CC BY
44
УДК 616-091.8
ГЕМОКОАГУЛИРУЮЩИЕ И ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТКАНИ СЕЛЕЗЕНКИ
В БЛИЖАЙШИЕ ЧАСЫ ПОСЛЕ ЕЕ ЗАБОРА
© Котив Б.Н.1, Гайворонский И.В.23, Алексеев B.C.34, Русейкин Н.С.5
1 Кафедра госпитальной хирургии, 2 кафедра нормальной анатомии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург; 3 кафедра морфологии Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербург; 4 Вторая городская больница, Чебоксары; 5 кафедра нормальной физиологии с курсом биологической и фармацевтической химии Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева, Саранск E-mail: xalekseevxvs@mail. ru
С помощью лабораторно-биохимического анализа определяли компоненты гемокоагулирующей и фибринолити-ческой системы экстрактов ткани 14 бараньих селезенок. Селезенка отмывалась от крови путем перфузии раствором хлорида натрия в первые 6 часов (в 7 наблюдениях) или через 24-30 часов после хранения ее при комнатной температуре. Очищенные и высушенные кусочки ткани селезенки заливали десятикратным по весу раствором хлорида натрия, гомогенизировали и центрифугировали в пробирке. Для исследования использовали надосадочную жидкость. В результате проведенного исследования установлено, что экстракты ткани селезенки обладают высокой тромбопластической активностью, которая сохраняется при их разведении в 50 тысяч раз. Фибринолитические соединения селезеночной ткани менее активны, их действие исчезает при разведении экстрактов ткани селезенки в 500 раз. Наличие в ткани селезенки фермента со свойствами фибринстабилизирующего фактора плазмы повышает устойчивость фибринового сгустка к фибринолизу на 19%. Поствитальные изменения в селезенке при хранении до 24-30 часов не оказывают существенного влияния на гемокоагулирующие и фибринолитические свойства ее ткани.
Ключевые слова: селезенка, гемокоагулирующие свойства, фибринолитические свойства, гемостаз.
HEMOCOAGULATIVE AND FIBRINOLYTIC PROPERTIES OF SPLEEN TISSUE WITHIN THE NEXT FEW HOURS AFTER ITS INTAKE Kotiv B.N.1, Gaivoronsky I. V.2'3, Alekseev V.S.3'4, Ruseikin N.S.5 1 Department of Hospital Surgery, 2 Department of General Anatomy of Military Medical Academy named after
S.M. Kirov, St. Petersburg; 3 Department of Morphology of Saint-Petersburg State University, St.-Petersburg;
4 The 2-nd Town Hospital, Cheboksary; 5 Department of General Physiology with the Course of Biological and Pharmaceutical Chemistry of N.P.Ogarev Mordovia State University, Saransk
With the help of laboratory biochemical analysis we determined the components of fibrinolytic and hemocoagulative system of the tissue extracts of 14 sheep’s spleens. The spleen was washed clean from blood by perfusion with a solution of sod i-um chloride in the next 6 hours (7 cases), or after 24-30 hours of its room temperature storage. The cleaned and dried pieces of spleen tissue were embedded in tenfold by weight sodium chloride solution, homogenized, and centrifuged in a test tube. In the study we used a supernatant liquid. As a result we have established that extracts of spleen tissue have high thromboplastic activity that remains after being diluted as much as 50,000 times. Fibrinolytic compounds of spleen tissue are less active, since their effect disappears after being diluted as much as 500 times. The presence of the enzyme with the properties of fibrin stab i-lizing plasma factor has the 19% increase in the stability of fibrin clot to fibrinolysis. Postvital changes in spleen while preserving from 24 to 30 hours don’t have a significant influence on hemocoagulative and fibrinolytic properties of its tissue. Keywords: spleen, hemocoagulative properties, fibrinolytic properties, hemostasis.
В настоящее время описание гемокоагулирующих и фибринолитических свойств ткани селезенки имеется лишь в отдельных работах [1, 2]. Так, М.Ф. Меркулов [5] приводит данные исследования фибринолитической активности различных тканей, в том числе и селезенки до и после введения парааминобензойной кислоты, которая угнетает активацию плазминогена, частично подавляет действие самого плазмина и урокиназы.
Как известно, именно фибринолитическое звено тканевой противосвертывающей системы способно стимулировать локальный фибринолиз в поврежденных тканях [8]. Фибринолиз может ослабить фиксацию сгустка в ране и вызвать воз-
обновление кровотечения. Определенную роль в местном фибринолизе отводят специфическим тканевым ферментам - лизокиназам, активирующим сывороточноый плазминоген при контакте крови с поврежденными тканями [10]. Возможна непрямая стимуляция фибринолиза через систему лизокиназы - кровяной проактиватор. Баланс между активаторами и ингибиторами фибриноли-за складывается в пользу активаторов.
Ряд авторов отмечают очень низкую фибри-нолитическую активность ткани селезенки или даже ее отсутствие [5, 6, 11]. Lu X.G. и соавт. [14] изучали фибринолитическую активность ткани селезенки при помощи колориметрического ана-
лиза и обнаружили высокую активность тканевого активатора плазминогена, плазминогена и плазмина.
При этом сведения об активности гемокоагулирующих соединений экстракта ткани селезенки и кратность максимального разведения, когда они еще сохраняют свое действие, в доступной литературе отсутствуют, поскольку большинство исследователей изучали гемокоагулирующую активность ткани селезенки, используя ограниченное количество тестов. Поэтому целью нашего исследования явилось подробное изучение гемокоагулирующих и фибринолитических свойств селезенки и ее поствитальные изменений после хранения при комнатной температуре в течение суток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материал исследования составили 14 бараньих селезенок. Известно, что строение паренхимы и функция бараньей селезенки не имеют существенных морфологических отличий и функциональных особенностей по сравнению с селезенкой человека. При подготовке материала для последующего исследования требовалось очистить его от крови. Наличие в селезенке замкнутого и незамкнутого типов кровообращения представляет определенные трудности в решении этой задачи.
После острого массивного кровопускания из сонных артерий при забое животного производили забор обескровленной селезенки, сохраняя сосудистую ножку. Острая массивная кровопотеря приводила к сокращению селезенки. От оставшейся крови последнюю очищали перфузией через селезеночную артерию физиологического раствора хлорида натрия под давлением 120 мм ртутного столба по разработанному нами способу: путем периодического щадящего бимануального отжимания. Способ позволял отмыть селезенку от крови, сохраняя структуру паренхимы и получать тканевые экстракты для последующего изучения на гемокоагулирующую и фибриноли-тическую их активность [9].
Вырезанные из отмытой селезенки срезы ее паренхимы толщиной 1-2 мм дополнительно ополаскивали в физиологическом растворе хлорида натрия. На рис. 1 приведена гистологическая картина ткани селезенки.
Из кусочков селезеночной ткани удаляли капсулу и видимые на глаз сосуды, высушивали фильтровальной бумагой до “воздушно-сухого” состояния (пока они не оставляли влажных следов), взвешивали на торсионных весах, заливали десятикратным (по отношению к весу) количеством 0,9% раствора натрия хлорида, после чего гомогенизировали в ступке и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Для исследования использовали надосадочную жидкость,
Рис. 1. Гистологическая картина ткани селезенки: а - до перфузии; б - после перфузии вышеуказанным способом. Лимфатические фолликулы без отличий, красная пульпа представлена запустевшими синусоидами, выстланными эндотелием и ретикулярной стромой. Эритроциты не обнаружены. Окраска гематоси-лин-эозином (увеличение х 800).
которую в случае необходимости разводили в 100, 500, 1 000, 5 000 и более раз.
Определяли влияние экстракта селезеночной ткани на следующие показатели:
1) время рекальцификации обычной и бес-тромбоцитной плазмы по U.D. Bergerhof и L. Roka (1954);
2) потребление протромбина в рекальцифи-цируемой обычной и бестромбоцитной плазме по М.А. Котовщиковой и З.Д. Федоровой (1961);
3) толерантность плазмы к гепарину по методу Poller (1954) в модификации В.П. Балуды (1962);
4) протромбиновое (тромбопластиновое) время обычной и безакцелериновой плазмы по способу В.Н. Туголукова (1953);
5) тромбиновое время обычной плазмы и плазмы+1% раствора фибриногена по Э. Сирмаи (1957);
6) тромбиновое время гепаринизированной плазмы по Сирмаи (1957);
7) фибринстабилизирующую активность по методу В.П. Балуды, Н.А. Жуковой, Ж.Н. Рука-зенковой (1965);
8) фибринолитическую активность плазмы эуглобулиновым методом Kowarzyk и Buluk (1950) в модификации В.П. Скипетрова (1966) в
5 сериях опытов. В 1-й серии в реагирующую смесь вносили 0,1 мл соответствующего экстракта, во 2-й - это же количество добавляли к фракции эуглобулинов. В 3-й, 4-й и 5-й сериях мы изучали устойчивость фибринолитических энзимов к разведению. С этой целью к эуглобулино-вой фракции плазмы после ее растворения в буфере добавляли 0,1 мл экстракта, разведенного в 100, 500 и 1 000 раз.
Для выяснения правомочности предположения, что в ближайшее время после забоя гемоста-тические и фибринолитические свойства паренхимы селезенки резко меняются и не могут быть экстраполированы на жизнеспособные ткани нами были изучены ткани селезенки в различные сроки после забоя животного. Селезенки 7 животных, изученные в первые 6 часов после забора составили 1 группу исследований (группа 1), а селезенки 7 животных, которые изучались через 24-30 часов после хранения при комнатной температуре +18-24°С составили 2 группу (группа 2).
Для оценки статистической значимости результатов проведенного исследования был использован t-критерий Стьюдента. Расчеты были проведены с помощью программы Microsoft Excel для уровней значимости 0,05 и 0,001.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Как видно на табл. 1, экстракты селезеночной ткани баранов существенно укорачивали время рекальцификации бестромбоцитной плазмы и усиливали потребление протромбина в ней до разведения вытяжек в 50 000 раз. Экстракты селезеночной ткани исходной концентрации в группе 1 исследования укорачивали время рекальцификации в 5,81 раза, а в группе 2 в - 6,42 раза. Следовательно, экстракты селезеночной ткани содержат очень активные и устойчивые к разведению тромбопластические соединения и постви-тальные процессы, происходящие в селезенке в течение 24-30 часов после забора органа, не оказывают существенного влияния на их свойства (р>0,05). Об этом свидетельствует также действие вытяжек селезеночной ткани на толерантность плазмы к гепарину. Паренхима бараньих селезенок группы 1 ускоряла свертывание гепаринизи-рованной плазмы в 12,19 раза, а группы 2 - в 13,77 раза (табл. 2). Изучение влияния экстрактов селезеночной ткани на этот тест в первые 6 часов и через 24-30 часов после забора не выявило существенной разницы (р>0,05).
Присутствие в вытяжках антигепариновых соединений показало исследование влияния «тканевых соков» на тромбиновое время гепаринизи-рованной плазмы. В группе 1 экстракты селезеночной ткани сокращали тромбиновое время такой плазмы в 9,82 раза, в группе 2 - в 10,33 раза. Существенной разницы в связывании экзогенного гепарина изученными экстрактами также не обнаружено (р>0,05).
Вытяжки селезеночной ткани в обеих группах одинаково влияли и на 2-ю фазу гемокоагуляции. Они укорачивали протромбиновое время обычной плазмы соответственно на 30,6% и 34,5% (р>0,05) и ускоряли переход протромбина в тромбин в плазме с дефицитом Ас-глобулина. Добавление к безакцелериновой плазме 0,1 мл экстракта селезеночной ткани исходной концентрации сокращало протромбиновое время плазмы без фактора V соответственно группам исследований на 59,52% и 60,36%. Это указывает на наличие в вытяжках фактора, подобного Ас-глобулину плазмы, который почти не теряет свою активность в процессе хранения изъятой бараньей селезенки при комнатной температуре в течение 24-30 часов (р>0,05).
Экстракты ткани селезенки барана обладали антикоагулянтной активностью, замедляя процесс превращения фибриногена в фибрин. Как видно из табл. 2, под воздействием вытяжки селезеночной ткани тромбиновое время обычной плазмы удлиняется в группах 1 и 2 соответственно
Таблица 1
Результаты изучения тромбопластической активности экстрактов ткани бараньей селезенки
Исследуемые параметры (в сек.) Статистические показатели Контроль Р а з в е д е н и е э к с т р а к т о в
о 0 о 0 о 5 1 000 5 000 10 000 50 000 0 0 о о 0 0 0 о о 0 2
Группа 1
Время рекальцификации в бестромбоцитной плазме М ±т р 2 0 21 1,0 22 1,3 32 1,7 39 3,3 60 4,8 <0,001 78 5,9 <0,001 104 6,1 <0,05 114 6,6 >0,05 116 7,8 >0,05
Потребление протромбина в бестромбоцитной плазме М ±т р 30 1,0 511 4,8 187 3,7 121 4,0 84 3,2 62 3,0 <0,001 59 3,1 <0,001 40 2,5 <0,01 35 2,8 >0,05 30 3,1 >0,05
Группа 2
Время рекальцификации в бестромбоцитной плазме М ±т р 2 0 13 19 1,1 20 1,2 28 2,1 35 3,7 56 5,2 <0,001 73 6,8 <0,001 100 5,8 <0,05 110 6,5 >0,05 111 6,8 >0,05
Потребление протромбина в бестромбоцитной плазме М ±т р 30 1,0 518 5,0 218 4,3 118 4,8 103 3,5 63 2,2 <0,001 48 2,0 <0,001 39 2,3 <0,05 36 2,4 >0,05 31 2,9 >0,05
на 53,22% и 51,19% (разница между ними статистически недостоверна) (р>0,05). Тромбиновое время 1% раствора фибриногена в группах увеличивалось соответственно на 46,25% и 67,08%. Таким образом, антикоагулянтная активность при хранении изъятой селезенки барана при комнатной температуре в течение 24-30 часов не снижалась.
Вытяжки ткани селезенки обладали фибри-назным действием. Тканевая фибриназа экстрактов селезенки удлиняла время растворения фибрин-полимера в группе 1 и в группе 2 соответственно на 21,17% и 15,31% (р>0,05).
Экстракты ткани селезенки оказывали также фибринолитическое действие. Как следует из табл. 3, в 1-й серии опытов вытяжки селезенки баранов группы 1, в отличие от вытяжек селезенки группы 2, проявляли более низкую фибрино-литическую активность. В группе 1 ткань селезенки ускоряла лизис эуглобулинового сгустка в 2,16 раза, а в группе 2 в - 2,40 раза (р>0,05). При внесении такого же объема экстракта селезенки прямо в эуглобулиновую фракцию контрольной плазмы (2-я серия) лизис стимулировался почти одинаково, соответственно в 1,68 и 1,63 раза (р>0,05) быстрее, но меньше, чем в предыдущей серии исследований, что указывает на наличие в обоих экстрактах ингибиторов фибринолиза, однако активность последних меньше активаторов.
Данные 3-й, 4-й и 5-й серии исследования выявили, что тканевые фибринолитические соединения селезеночной паренхимы барана неустойчивы к разведению: экстракты стимулировали фибринолиз в обеих группах исследования только до разведения в 500 раз.
При сравнении фибринолитической активности селезеночной ткани в группах существенных расхождений не обнаруживали. Фибринолитиче-ские факторы, как и тканевые факторы гемокоагуляции, сохраняли свою активность через 24-30 часов после хранения селезенки при температуре от +18-24° С.
Проведенные исследования показали, что ткань селезенки содержит очень активные и стойкие к разведению тромбопластические субстанции. Они сохраняются в течение 30 часов после забора селезенки и проявляют свою активность при разведении экстракта ткани селезенки даже в 50 тысяч раз. Б.Е. Кокулин и соавт. [3] изучали активность тромбопластина серого вещества головного мозга. Ими установлено, что мозговой тромбопластин до 12, через 12-24, 25-48 часов обладает одинаковой активностью. В более поздние сроки после смерти активность его уменьшается.
Определение тромбинового времени указывает на наличие в селезеночной ткани также естественных ингибиторов свертывания. Экстракты
Таблица 2
Результаты изучения влияния экстрактов ткани бараньей селезенки на некоторые показатели
свертывающей системы крови
Исследуемые параметры (в сек.) Статистические показатели Контроль Опыт
Группа 1 Группа 2
M 308,5 25,3 22,4
Толерантность плазмы к гепарину ±m 8,5 12,1 5,8
P < 0,001 <0,001
M 28,4 19,7 18,6
Протромбиновое время обычной плазмы ±m 0,2 0,9 1,1
P <0,001 <0,001
M 83,0 33,6 32,9
Протромбиновое время плазмы без фактора V ±m 7,0 4,3 4,5
P <0,001 <0,001
M 29,5 45,2 44,6
Тромбиновое время обычной плазмы ±m 0,5 5,1 6,1
P <0,05 <0,05
M 24,0 35,1 40,1
Тромбиновое время +1% раствора фибриногена ±m 1,0 2,3 3,1
P <0,01 <0,01
M 117,8 12,0 11,4
Антигепариновая активность ±m 6,7 5,9 4,8
P <0,001 <0,001
M 75,1 91,0 86,6
Фибриназа ±m 1,0 2,5 2,2
P <0,01 <0,01
Таблица 3
Фибринолитическая активность экстрактов ткани бараньей селезенки (в мин.)
Изучаемые экстракты Статистические показатели Контроль С е р и я о п ы т о в
1-я 2-я 3-я 4-я 5-я
М 170,0 73,4 101,2 123,5 150 158,7
Группа 1 ±m 2,0 16,3 15,5 13,3 7,8 11,0
р <0,01 <0,01 <0,05 <0,05 >0,05
М 170,0 70,9 104,3 128,5 150,3 162,5
Группа 2 ±m 2,0 19,5 13,2 13,8 7,6 9,5
р <0,01 <0,01 <0,05 <0,05 >0,05
ткани селезенки барана обладают антикоагулянт-ной активностью и замедляют процесс превращения фибриногена в фибрин. Monkhouse Frank C. с соавт. [12] в экстрактах ткани сердца, селезенки и печени обнаружил лишь незначительное содержание гепарина, в легких и почках - несколько больше. Активность гепарина у крыс была меньше, чем у коров и собак.
Изучение фибринолитических свойств подтверждает содержание в ткани селезенки наряду с активаторами и ингибиторов фибринолиза. Естественные антикоагулянты и активаторы фибри-нолиза нестойки к разведению и быстро теряют активность при разведении соответственно в 10 и в 500 раз, что подтверждают выводы ряда исследователей о низкой фибринолитической активно-
сти ткани селезенки [5, 6, 11].
О присутствии почти во всех тканях соединения со свойствами фибриназы констатировал
В.П. Скипетров [7, 8]. Тканевая фибриназа обнаруживается также в вытяжках ткани селезенки. Она повышает устойчивость фибринового сгустка к фибринолизу и удлиняет время растворения фибрин-полимера на 21,17%. Lorand Ь. и Бюкеп-тап Я. [13] отмечают, что при комнатной температуре активность фактора XIII плазмы существенно снижается лишь на 2-3-й день хранения.
Проведенные опыты также показали, что по-ствитальные изменения в селезенке до 30 часов не оказывают влияния на активность гемокоагулирующих и фибринолитических соединений селезеночной ткани. На фоне сложного взаимодей-
ствия различных тканевых факторов свертывания, стимуляция гемостаза тканевым тромбопласти-ном все же является преобладающей. К аналогичному выводу приходят и другие исследователи [2,
4, 8].
Таким образом, при повреждении ткани селезенки в рану поступают коагулирующие или фиб-ринолитические агенты. Высокая активность и стойкость к разведению тромбопластических и других факторов свертывания приводит к образованию в месте повреждения сгустка крови. Об этом свидетельствуют полученные результаты изучения влияния экстрактов из ткани селезенки барана на показатели свертывающей системы крови (толерантность плазмы к гепарину, про-тромбиновое и тромбиновое время обычной плазмы, тромбиновое время 1% раствора фибриногена, антигепариновая активность) и клинические наблюдения спонтанного гемостаза при повреждениях селезенки. Наличие в ткани селезенки фермента со свойствами фибринстабилизиру-ющего фактора плазмы способствует адгезии, стабилизации фибринового сгустка и более прочной его фиксации в ране. В случаях незначительных повреждений селезенки кровотечение останавливается.
Следует полагать, что в целом гемостаз селезенки обусловлен не только особенностями тканевой коагуляционно-литической системы, но и степенью повреждения, состоянием тромбоци-тарного и плазменного звеньев гемостаза.
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Ткань селезенки обладает высокой тромбопластической активностью, которая сохраняется при разведении экстрактов в 50 тысяч раз. Активность тканевых антикоагулянтов и ингибиторов свертывания крови низка и не проявляется при разведении тканевых экстрактов в 10 раз.
2. Фибринолитические соединения селезеночной ткани менее активны, их действие исчезает при разведении экстрактов ткани селезенки в 500 раз. Наличие в ткани селезенки фермента со свойствами фибринстабилизирующего фактора плазмы повышает устойчивость фибринового сгустка к фибринолизу на 21%.
3. Поствитальные изменения в селезенке при хранении до 24-30 часов не оказывают суще-
ственного влияния на гемокоагулирующие
и фибринолитические свойства ее ткани.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. - М. : Ньюдиамед, 2001. - 296 с.
2. Бышевский А.Ш., Зубаиров Д.М., Терсенов О.А. Тромбопластин. - Новосибирск, 1993. - 180 с.
3. Кокулин Б.Е., Тарасова Л.Н., Носов П.Л. Некоторые факторы, влияющие на активность лабораторного тромбопластина // Лабор. дело. - 1971. -№ 6. - С. 341-343.
4. Колесников B.C. Тромбопластиновая коагулопатия у больных с политравмой // Хирургия. - 2002. -№ 9. - С. 41-44.
5. Меркулов М.Ф., Малюгина И.Б. Влияние параами-нобензойной кислоты на фибринолитическую активность различных тканей // Фармакология и токсикология. - 1968. - Т. 31, № 5. - С. 605-607.
6. Никитин Ю.П., Табаровская Т.А. Фибринолитиче-ская активность тканей крыс // Бюлл. экспер. биол. - 1969. - № 6. - С. 19-21.
7. Скипетров В.П. Роль тканевых факторов в локальном гемостазе // Пробл. гемат. и пер. крови. -1968. - № 6. - С. 27-31.
8. Скипетров В.П., Власов А.П., Голышенков С.П. Коагуляционно-литическая система тканей и тромбогеморрагический синдром в хирургии. -Саранск, 1999. - 232 с.
9. Способ отбора и подготовки лабораторного материала из селезеночной ткани для последующего исследования : Российская Федерация МПК G01N 1/28 (2008.01) / В.С. Алексеев, П.Б. Карышев
С.А. Алексеев. - № 2303249; опубл. 20.07.2007, БИ № 20.
10. Тищенко В.В. Двухмоментные разрывы селезенки // Хирургия. - 1990. - № 9. - С. 62-65.
11. Юнусов Р.В. Сравнительное изучение свойств тканевых активаторов плазминогена человека // Ка-занск. мед. журнал. - 1974. - № 2. - С. 35-36.
12. Monkhouse F.C., Mackneson R.G., Bambers G. Ex-
tractable heparin levol in rat tissues under normal and experimental conditions // Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med. - 1957. - Vol. 95, N 3. - P. 489-492.
13. Lorand L., Dickenman R. Assay Method for the “Fi-
brin-Stabiliring Factor” // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1955. - Vol. 89, N 1. - P. 45-48.
14. Lu X.G., Wu X.G., Xu X.H., Gong X.B., Zhou X., Xu
G.B., Zhu L., Zhao X.Y. Novel distribution pattern of fibrinolytic components in rabbit tissues extract: a preliminary study // J. Zhejiang Univ. Sci B. - 2007. -Vol. 8, N 8. - Р. 570-574.
