфосаркома — у 8, мелкоклеточный рак легкого — у 4, несименомная опухоль яичка — у 2, рак молочной железы — у 7 человек.
Каждый больной до проведения сборов ПСК получал курсы стандартной химиотерапии. Процедура мобилизации включала индукционную химиотерапию и стимуляцию гемопоэза ростовыми факторами (Г-КСФ, ГМ-КСФ). Процедура сбора ПСК осуществлялась на 10—11-й день применения цитокинов (4—23 дня). Момент начала проведения цитафереза определялся в соответствии
(CFU-GEMM), that give rise to 5 cell lines including T-lymphocytes. Bipotent HPC with myeloid commitment may differentiate in two lines. Bipotent CFU of granulo-cyte-macrophage lineage (CFU-GM) providing rapid granulocyte recovery are of the most importance for the transplantation purpose [11]. There are also unipotent HPC such as clonogenic progenitors of granulocytes (CFU-G), macrophages (CFU-M), and some other cells with a single lineage of differentiation. Erythroid precursors fqrm 2 colony types, i.e. earlier burst-forming units (BFU-E) are formed on day 18-20 after inoculation and more mature CFU-E that are found by day 10-12 after inoculation.
HPC differentiation may be evaluated by expression of membrane antigens. CD34 expression is common for all cells from this pool [10]. As HPC differentiation proceeds, CD34 expression is decreasing and the cells start to express CD38, HLA-DR, CD71, and (at late maturation stages) lineage-specific antigens such as CD33, CD13, CD10, CD7 [4]. CD+ cell count is a measure of value of the transplantation material.
The colony-forming capacity measurement and HPC quantification by CD34 expression are widely applied in clinical practice. Both tests evaluate the content of precursor cells in hemopoietic material and are supplementary. The colony forming capacity is a reflection of functional activity (degree of proliferative activity and lineage differentiation), but results are available only at 7-14 days. The CD34+ cell quantification is a more rapid test (1-2 hours), but it evaluates functional activity only in an indirect manner. This paper compares colony-forming capacity tests and CD34+ immunostaining.
Materials and Methods. The analysis was performed in 217 specimens of hemopoietic tissue including 111 samples of peripheral blood harvested at 1 day before and on the day of HPC-enriched mononuclear cell fraction harvesting (cytapheresis) and 106 cytapheresis products.
The cytapheresis was performed using a Baxter CS3000 Plus blood cell separator.
The patient group consisted of 37 (17 males, 20 females) individuals, mean age 34.7 years.
The patients had the diagnosis of Hodgkin’s disease (16), T-cell lymphosarcoma (8), small-cell lung cancer (4), non-seminomatous testicular tumor (2), breast cancer (7).
Every patient received standard chemotherapy before PSC harvesting. The mobilization procedure consisted of induction chemotherapy and hemopoiesis stimulation with growth factors (G-CSF, GM-CSF). PSC harvesting was performed on days 10-11 of cytokine administration (4-23 days). Time of cytapheresis was determined by rate of leukocyte recovery (1000 or more per mcl) and monocytosis under the control of circulating CD34+ cells.
Quantification of CD34+ cells in peripheral blood and cytapheresis material.
Blood samples and cytapheresis material were freed from erythrocytes by standard lysis technique. After washing two times in Hanks medium the cells were incubated 30 min with monoclonal antibody (IgGl fluorescein- or ficoerythrin-labeled antibody HPCA-2 to CD34 [Becton Dickinson]). Similarly labeled murine immunoglobulins IgGl were used as control. The reactivity was measured using a 5-parameter cytometer (FACScan Becton Dickinson). The analysis was carried out in the lymphocyte gate in blood samples and in lymphoid/myeloid gate in the cytapheresis material. Calculation of CD34+ cell count per ml blood was performed basing on leukocyte count on the test day, percentage of cells in the gate and percentage of CD34+ cells in the gate.
Colony forming in vivo.
Blood leukocytes were separated by standard erythrocyte lysis (the same as in the immunofluorescence test). The cells, 200,000 per dish, were added to Methocult medium containing growth factors. The inoculation was made in duplicate for every sample (2 dishes per sample). Mean number of colonies or clusters per sample was calculated on day 14. The clusters were differentiated from the colonies and were defined as groups of not more than 50 cells: small clusters consisted of 10-25 cells, large clusters had 26-50 cells.
со скоростью восстановления лейкоцитов (1000 на 1 мкл и более) и моноцитоза под контролем числа CD34+-KneTOK, циркулирующих в крови.
Определение CD34*-клеток в периферической крови и материале цитафе-реза. В образцах клеток крови и материала цитафереза удаляли эритроциты путем лизирования по стандартной методике. После двойной отмывки в среде Хенкса клетки инкубировали с моноклональными антителами в течение 30 мин. В реакции использовали антитела НРСА-2 к молекуле CD34, меченные флюоресцеином или фикоэритрином IgGl-изотипа (Becton Dickinson).
В контроле использовали мышиные иммуноглобулины IgG 1-изотипа, меченные аналогичными красителями. Результаты реакции оценивали на проточном 5-параметровом цитометре (FACScan Becton Dickinson). В крови сбор и анализ осуществляли в гейте лимфоцитов (участок накопления анализируемых событий в соответствии с параметрами светорассеяния), в материале цитафереза гейт включал лимфоидные и миелоидные элементы. Подсчет абсолютного числа С034+-клеток в 1 мкл крови проводили на основании числа лейкоцитов в геммограмме надень исследования, процента клеток, попавших в гейт, и процента С034+-клеток в гейте.
Колониеобразование in vivo. Лейкоциты крови выделяли путем лизиса эритроцитов по стандартной методике (так же, как и при постановке реакции иммунофлюоресценции). В чашки с питательной средой Methocult, содержащей ростовые факторы, вносили по 200 000 клеток. Для каждого исследуемого образца посев дублировали (2 чашки на образец). На 14-й день подсчитывали среднее число колоний или кластеров на образец. Кластеры отличали от колоний по числу клеток (не более 50); малые кластеры 10 — 25 клеток, большие кластеры 26 — 50 клеток. Оценивали среднее количество смешанных колоний из лейкоцитов и клеток эритроидного ростка (КОЕ-ГЕММ), чистых лейкоцитарных колоний, соответствующих КОЕ-ГМ, и эритроидных колоний из более зрелых эритроидных предшественников (КОЕ-Э).
Статистический анализ проводили с использованием программы SPSS.
Результаты и обсуждение. Исследование проведено на 217 образцах гемопоэтической ткани: 111—периферическая кровь, 106 — цитоконцентрат. Больным в среднем было проведено 3 процедуры цитафереза (от 2 до 5). В большинстве Таблица 1 Общая характеристика материала / General characteristics of the
Mean numbers of mixed colonies of leukocyte and erythroid lineages (CFU-GEMM), pure leukocyte colonies (CFU-GM) and erythroid colonies consisting of more mature erythroid precursors (CFU-E) were calculated.
Statistical analysis was performed using SPSS programs.
Results and Discussion. The study was performed in 217 specimens of hemopoietic tissue including 111 peripheral blood samples and 106 cell concentrate samples. The patients received 3 (2-5) cytapheresis sessions on the average. Minimum amount of CD34+ cells per kg bodyweight was harvested for 2 sessions in most cases.
We compared counts of CD34+ cells and CFU in the blood and cytapheresis material samples (table 1). CD34+ cell percentages and absolute numbers per mcl cytapheresis product were significantly higher than in the peripheral blood: cf. 1.51% vs 0.52%, j9=0.0001; 2149.9 vs 67.1 CD34+ cells per mcl, respectively (table 2). CD34+ counts in the separation material were directly related to the respective blood counts (R=Q.55, /j=0.0001; J?=0.762,/>=0.0001).
Positive correlations between the blood and cell concentrate counts were found for all clusters and CFU, except erythroid precursors. There were no statistically significant differences in colony counts between the semiliquid media after inoculation of 200,000 cells, blood and cytapheresis material (table 2). This was an unexpected finding since enhanced colony formation could be predicted in the cytapheresis material due to mononuclear enrichment.
No relationship was found between percentage of CD34+ leukocytes in blood and colony count in the semiliquid
T a b I e 1
material
Материал Периферическая кровь Продукт цитафереза
среднее стандартная ошибка медиана разброс n среднее стандартная ошибка медиана разброс n
CD34, % CD34+ на 1 мкл CD34+ cells per mcl 0,566 61,88 0,009 9,52 0,27 23,93 0,0-7,1 0,0—543,0 103 103 0,16 446,05 1,38 1935,92 0,76 747,46 0,0—8,67 0,8—39309,0 106 106
Лейкоциты, кровь/клеточ-ность, сепарат Leukocytes, blood/cellularity, separated product Кластеры: Clusters: 14,62 1,45 8,1 0,67—60,1 108 1,23 12,7 8,5 0,8—66,5 68
малые /small большие / large КОЕ-ГЕММ CFU-GEMM 61,37 38,94 6,147 23,99 19,05 1.71 1,75 0,5 0,0 0,0—500,0 0,0—500,0 0,0—51,0 44 44 44 16,15 10,23 2,03 54,92 24,86 10,24 6,25 5,0 2,5 0,0—500,0 0,0—500,0 0,0—90,5 68 67 67
КОЕ-ГМ CFU-GM 22,8 7,9 2,0 0,0—288,0 44 5,93 28,54 8,0 0,0—230,0 67
КОЕ-Э CFU-E CD34'106 на 1 кг, сепарат CD34-106 cells per kg, separated product 1,98 0,73 0,0 0,0—25,5 44 0,38 0,6 1,78 2,89 0,0 1,07 0,0—12,0 0,0—49,0 67 106
Material mean standard deviation median range n mean standard deviation median range n
Peripheral blood Cytapheresis product
Таблица 2 Table 2
Сравнение средних характеристик КПГ в периферической крови и материале цитафереза ( в один и тот же день)
Mean НРС characteristics in peripheral blood and cytapheresis material (the same day)
Материал n Кровь Сепарат t P R P
Кластеры малые / Small clusters 2 64,05±25,07 62,3+22,8 0,067 0,947 0,498 0,0001
Кластеры большие / Large clusters 2 40,79±19,9 22,3±11,86 1,132 0,264 0,573 0,0001
КОЕ-ГЕММ / CFU-GEMM 2 6,44±1,78 10,39±2,97 1,515 0,137 0,494 0,0001
КОЕ-ГМ / CFU-GM 2 23,9+8,24 29,34±8,64 1,048 0,301 0,807 0,0001
КОЕ-Э/CFU-E 2 1,98+0,76 1,524±0,42 -0,606 0,548 0,276 0,077
CD34+, % 5 0,525±0,009 1,51±0,201 5,819 0,0001 0,548 0,0001
СР34+-клетки, на 1 мкл CD34+ cells per mcl 5 67,104±11,13 2149,97+4820,37 -4,049 0,0001 0,762 0,0001
Material n Blood Separated product t P R p
Примечание, p — достоверность различий, t — значимость различий по Стыоденту. Здесь и в табл. 3 — 8: R — коэффициент корреляции, Р — уровень значимости и корреляционной связи, п — количество наблюдений.
N о t е. р, significance of differences; t, Student’s significance of ditferences.
случаев за 2 сеанса цитафереза удавалось набрать минимальное количество СБ34+-клеток на 1 кг массы тела больного.
Были сопоставлены количественные характеристики содержания С034+-клеток и КОЕ в крови и цитаферез-ном материале (табл. 1). Процентное содержание СВ34+-клеток и их абсолютное количество в 1 мют цитаферезно-го продукта было достоверно более высоким в сравнении с таковыми в периферической крови: 1,51 и 0,52%, /7=0,0001; 2149,9 СВ34+-клеток на 1 мкл и 67,1 СБ34+-клеток на 1 мют соответственно (табл. 2). При этом уровни С034+-кле-ток в сепарационном материале находились в прямой зависимости от содержания этих клеток в крови (Л=0,55, />=0,0001; Д=0,762, />=0,0001).
Положительные корреляционные связи между содержанием в крови и цитоконцентрате отмечены для всех кластер- и колониеобразующих единиц, за исключением эритроидных. Достоверных различий в количестве колоний, выросших в полужидких средах при посеве 200 000 клеток, в крови и материале цитафереза не отмечено (см. табл. 2). Эти данные выглядят неожиданно, так как можно было бы предполагать увеличение роста колоний в материале цитафереза за счет обогащения цитоконцентрата мононуклеарными клетками.
Не отмечено корреляционных связей относительного содержания СБ34+-клеток (процент среди лейкоцитов) крови с числом колоний в полужидких средах. Только количество малых кластеров находилось в зависимости от процента СБ34+-клеток крови (Л=0,328,/>=0,034, и=42, табл. 3). Напротив, абсолютное содержание СБ34+-клеток в крови (клеток на 1 мкл) положительно коррелировало с числом кластеров и колоний, за исключением эритроидных предшественников (табл. 4). Аналогичные данные получены при сопоставлении СБ34+-клеток и КОЕ в материале цитафереза (68 образцов) с той лишь разницей, что в цитоконцентрате количество КОЕ-Э коррелировало с числом С034+-клеток (табл. 5, 6). Эти различия могут объясняться селективным обогащением фракции СБ34+-клеток при сборе ПСК.
Процентное содержание СБ34+-клеток в цитоконцентрате находилось в прямой зависимости от числа кластероб-разующих единиц в периферической крови больного на момент начала сбора (табл. 7).
Таблица 3 Table 3
Корреляции между процентным содержанием СП34+-клеток в образцах периферической крови и колониеоб-разованием
Correlations between peripheral blood CD34+ cell percentage and colony formation
Признак Кластеры малые Кластеры большие КОЕ -ГЕММ КОЕ-ГМ КОЕ-Э
R 0,328* 0,289 0,037 0,093 -0,081
P 0,034 0,063 0,815 0,566 0,609
n 42 42 42 42 42
Character- istics Small clusters Large clusters CFU -GEMM CFU-GM CFU-E
Примечание. Здесь и в табл. 4—8, * — связь достоверна при />=0,05; ** — связь достоверна при />=0,001.
Note. Here and in tables 2-5,7,8: *, differences are statistically significant at />=0.05; **, differences are statistically significant at p= 0.001; R, coefficient of correlation; P, significance level; n, number of observations.
Таблица4 Table4
Корреляции между количеством С034+-клеток на 1 мкл в образцах периферической крови и колониеобразованием
Correlations between peripheral blood CD34+ cell count per mcl and colony formation
Признак Кластеры малые Кластеры большие КОЕ -ГЕММ КОЕ-ГМ КОЕ-Э
R 0,550** 0,331* 0,317* 0,358* -0,036
P 0,0001 0,032 0,041 0,020 0,821
n 42 42 42 42 42
Character- istics Small clusters Large clusters CFU -GEMM CFU-GM CFU-E
media. Only small clusters demonstrated a relationship with percentages of CD34+ cells in blood (J?=0.328, />=0.034, «=42; table 3). In contrast, absolute numbers of CD34+ cells in blood (cell count per mcl blood) correlated directly with the cluster and colony counts except for erythroid precursors (table 4). Comparison of CD34+ cells and CFU in cytapheresis material (68 specimens) demonstrated similar dependencies, though CFU-E bore relation with CD34+ cell counts in the cell concentrate specimens (tables 5,6). These differences may be explained by selective enrichment .of CD34+ cell fraction during PSC harvesting.
Таблица 5 Table5
Корреляции процента С034+-клеток в образцах продукта цитафереза с колониеобразованием
Correlations between cytapheresis product CD34+ cell percentage and colony formation
Признак Кластеры малые Кластеры большие КОЕ -ГЕММ КОЕ-ГМ КОЕ-Э
R 0,285** 0,200 0,065 0,108 0,104
P 0,01 0,101 0,601 0,384 0,405
n 68 68 67 67 67
Character- istics Small clusters Large clusters CFU -GEMM CFU-GM CFU-E
Интегральным показателем, отражающим эффективность процедуры стимуляции и сбора СВ34+-клеток крови для аутотрансплантации, является количество С034+-клеток, набранных в ходе процедуры цитафереза, в пересчете на 1 кг массы тела больного. Считается, что это количество должно быть более 2-106 СВ34+-клеток на 1 кг. Мы оценили взаимосвязь данного показателя с содержанием в крови и цитоконцентрате различных типов колониеобразующих клеток.
Количество С034+-клеток на 1 кг находилось в прямой пропорциональной зависимости от колониеобразующей способности клеток крови (числа малых кластеров, КОЕ-ГЕММ и КОЕ-ГМ) и колониеобразующей способности клеток сепарата (малых и больших кластеров, КОЕ-ГМ и КОЕ-Э, табл. 8). Вполне естественно, что абсолютное количество С034+-клеток на 1 мкл цитоконцентрата так же коррелировало с показателями колониеобразования.
Таким образом, полученные данные показали наличие взаимосвязи двух характеристик КПГ: экспрессией СБ34 и колониеобразованием. Выявлен факт обогащения материала цитафереза в целом по всей популяции С034+-клеток, тогда как число КОЕ пропорционально сохраняется. Однако полученные данные следует подтвердить более глубоким изучением популяционного состава С034+-клеток и взаимосвязи данных показателей с ростом колоний.
Таблицаб Table 6
Корреляции количества С034+-клеток на 1 мкл в образцах продукта цитафереза с колониеобразованием
Correlations between cytapheresis product CD34+ cell count per mcl and colony formation
Признак Кластеры малые Кластеры большие КОЕ -ГЕММ КОЕ-ГМ КОЕ-Э
R 0,612** 0,285* 0,308* 0,461** 0,342**
P 0,0001 0,018 0,011 0,0001 0,005
n 68 68 67 67 67
Character- istics Small clusters Large clusters CFU -GEMM CFU-GM CFU-E
Percentage of CD34+ cells in the cell concentrate related directly to the cluster forming units in peripheral blood on the day of harvesting (table 7).
Count of CD34+ cells per kg bodyweight harvested during cytapheresis is an integral characteristic of efficacy of the stimulation and CD34+ cell harvesting for the autotransplantation purpose. It is thought that this ratio should be 2-106 CD34+ cells per kg bodyweight. We evaluated relationship of this characteristic with counts of various CFU in blood and cell concentrate.
The counts of CD34+ cells per kg were directly related to colony forming capacity (number of small clusters, CFU-GEMM and CFU-GM) of blood cells and colony forming capacity (number of small and large clusters, CFU-GM and CFU-E; table 8) of separated cells. Naturally, absolute counts of CD34+ cells per mcl concentrate were also related to colony formation potential.
Our findings demonstrated relationship between two HPC characteristics, i.e. CD34 expression and colony formation. Cytapheresis material was enriched by the whole CD34+ cell population while the proportion of CFU remained unchanged. However, these findings should be verified by measurement of CD34+ cell populations and their relation to colony forming capacity.
Table 7
Таблица 7
Корреляции числа СЭ34+-клеток в материале цитафереза с количеством КОЕ крови Correlations between cytapheresis material CD34+ cell count and blood CFU count
Признак Кластеры малые Кластеры большие КОЕ-ГЕММ КОЕ-ГМ КОЕ-Э
%: R P n 0,461** 0,002 42 0,372* 0,015 42 0,109 0,490 42 0,205 0,192 42 -0,066 0,678 42
Клетки на 1 мкл: / Cells per mcl R P n 0,603** 0,0001 42 0,275 0,078 42 0,478** 0,001 42 0,630** 0,0001 42 0,102 0,522 42
Клетки на 1 кг массы тела больного: Cells per kg bodyweight R P n 0,602** 0,0001 42 0,277 0,076 42 0,473** 0,002 42 0,622** 0,0001 42 0,096 0,547 42
Characteristics Small clusters Large clusters CFU-GEMM CFU-GM CFU-E
Результаты работы интересны не только с прикладной, но и с теоретической точки зрения, поскольку вопрос о взаимосвязи числа мобилизованных С034+-клеток в крови с их функциональной активностью (типы и количество клеточных колоний) продолжает обсуждаться в литературе. Существование связи между этими параметрами можно считать доказанным [6]. На данный момент установлено, что количество более часто изучаемых КПГ-КОЕ-ГМ в периферической крови прямо пропорционально абсолютному числу СБ34+-клеток [11,12]. Наши данные подтверждают этот факт, но, кроме того, показывают, что количество СБ34+-клеток значительно превышает число КОЕ.
Сведения о том, какие субпопуляции клеток преобладают в цитаферезном продукте, происходит ли в процессе сепарации обогащение каких-либо клеточных типов, в настоящее время практически отсутствуют. Для выяснения данного вопроса нами предпринята попытка изучения не только гемопоэтических колоний, но и кластеробразующих единиц, выросших на 14-й день культивирования клеток крови и материала цита-фереза в полужидкой метилцеллюлозной среде.
Считается, что малые кластеры происходят из более ранних КОЕ-ГМ, а большие — из поздних КОЕ-ГМ, по этой причине в ряде работ большие кластеры объединяют с колониями и учитывают суммарно как отражение активности КОЕ-ГМ [2]. Данные о принадлежности кластеров обоих типов к КОЕ-ГМ подтверждены коэкспрессией CD34 и CD45RA на КПГ [6].
Клинический аспект работы заключается в том, что исследование проводилось на клетках крови онкологических больных в ходе подготовки к высокодозной химиотерапии с последующей аутотрансплантацией ПСК. Количество КПГ в цитоконцентрате, оцененное на основании экспрессии CD34-антигена, в дальнейшем подтверждаемое ростом колоний, являлось основным критерием полноценности потенциального трансплантата. Важно отметить, что в ходе цитафереза происходило селективное обогащение пула КПГ в целом. Уровни С034+-клеток коррелировали со всеми типами КОЕ (кластеры обоих типов, КОЕ-ГЕММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-Э), что подтверждает возможность использования данного критерия при оценке эффективности проводимого сбора КПГ для аутологичной трансплантации.
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Чертков И. Л., Дерюгина Е. И., Абрахам Н. Г., Левир Р. Д. //
Успехи соврем, биол. — 1991. —Т. 111, № 6. — С. 905—922.
2. Colony-assays of hematopoietic cells rising methylcellulose media /
The Terry — Fox Laboratory media preparation service. — Vancouver, 1992. — P. 25.
3. Gratwohl A., Hermans J. / Bone Marrow Transplant. — 1994. —
Vol. 13. - P. 5-10.
4. Gier E. et al. // Blood. - 1995. - Vol. 84. - P. 2795-2801.
5. Juttner C. A., To L. B, Ho J. Q. K. et al. // Transplant. Proc. —
1988.-Vol. 20.-P. 40-42.
6. Fritsch G., Buchinger P., Printz D. / Leukemia and Lymphoma. —
1993. - Vol. 10. - P. 443-451.
7. Fritsch G., Buchinger P., Printz D. / Blood. — 1993. — Vol. 81. —
P. 2301-2309.
8. Kessinger A., Armitage J. Q., Smith D. M. et al. // Ibid. — 1989. —
Vol. 74.- P. 1260-1263.
9. NakahataT., Ogawa M. / Proc. natl. Acad. Sci. USA. — 1982. —
Vol. 79. - P. 3843-3847.
Таблица8 Table8
Корреляции количества СР34+-клеток в пересчете на 1 кг массы тела больного с числом колоний в материале цитафереза
Correlations between CD34+ cell count per kg bodyweight and colony count in cytapheresis material
Признак Кластеры малые Кластеры большие КОЕ -ГЕММ КОЕ-ГМ КОЕ-Э
Ft 0,621** 0,278* 0,237 0,354** 0,269*
P 0,0001 0,029 0,064 0,005 0,034
n 62 62 62 62 62
Character- istics Small clusters Large clusters CFU -GEMM CFU-GM CFU-E
These results are of both practical and theoretical value since relationship of mobilized CD34+ cells in blood and their functional activity (cell colony number and types) is widely discussed in the literature. The relationship of these two factors is not doubted [6]. It is established that count of HPC-CFU-GM in peripheral blood is directly proportional to absolute number of CD34+ cells [11,12]. Our findings confirm this relationship, but also demonstrate that the number of CD34+ cells is much higher than the number of CFU.
There are practically no reports concerning cell subpopulations predominating in the cytapheresis product or enrichment of some cell types during separation. To elucidate this problem we analyzed both hemopoietic colonies on day 14 of blood cell culture and cytapheresis material in semiliquid methylcellulose medium.
It is though that small clusters originate from earlier CFU-GM while large ones originate from later CFU-GM. Therefore the large clusters are sometimes counted together with colonies and considered characteristics of CFU-GM activity [2]. The relation of both cluster types to CFU-GM is confirmed by coexpression of CD34 and CD45RA on HPC [6].
This study is of clinical importance because we analyzed blood from cancer patients going to receive high-dose chemotherapy and PSC autotransplantation to follow. The HPC count in cell concentrate evaluated by CD34 expression was the basic test to measure quality of potential transplantation material. It should be emphasized that selective enrichment of the whole HPC pool was observed during cytapheresis. CD34+ cell levels correlated with all CFU types (clusters of both types, CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-E) which supports the use of this test to evaluate efficacy of HPC harvesting for autologous transplantation.
10. Peschel C., Roller U. / Leukocyte typing 4 / Ed. W. Knapp — Oxford, 1989.— P. 817—818.
11. Serke S., Sauberlich S., Huhn D. / Brit. J. Haematol. — 1991.
- Vol. 77. - P. 453-459.
12. Siena S., Bregni М., Brando B./Blood. — 1991. — Vol. 77. — P. 400-409.
13. To L. B., Haylock D. N., Simmons R. J., Juttner C. A. / Ibid.
- 1997. - Vol. 89. - P. 2233-2258.
Поступила 28.06.99 / Submitted 28.06.99
