CC BY
155
УДК 612.235:616-001.18
ГАЗОТРАНСПОРТНЫЙ ОБМЕН В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ОБЩЕМ ОХЛАЖДЕНИИ
ОРГАНИЗМА
М.М.Луценко
Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН, 675000,
г. Благовещенск, ул. Калинина, 22
РЕЗЮМЕ
Цель исследования - в экспериментальных условиях изучить характер изменений кислотнощелочного баланса и биоэнергетических процессов в эритроцитах периферической крови кроликов при общем охлаждении организма. Установлено, что в результате ежедневного, на протяжении от 15 до 30 дней, охлаждения подопытных животных в течение трех часов при температуре -30°С, pH крови кроликов к 30-му дню эксперимента снижается до 7,34±0,013, а рС02 в крови увеличивается до 49,5 мм рт. ст. В эритроцитах периферической крови снижается содержание аденозинтрифосфор-ной кислоты до 0,34±0,06 мкмоль/мл (контроль -
0,65±0,07 мкмоль/мл), а концентрация 2,3-дифосфо-глицерата увеличивается до 6,9 мкмоль/мл, происходит снижение насыщения гемоглобина эритроцитов кислородом до 96,0±3,2% (контроль -99,5±3,0%) что приводит к формированию гипокси-ческого состояния в организме подопытных животных. Таким образом, охлаждение организма подавляет энергетические процессы в эритроцитах периферической крови и вызывает метаболический ацидоз.
Ключевые слова: газовый и метаболический обмен,
2,3-дифосфоглицерат, аденозинтрифосфорная кислота, парциальное давление углекислого газа, общее охлаждение организма.
SUMMARY
GAS-TRANSPORT METABOLISM IN THE PERIPHERAL BLOOD AT GENERAL COOLING OF THE ORGANISM
M.M.Lutsenko
Far Eastern Scientific Center of Physiology> and Pathology> of Respiration of Siberian Branch RAMS,
22 Kalinina Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation
The aim of the research is to study in experimental conditions the character of changes of acid-base balance and bioenergetic processes in erythrocytes of the peripheral blood of rabbits at general cooling of the organism. It is established that as a result of daily cooling (from 15 till 30 days) of animals under experiment during three hours at temperature -30°C pH of rabbits blood falls to 7.34±0.013 by the 30th day of the experiment, and the quantity of pC02 in blood increases to
49.5 mm of mercury. The quantity of adenosinetriphos-phoric acid in erythrocytes of the peripheral blood decreases to 0.34±0.06 mkmole/ml (control - 0.65±0.07 mkmole/ml), and the concentration of 2.3-biphosglyc-erate increases to 6.9 mkmole/ml. There is a drop of hemoglobin erythrocytes oxygenation to 96.0±3.2% (control - 99.5±3.0%), which leads to hypoxia in the organism of animals under experiment. Thus, the cooling of the organism suppresses energetic processes in erythrocytes of the peripheral blood and causes metabolic acidosis.
Key words: gas and metabolic processes, 2.3-biphos-phoglycerate, adenosinetriphosphoric acid, partial pressure of carbon dioxide, general cooling of the organism.
Процесс очищения внутри- и внеклеточной жидкости от продуктов метаболизма оказывается возможным благодаря наличию непрерывного потока внеклеточной жидкости в венозное русло и приход на ее место из сосудистого русла (артериальные капилляры) во внеклеточную жидкость очищенных порций для формирования обновленной тканевой среды.
Процессы «самоотравления», связанные с метаболизмом тканей и процессы восстановления, связанные с функцией выделительных систем и органов, находятся в тесной зависимости с метаболизмом кислот и оснований. При этом важную роль играют буферные системы организма, удерживающие активную реакцию его жидкостей на уровне «нормы». Если патологические процессы нарушают это равновесие, в жизненно важных органах наступают тяжелые метаболические отклонения. Кислотно-щелочное равновесие - прежде всего, постоянство водородного показателя (pH) внутренней среды организма, обусловленное совместным действием буферных и некоторых физиологических систем, определяющих полноценность метаболических превращений в клетках организма. Изменение показателя кислотно-щелочного равновесия свидетельствует о нарушениях газового обмена и метаболических процессов в организме и о степени их тяжести. Диапазон колебаний pH крови: от 7,37 до 7,44; средняя величина - 7,4. Кислотно-щелочное равновесие оказывает непосредственное влияние на устойчивость мембран эритроцитов периферической крови и на их биоэнергетику [1].
По мере старения эритроцитов происходит уменьшение способности к восстановлению метгемоглобина в гемоглобин, что вероятно связано с понижением способности эритроцита к гликолизу и, особенно, к образованию никотинамиддинуклеотид-фосфата
(НАДФН). Наиболее важным моментом в обмене эритроцита является способность 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ), образующегося в результате расщепления глюкозы, регулировать сродство гемоглобина к кислороду [2-5].
По мере старения эритроцита содержание 2,3-ДФГ увеличивается и зависит от взаимоотношения ферментов, участвующих в реакциях образования и распада этого соединения. 2,3-ДФГ связан с мембраной эритроцита и участвует в переносе неорганического фосфора внутрь клетки. Количество 2,3-ДФГ во многом зависит от уровня аденозиндифосфата (АДФ), из которого он формируется с одновременным образованием аденозинтрифосфата (АТФ).
Накопление 2,3-ДФГ увеличивается при повышении концентрации метгемоглобина и связанным с этим увеличением окисления НАДФН, поскольку НАДФН-метгемоглобинредуктаза восстанавливает метгемогло-бин. Таким образом, в регуляции уровня 2,3-ДФГ в эритроцитах принимает участие активность ферментов, концентрация метаболитов, pH. Оценивая старение и функцию эритроцитов периферической крови, мы должны, прежде всего, обратить внимание на содержание в них таких ключевых веществ как АТФ, 2,3-ДФГ, неорганического фосфора, определяющих не только строение, но и основную функцию - перенос газов крови.
Цель работы - анализ кислотно-щелочного баланса и биоэнергетических свойств эритроцитов при общем охлаждении организма.
Материалы и методы исследования
Работа проводилась на кроликах породы шиншилла весом от 1,5 до 2,0 кг. Подопытные животные были разделены на следующие группы: контрольная группа - 25 интактных кроликов; 1 группа - 30 животных, подвергшихся охлаждению в течение 5 дней при температуре -30°С по 3 часа ежедневно; 2 группа - 30 кроликов, которых охлаждали в течение 15 дней при температуре -30°С по 3 часа ежедневно; 3 группа - 30 животных, подвергшиеся охлаждению в течение 30 дней при температуре -30°С по 3 часа ежедневно.
Охлаждение проводилось в климатокамере «ILKA» 3101 (Германия). По истечении срока эксперимента животных забивали путем воздушной эмболии.
Кислотно-щелочной баланс определяли на анализаторе газов крови и электролитов «Chiron» (США). Содержание внутриэритроцитарного 2,3-ДФГ, АМФ, АДФ, АТФ, неорганического и органического фосфора оценивали спектрофотометрическим методом по И.С.Луганову (1975). Метгемоглобин, оксигемоглобин и общий гемоглобин определяли спектрофотометрическим методом по М.С.Кушаковскому (1968).
Протокол экспериментальной части исследования на этапах содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта соответствовал принципам биологической этики, изложенным в Международных рекомендациях по
проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985), Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986), Приказе М3 СССР №755 от 12.08.1977 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных», Приказе М3 РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».
Результаты исследования и их обсуждение
Мы проведи тщательный анализ показателей, отражающих характер кислотно-щелочного равновесия в периферической крови кроликов, подвергавшихся общему охлаждению при температуре -30°С продолжительностью от 5 до 30 дней. Установлено, что после длительного воздействия низких температур на организм животных, у них отмечалась тенденция к неуклонному снижению pH периферической крови. Так, если в норме средние значения pH крови до охлаждения составляли 7,42±0,006, то через 15 дней эксперимента этот показатель был в пределах 7,39±0,013 (р<0,05), а через 30 дней охлаждения - 7,34±0,014 (р<0,05). Такое состояние следует рассматривать как компенсированный метаболический ацидоз.
Продолжая анализировать другие показатели, характеризующие кислотно-щелочное равновесие в этих условиях, мы установили, что при охлаждении организма повышается уровень рСОо в периферической крови животных по мере удлинения сроков общего охлаждения организма при температуре -30°С. Так, после 15-дневного охлаждения в периферической крови кроликов содержание рСОо нарастало до 42,7±2,9 мм рт.ст., а на 30-й день эксперимента рСОо достигало 49,5 мм рт.ст. Это свидетельствует о том, что при общем охлаждении в организме развивается метаболический ацидоз. Одновременно при охлаждении организма животных в течение 30 дней наблюдается снижение напряжения кислорода в периферической крови до 35,0±1,2 мм рт.ст. (у интактных животных -46,5±2,1 мм рт.ст.). Таким образом, общее охлаждение организма является фактором, приводящим к явлениям метаболического ацидоза и служит плохим предвестником для нормальной работы всей сердечно-сосудистой системы.
Исследуя биоэнергетические свойства эритроцитов периферической крови кроликов в условиях общего охлаждения организма мы обнаружили, что по мере продолжительности опыта происходили существенные сдвиги в синтезе гемоглобина Так, количество общего и оксигемоглобина достоверно снижалось в сравнении с показателями в контрольной группе уже через 5 дней после начала охлаждения, а к 30-му дню эксперимента указанные параметры были максимально снижены в сравнении с показателями в группе интактных кроликов (табл. 1).
Таблица 1
Показатели, характеризующие биоэнергетические процессы в эритроцитах периферической крови кроликов при общем охлаждении организма (М±т)
Показатели Экспериментальные группы
Контрольная 1 группа 2 группа 3 группа
Общий гемоглобин, г/л 13,20±8,2 12,66±4,5* 11,45±6,1* 11,10±5,0*
Оксигемоглобин, % 99,5±3,0 98,5±2,5* 97,0±3,9* 96,0±3,2*
Метгемоглобин, % 0,50±0,06 0,55±0,04 0,65±0,09* 1,35±0,20*
Фосфор неорганический, мкмоль/мл 0,050±0,003 0,064±0,003* 0,088±0,003* 0,090±0,007*
Фосфор органический, мкмоль/мл 0,099±0,002 0,097±0,003* 0,062±0,003* 0,056±0,004*
2,3-ДФГ, мкмоль/мл 5,80±0,4 6,10±0,3* 6,30±0,5* 6,95±0,4*
АМФ, мкмоль/мл 1,35±0,4 0,89±0,01* 0,93±0,15* 1,2±0,08*
АДФ, мкмоль/мл 1,39±0,08 1,0±0,07* 0,8±0,06* 0,6±0,15*
АТФ, мкмоль/мл 0,65±0,07 0,60±0,04 0,49±0,06* 0,34±0,06*
Примечание'. * - различия с показателями контрольной группы статистически значимы при р(1:)<0.05; р(Г)<0,05.
Наряду с этим при воздействии холода в эритроцитах периферической крови животных отмечалось нарастание процентного содержания метгемоглобина в зависимости от длительности охлаждения организма. Так, через 15 дней эксперимента концентрация метге-моглобина статически достоверно превышала значения в крови интактных животных, а через 30 дней содержание метгемоглобина в сравнении с контрольной группой было повышено почти в 3 раза (табл. 1). Поскольку уровень оксигемоглобина при этом был значительно снижен и наступала гипоксия, увеличение в эритроцитах метгемоглобина можно считать закономерным, так как происходит нарушение работы метге-моглобинредуктазы.
На фоне общего охлаждения организма в эритроцитах происходило снижение статистически достоверное снижение содержания АТФ и АДФ, при увеличении концентрации АМФ и неорганического фосфата. Увеличение АМФ является фактором, способствующим активизации гексокиназы, пускового фермента гликолиза - поставщика АТФ в эритроцитах. Так, на 30-й день гипоксии, в процессе адаптации, у кроликов повышалось содержание АМФ, приближаясь к нормальному уровню, установленному у интактных кроликов. При этом количество АДФ было снижено (табл. 1). Поступление в эритроциты неорганического фосфора значительно увеличивалось уже на 5-й день эксперимента, достигая максимума через 30 дней. Можно предполагать, что это связано с реакцией гидролиза АДФ. У животных в условиях воздействия хо-
лода содержание АТФ, основного энергетического продукта эритроцитов, к 30-му дню исследования снижалось фактически в 2 раза в сравнении с интактными кроликами (табл. 1).
Вероятно, в условиях общего охлаждения организма эти энергетические изменения происхо-
дят за счет повышения содержания катехоламинов. Большую роль в метаболизме эритроцитов играет побочный путь расщепления глюкозы с образованием
2,3-ДФГ. Основное значение этого соединения состоит в регуляции сродства гемоглобина к кислороду. Увеличение концентрации 2,3-ДФГ в эритроцитах ведет к снижению сродства гемоглобина к кислороду путем образования 2,3-ДФГ+НЬ, этот процесс обеспечивает ткани кислородом в условиях начинающейся гипоксии. При исследовании эритроцитов периферической крови у подвергавшихся длительному охлаждению кроликов мы отметили, что содержание 2,3-ДФГ в эритроцитах статистически достоверно увеличивалось в сравнении с показателями у интактных кроликов (табл. 1). Отдача кислорода гемоглобином резко снижалась, что и определяет формирование тканевой гипоксии.
В результате изучения кривой Прайс-Джонса, построенной компьютерным методом, установлено, что диаметр эритроцитов резко изменялся в условиях эксперимента со сдвигом в левую сторону, то есть увеличивалось процентное содержание эритроцитов с меныпим диаметром (табл. 2).
Таблица 2
Формулы эритроцитов периферической крови животных из различных экспериментальных групп (%)
Тип клетки Микро Нормо Макро Всего
Интактное животное из контрольной группы
Дискоциты 4,3 81,4 0,0 85,7
Эхиноциты 1,0 1,9 0,0 2,9
Мишеневидные 0,0 0,5 0,0 0,5
Укушенные 0,0 1,4 0,0 1,4
Дегенеративные 2,4 7,1 0,0 9,5
Всего 7,7 92,3 0,0
Животное из 1 группы, подвергшееся охлаждению в течение 5 дней
Дискоциты 9,6 70,6 0,0 80,1
Эхиноциты 2,3 4,9 0,0 7,2
Каплевидные 0,2 0,2 0,0 0,4
Мишеневидные 0,0 0,4 0,0 0,4
Укушенные 0,0 0,1 0,0 0,1
Сфероциты 0,0 0,1 0,0 0,1
Дегенеративные 1,5 10,1 0,0 11,6
Всего 13,6 86,4 0,0
Животное из 2 группы, подвергшееся охлаждению в течение 15 дней
Дискоциты 7,7 67,5 0,0 75,1
Эхиноциты 2,4 8,0 0,0 10,3
Каплевидные 0,1 1,0 0,0 1,1
Мишеневидные 0,2 0,8 0,0 1,0
Укушенные 0,1 0,1 0,0 0,2
Сфероциты 0,0 0,2 0,0 0,2
Дегенеративные 1,4 10,7 0,0 12,1
Всего 11,9 88,3 0,0 12,1
Животное из 3 группы, подвергшееся охлаждению в течение 30 дней
Дискоциты 14,9 43,1 0,0 58,0
Эхиноциты 8,9 12,0 0,0 20,9
Мишеневидные 0,3 2,6 0,0 2,9
Укушенные 0,3 1,1 0,0 1,4
Дегенеративные 6,3 10,6 0,0 16,9
Всего 30,7 69,4 0,0
Одновременно, на основании компьютерной обработки качества эритроцитарной фигуры, мы смогли показать, что все описанные нами ранее в предыдущих исследованиях изменения эритроцитов (состав фосфолипидов, перекисное окисление мембран эритроцитов, нарушение энергетического обмена) тяжело отража-
лись на общем строении этих элементов (табл. 3). К 30-му дню эксперимента на 86,2% увеличивалось число эхиноцитов по сравнению с интактными животными; почти вдвое увеличивалось число дегенеративных форм эритроцитов.
Таблица 3
Средние значения процентного содержания различных типов эритроцитов кролика в
экспериментальных группах (М±т)
Экспериментальные группы Типы эритроцитов, %
Дискоциты Эхиноциты Мишеневидные Дегенеративные Укушенные
Контрольная группа 85,7±1,7 2,9±0,3 0,5±0,01 9,5±0,4 1,4±0,08
1 группа 80,1±2,1* 7,6±0,5* 0,4±0,02 11,7±0,5* 0,1±0,003*
2 группа 75,1±3,2* 11,4±0,8* 1,0±0,05* 12,3±0,9* 0,2±0,01*
3 группа 58,0±1,7* 20,9±1,2* 2,9±0,06* 16,9±1,2* 1,4±0,03
Примечание: * - различия с показателями контрольной группы статистически значимы при р(1:)<0.05; р(Р)<0,05.
В периферической крови на 30-й день эксперимента увеличивалось число эритроцитарных конгломератов (рис.).
Рис. Галерея эритроцитов из мазка периферической крови кролика, выполненного на 30-й день охлаждения при температуре -30°С по 3 часа ежедневно. Отчетливо видны многочисленные конгломераты эритроцитов. Мазок обработан с помощью компьютерной видеосистемы «Меков».
Таким образом, длительное охлаждение организма экспериментальных животных при температуре -30°С приводило к ощутимому снижению pH в периферической крови при одновременном существенном увеличении рСОо, к 30-му дню охлаждения в организме кроликов формировался метаболический ацидоз. На фоне метаболического ацидоза в эритроцитах периферической крови животных, подвергавшихся длительному охлаждению при температуре -30°С, увеличивалось содержание 2,3-ДФГ, что препятствует
насыщению гемоглобина кислородом. Количество ок-сигемоглобина к 30-му дню охлаждения организма кроликов значительно снижалось, а содержание мет-гемоглобина увеличивалось в три раза в сравнении с интактными животными. Такие изменения в биоэнергетике эритроцитов приводят к формированию в организме гипоксического состояния.
ЛИТЕРАТУРА
1. Андриевская И.А., Луценко М.Т. Диагностика резистентности мембран эритроцитов к окислительному стрессу у беременных с герпесной патологией // Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2009. Вып.ЗЗ. С.21-24.
2. Bauer С. Antagonistic influence of Со2 and 2,3 diphosphoglycerate on the Bohr effect of human haemoglobin // Life Sci. 1969. Vol.8, №20. P.1041-1046.
3. Perutz M.F, Mazzarella L. A Preliminary X-ray analysis of haemoglobin H//Nature. 1963. Vol.199. P.639.
4. Rorth M. Hemoglobin interactions and red cell metabolism // Ser. Haematol. 1972. Vol.5, №1. P.l-104.
5. Rorth М., Astrup P. (eds.). Oxygen affinity of hemoglobin and red cell acid base status. Copenhagen: Munks-gaard, 1972. 832 pp.
REFERENCES
1. Andrievskaya I.A., Lutsenko M.T. Bulleten' fiziologii ipatologii dyhaniyd 2009; 33:21-24.
2. Bauer C. Antagonistic influence of Co2 and 2,3 diphosphoglycerate on the Bohr effect of human haemoglobin Life Sci. 1969; 8(20):1041-1046.
3. Perutz M.F, Mazzarella L. A Preliminary X-ray analysis of haemoglobin H. Nature 1963; 199:639.
4. Rorth M. Hemoglobin interactions and red cell metabolism. Ser Haematol. 1972; 5(1): 1-104.
5. Rorth М., Astrup P., editors. Oxygen affinity of hemoglobin and red cell acid base status. Copenhagen: Munksgaard; 1972.
Поступила 23.03.2012
Контактная информация
Михаил Михайлович Луценко, младший научный сотрудник лаборатории механизмов этиопатогенеза и восстановитечьных процессов дыхательной системы при НЗЛ, Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН,
675000, г. Благовещенск, ул. Калинина, 22.
E-mail: Lucencomt@mail.ru Correspondence should be addressed to Mikhail M. Lutsenko,
MD, Junior staff scientist of Laboratory of Etiopathogenesis Mechanisms and Recoveiy Processes of the Respiratory System at Non-Specific Pulmonaiy Lung Diseases, Far Eastern Scientific Center of Physiology> and Pathology> of Respiration SB RAMS, 22 Kalinina Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation.
E-mail: Lucencomt@mail.ru
