CC BY
30
"О LO
ГАСТРОПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА АНАЛОГОВ ГЕФАРНАТА С АТОМАМИ КИСЛОРОДА В СПИРТОВОЙ ЦЕПИ
Белостоцкий Н. И.1, Нигматов А. Г.2, Серебряков Э. П.2
1 ГУ Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии ДЗ г. Москвы
2 Институт органической химии РАН им. Н. Д. Зелинского, Москва
Белостоцкий Николай Игоревич E-mail: gastroenter@rambler.ru
РЕЗЮМЕ
Цель исследования: изучение гастропротекторных свойств аналогов гефарната с несколькими кислородными функциями на двух моделях экспериментальной язвы желудка у крыс. Материал и методы. Опыты были проведены на 175 крысах самцах с массой тела 250-300 г. Адреналиновые поражения слизистой желудка воспроизводились путем однократного внутрибрюшинного введения 2 мг/кг адреналина гидрохлорида. Забой животных проводился через 24 ч. Проводилась оценка площади геморрагических поражений слизистой желудка в мм2. Ацетатная язва воспроизводилась по методу Okabe аппликацией уксусной кислоты на серозную оболочку передней стенки желудка в течение 60 с. Исследуемые препараты вводились в/б и в/ж при адреналиновых поражениях за 2 ч до введения адреналина, а при ацетатной язве — со вторых суток после аппликации уксусной кислоты. Проводилось определение гликозаминогликанов в гомогенатах СОЖ электрофоретическим методом.
Результаты: Показано наличие выраженного профилактического эффекта у ряда эфиров фарнези-луксусной кислоты, а также наличие лечебного эффекта у эфира 3 на модели ацетатной язвы желудка. Эффект зависел от дозы препарата и от пути введения.
Ключевые слова: экспериментальная язва желудка (адреналиновая, ацетатная); гефарнат; фарне-зилуксусная кислота; эфиры фарнезилуксусной кислоты; профилактика язв желудка; лечение язв желудка.
SUMMARY
We assessed the effects of some gefarnate analogs on gastric ulcer prophylaxis (adrenaline ulcers) and ulcer healing (acetic ulcers) and some secretory parameters in rats. Acute ulcers were induced in male Wistar rats by intraperitoneal injection of 2 mg/kg adrenaline hydrochloride. Rats were killed after 24 hours. Chronic gastric ulcers were induced in rats by application of 100% acetic acid to the serosal surface of the stomach on 60 sec. Gefarnate analogs introduced intraperitoneally or intragastrically. Gefarnate analogs dose-dependently increase the healing of gastric ulcers and have a marked prophylaxis effects especially in the case of adrenaline ulcers.
Keywords: experimental gastric ulcer (adrenal, acetate); gefarnat; farnezilacetum acid; esters of the farnezilacetum acid; prevention of gastric ulcers; treatment of stomach ulcers.
Гераниловый эфир 4Е, 8Е-фарнезилуксусной кислоты (Гефарнат-1) является основой препарата «гефарнил», используемого в лечении гастродуоде-нальных язв [1]. У млекопитающих in vivo гефарнил быстро превращается в СО2 и Н2О без образования вредных продуктов [2-4]. Накопление препарата максимально происходит в желудке и двенадцатиперстной кишке [3]. Наибольшей антиульце-рогенной активностью обладает первый продукт
метаболизации эфира 1 — Е, Е-фарнезилуксусная кислота (ФУК). При введении ФУК в желудок развитие язв подавляется в дозах в 100-800 раз меньших, чем под воздействием эфира-1. Метаболическая устойчивость ФУК значительно ниже, чем у гефарната [3]. Наличие гастропротекторных свойств у гидрофобных эфиров ФУК свидетельствует о том, что носителем активности является ацильный фрагмент А.
Цель работы: сравнительное изучение гастро-протекторной способности аналогов гефарната с несколькими кислородными функциями (производные ФУК с этилкарбитолом, бутилкарбитолом, бутилтриэтиленгликолем, глицерином и диэтилен-гликолем) с активностью гефарната на двух моделях экспериментальной язвы желудка у крыс.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проведены на 175 крысах самцах с массой тела 200 - 250 г.
Ульцерогенный фактор — адреналин гидрохлорид. Крысы были разделены на пять групп по пять особей в каждой. Голодавшим 24 ч крысам проводились внутримышечные инъекции: в контроле — оливковое масло 0,5 мл, остальные группы — растворы гефарната (эталон) и эфи-ров 3, 6 и 8 в оливковом масле в дозах 100 мг/ кг для эфиров 3 и 6 и 1000 мг/ кг для эфира 8. Через 2 часа после введения препаратов всем животным внутрибрюшинно вводился водный раствор адреналина в дозе 2 мг / кг [5]. Через 24 часа животных забивали, исследовали частоту возникновения язв и определяли индекс изъязвления стенки желудка и степень ингибирования ульцерогенеза (в процентах) гефарнатом и соединениями 3, 6 и 8 (табл. 1). Степень изъязвления стенок желудка определялась макроскопически [5]. Степень ингибирования язвообразования определялась по формуле:
И (О/о) = 100- (Рк - Р0) / Рк, где Рк и Р0 — индекс изъязвления в мм2 в контрольной и опытных группах соответственно (табл. 1).
Ацетатная язва воспроизводилась по методу [6] аппликацией уксусной кислоты на переднюю стенку желудка в течение 60 с. Заживление язв у крыс без лечения отмечалось визуально через 15-30 суток после индукции язв. Лечение подопытных животных эфиром 3 проводилось при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении препарата в виде растворов в оливковом масле (по 0,5 мл) начиная со вторых суток после индукции язвенного процесса (табл. 2, 3).
Электрофоретическое разделение комплексов гликозаминогликанов и белков проводилось методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле [7]. Разделение проводилось в 7,5%-ном ПААГ при рН 8,9 в приборе для электрофореза фирмы «Реанал» (Венгрия). Использовался источник питания той же фирмы с током до 150 мА и напряжением до 1300 В. В течение 10 мин ток составлял 2 мА на гель, затем 5 мА на гель. Время разделения — 90 мин. После разделения гели фиксировались в 7%-ном растворе уксусной кислоты, затем окрашивались альциановым синим, 0,2%-ный раствор. Денситометрия геля проводилась на денситометре БИАН-170 [8].
Статистическая обработка проводилась с использованием программы Statistica 7.0, оценка достоверности различий в группах проводилась с использованием непараметрического критерия статистики Колмогорова — Смирнова.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Было найдено, что все исследованные препараты обладают выраженным ингибирующим влиянием на развитие язвенного процесса в слизистой оболочке желудка, индуцированного введением адреналина (табл. 1). Наиболее выраженным профилактическим эффектом по предотвращению адреналиновых язв обладал эфир 3. При исследовании на модели ацетатной язвы профилактической активности препарата 3 было найдено, что инги-бирование ацетатных язв на третьи сутки после аппликации кислоты составляло 69% (табл. 2).
Влияние эфира 3 на заживление язвы. Исследование показало наличие отчетливого заживляющего эффекта эфира 3 как при внутри-желудочном, так и при внутрибрюшинном введении препарата. Регистрацию эффекта проводили спустя 5, 7, 10 и 15 суток после введения эфира 3. Наибольший лечебный эффект отмечен при дозе 100 мг /кг при внутрижелудочном введении препарата один раз в сутки. При внутрибрюшинном
Б >
¡2 о
Б о 1_ ° ОЯ
ое
Щ о
Нв
О ¡0
а. и ® и га
I. Б
га
х
*
га
I-
х ш 2 5 а ш с и
V
т
Таблица 1
ПРОФИЛАКТИКА АДРЕНАЛИНОВЫХ ЯЗВ
Группы и вещества" Частота возникновения язвы (%) Индекс изъязвления (мм2) Степень ингибирования (%)
Контроль 80 77,8* —
Гефарнат 1 (МВ 400)а 60 15,7* 79,8
Эфир 3 (МВ 380)а 20 0,2* 99,5
Глицерид 6 (МВ 338)а 20 1,3* 98,4
Эфир 8 (МВ 292) 60 15,1*ь 80,5ь
Примечания: * — р < 0,05.
а Данные для пересчета доз в мольные концентрации: для 1 -2,5 • 10-4, для 3-2,6 • 10-4, для Ц — 2,9 • 10-4, для 8-3,4 • 10-3 моль/л. ь При дозе на порядок больший, чем у гефарната (эталон) и его аналогов 3, 6.
1-Л
ПРОФИЛАКТИКА АЦЕТАТНЫХ ЯЗВ
Вещество Частота возникновения язвы (%) Индекс изъязвления (мм2) Степень ингибирования (%)
Контроль 100 23,2 —
Эфир 3 (МВ 380) 100 7,2 69
Таблица 3
ДИНАМИКА ЛЕЧЕНИЯ ПЕРФОРАТИВНОЙ АЦЕТАТНОЙ ЯЗВЫ ЖЕЛУДКА У БЕЛЫХ КРЫС В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДОЗЫ АНТИУЛЬЦЕРОГЕННОГО ЭФИРА 3 (В /Ж ВВЕДЕНИЕ)
Доза, мг/ кг/ сутки Нижележащие строки: верхняя — время после аппликации лед. АсОН, сутки; средняя: усредненная по группе суммарная площадь поражения SV ), мм2; в скобках — степень заживления язвы (%)
5 7 10 15
Контроль 25,6 23,6 16,6 9,2
10 23,8 (7) 22,5 (5) 14,2 (9) 8,4 (9)
50 14,9* (42) 13,0* (45) 8,6* (45) 3,2* (65)
100 7,3* (71,5) 6,8* (71) 2,1* (87) 0 (100)
Примечание: * — p < 0,05.
Таблица 4
ДИНАМИКА ЛЕЧЕНИЯ ПЕРФОРАТИВНОЙ АЦЕТАТНОЙ ЯЗВЫ ЖЕЛУДКА У БЕЛЫХ КРЫС В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДОЗЫ АНТИУЛЬЦЕРОГЕННОГО ЭФИРА 3 (В / Б ВВЕДЕНИЕ)
Доза, мг / кг/ сутки Нижележащие строки: верхняя — время после аппликации лед. АсОН, сутки; средняя: усредненная по группе суммарная площадь поражения SV ), мм2; в скобках — степень заживления язвы (%)
5 7 10 15
Контроль 21,2 20,8 18,6 12,4
50 20 15,8 10,8* 7,2*
100 14,2* 10,6* 4,3* 1,8*
Примечание: * — p < 0,05.
со
1-Л
введении влияние препарата на заживление язв выражено слабее. Таким образом, эфир 3 наряду с сильным профилактическим действием проявляет лечебные свойства, ускоряя заживление ацетатной язвы желудка (табл. 3, 4).
Влияние эфира 3 на гликозаминогликаны слизистой желудка. Исследование уровня гликозами-ногликанов (ГАГ) обнаружило резкое снижение количества ГАГ при развитии язвенного процесса. Интенсивное снижение количества ГАГ отмечено в первые 3-7 суток после аппликации уксусной кислоты. Особенно заметно снижался уровень ГАГ во фракциях с низкой электрофоретической подвижностью. При лечении перфоративной язвы эфиром 3 количество ГАГ во всех фракциях слизистой (электрофореграмма гомонената) было значительно больше, чем в контроле. Таким образом, эфир 3 проявляет выраженные гастропротекторные свойства гефарната: обладает лечебными свойствами — способствует ускорению заживления ацетатной язвы, предотвращает резкое снижение уровня ГАГ в слизистой желудка. Этим подтверждается биохимическое родство гефарната и эфира 3.
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Молекулярный аспект гастропротекторных свойств новых аналогов. Вводимый извне препарат на пути к клетке-мишени неоднократно проходит через большое количество водно-липидных барьеров, поэтому скорость его движения существенно зависит от структуры эфира. Константы скорости ключевой реакции определяются легкостью образования фермент-субстратного комплекса, следовательно, важны и особенности структуры субстрата. Чем лучше последние соответствуют условиям обеих стадий, тем скорее и полнее проявляется биологический ответ. Формально это выражается уравнением:
^биологический ответ)/^ = С-А-Кх, где С — исходная концентрация вводимого препарата, А — вероятность его попадания за время t в клетку-мишень именно там, где происходит ключевая реакция (например, катализируемый панкреатической липазой гидролиз гефарната с образованием ФУК), Кх — константа скорости ключевой реакции. Параметры А и Кх — важные показатели
эффективности активных соединений, входящих в серию одного типа.
Вероятность оценивается экспериментально получаемой величиной — коэффициентом распределения (Р), так как в большинстве случаев скорость движения органических соединений через клеточный материал пропорциональна логарифму их коэффициентов распределения (logi) между гидрофобным органическим растворителем и водой [9- 11].
Значение logP удобно для оценки относительной гидрофобности органической жидкости. Компьютерный расчет значений logP для эфиров 1, 3, 6, а также эфира 10 и первого члена серии 24 показал соответствие значений logP со степенью гастропротекторной активности членов этого ряда. Однако прямой пропорциональности не наблюдается. В режиме профилактики язвообразования ярко выраженный гидрофобный член ряда, эфир 1, уступает по эффективности эфирам 3 и 6, хотя у них значения logP ниже. Гидролиз субстратов, аналогичных гефарнату, протекает быстро лишь в гетерофазной системе [12], тогда как скорости катализируемого панкреатической липазой гидролиза моноглицеридов всегда очень низки [13]. По сравнению с гефарнатом значения logP у эфиров 10 и 24 соответствуют их низкой эффективности как гастропротекторов [14] (табл. 5).
Мукозопротекторная эффективность эфира 8 на порядок ниже, чем у эфира 1. Расчет величины logP у фитинового эфира фарнезилуксусной кислоты не удался, но a priori она существенно больше, чем у гефарната.
При данных значениях logP можно объяснить расхождение между эффективностью гидрофобных эфиров 1, 10, 24 и эффективностью менее гидрофобных эфиров 3-7 различием электронных и стерических факторов, которое обусловлено наличием у эфиров 3 и 6 дополнительных кислородных функций и отсутствием СН3-групп в спиртовых фрагментах этих эфиров. Первое способствует образованию водородных связей
и понижает энергию прохождения через водно-липидные барьеры. Второе облегчает образование фермент-субстратного комплекса и, тем самым, повышает скорость появления в среде ФУК.
Производные ФУК являются эффективными средствами профилактики и лечения язвенных поражений желудка. Так, гефарнат проявляет значительную противоязвенную активность при различных моделях экспериментальных язв [15; 16]. Противоязвенная активность гефарната проявляется при таких моделях, как повреждение СОЖ под воздействием НС1-этанола, НС1-таурохолевой кислоты, аспирина, этанола при стрессовых язвах [17]. Эффективность препарата зависит от пути его введения. Заживляющий эффект гефарната основан на его способности стимулировать репарационные процессы [18].
При заживлении язв гефарнатом важное значение имеет нормализация уровней высокомолекулярных фракций гликозаминогли-канов слизистой [19; 20] и уровней эндогенных простагландинов [19; 21]. Изменение этих параметров наблюдается при спонтанной и медикаментозной репарации язвы по динамике биосинтеза гликозаминогликанов в гомогенатах слизистой желудка методом диск-электрофореза в ПААГ (табл. 4).
Профилактическая активность препаратов сочетается с предотвращением снижения уровня гли-гозаминогликанов в слизистой оболочке желудка, что может быть связано с их способностью стимулировать включение сульфатных групп в глигоза-миногликаны и заживление язв [22; 23]. В основе лечебного действия производных ФУК может лежать их способность активизировать синтез простагландинов в СОЖ при язвенном поражении. У крыс, подвергнутых стрессу погружения, под воздействием гефарната отмечено увеличение уровня ПГЕ2, ПГИ2 [24].
Б >
¡2 о
So 1_ ° OS
ое
Щ о
НВ О b
а. и ® и га
L Б
га
X
j
га
I-
х ш 2 s а ш с и
v
m
Таблица 5
ИЗМЕНЕНИЯ УРОВНЯ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ВО ФРАКЦИЯХ ГОМОГЕНАТА СЛИЗИСТОЙ ЖЕЛУДКА ЧЕРЕЗ 5 ДНЕЙ ПОСЛЕ ИНДУКЦИИ ЯЗВЕННОГО ПРОЦЕССА (АППЛИКАЦИЯ АсОН) И ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЭФИРОМ 3а
Доза, мг / кг Значения R/электрофоретических зон фракций ГАГ:
«подвижные» гликозаминогликаны «тяжелые» гликозаминогликаны
0,72 0,68 0,32 0,20 0,12 0,10 0,04
Контроль 0,12 0,10 0,20 0,22 0,30 0,36 0,48
10 0,16 0,20 0,18 0,32 0,40* 0,54* 0,70*
50 0,18 0,16 0,24 0,48* 0,52* 0,60* 0,68*
100 0,26* 0,24* 0,40* 0,54* 0,48* 0,64* 0,72*
Примечания: * — p < 0,05.
а — Данные денситометрического определения интенсивности окраски гликозаминогликанов на электрофореграммах (краситель — альциановый синий 8GX, среда — полиакриламидный гель).
о
1-Л
СООТВЕТСТВИЕ МУКОЗОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕФАРНАТА И ЕГО АНАЛОГОВ И ЗНАЧЕНИЙ ИХ logP В СИСТЕМЕ Н-ОКТАНОЛ / ВОДАа f
Расчетные значения 1о%Р (строка 1) и уровни активности эфиров (строка 2) Эфиры фарнезилуксусной кислоты:
отчетливо гидрофобные умеренно гидрофобные
25 1 10 24 3 4 и 5 7 6
logР н. о. 7,53 5,11 4,77 4,79 5,71 и 6,34 4,09 3,72
Уровень активности (условно) b, c, d + b, c, e +++ b, c + b, c ~0 E +++ ~0 и + e, f e, f + E +++
Примечания:
а Расчетные значения для оптимальной двухфазной смеси. ь Данные из работы [5].
c В работе [5] этиловый (10), метиловый (24) и фитиновый эфир фарнезилуксусной кислоты (25) использовались в двукратной дозе относительно гефарната (1). Активность проявляется при пероральном, но не при подкожном введении эфира 25. 1 Данные профилактики язвообразования (настоящая работа).
В опытах с эфирами 4, 5 и 7 (без повторностей) уровень активности эфиров 5 и 7 был ниже, чем у гефарната, а активность эфира 4 почти не отличалась от уровня контроля.
ЛИТЕРАТУРА
1. Katoh Y., Tanaka M., Kawashima H. Protective effects of teprenone and gefarnate against taurocholate/hydrochloric acid-induced acute gastric mucosal lesions in rats // Folio Parmacol. Japan. — 1998. — Vol. 112, № 5. — P. 323-331.
2. Coppi G., Bonardi G., MartinelliE. On the metabolic fate of gefarnate in rats // Arzneimittelforschung. — 1969. — Vol. 19, № 9. — P. 1519-1520.
3. Kajiwara Y., Yokoi S., Shimomura Y. et al. // Clin. Pharmacol. — 1980. — Vol. 11, № 3. — P. 263-269.
4. Nashioka K., Nakatsuka I., Kanamuru H. An improved method for 14C-labelling of farnesylacetic acid and its geranyl ester // Radioisotopes. — 1988. — Vol. 37, № 3. — P. 133-139.
5. Белостоцкий Н. И. Язвообразование в слизистой оболочке желудка под влиянием катехоламинов // Патол. физиол. и эксп. тер. — 1988. — № 1. — С. 24-27.
6. Okabe S., Roth J.L. A., Pfeiffer C. J. A method for experimental penetrating gastric and duodenal ulcer in rats // Am. J. Dig. Dis. — 1971. — Vol. 16. — P. 277-284.
7. Maurer H. R. Disk-electrophorese. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле. — М., 1971.
8. БелостоцкийН. И. Роль углеводсодержащих компонентов и про-теаз желудка в язвообразовании: дис____канд. мед. наук. — М., 1983.
9. Hansch C., Fijita T. // J. Am. Chem. Soc. — 1964. — Vol. 86, № 8. — P. 1616 - 1626.
10. Leo A., Hansch C., Elkins D. // Chem. Ref. — 1971. — Vol. 71, № 6. — P. 525 - 614.
11. Collander R. // Physiol. Plantarum. — 1956. — Vol. 7, № 2. — P. 420- 445.
12. Brockerhoff H., Jansen R. G. Lipolytic Enzymes. — N. Y.: Academic Press, 1974. — Chap. 3-6.
13. Constantin M. J., Pasero L., Desnoelle P. // Biochem. Biophys. Acta. — 1966. — Vol. 43, № 1. — P. 103-107.
14. Cardani C, Cavalleri B., Adami E. J. Esters of farnesylacetic acid // J. Med. Chem. — 1963. — Vol. 6, № 4. — P. 457-458.
15. Hara N, Hara Y. // Oyo Yakuri. — 1985. — Vol. 29. — P. 557-563.
16. Hara N, Kameno Y, Hara Y. // Oyo Yakuri. — 1985. — Vol. 29. — P. 565 - 570.
17. Hara N., Okabe S. Effects of gefarnate on acute gastric lesions in rats // Jap. J. Pharmacol. — 1985. — Vol. 85. — P. 433-436.
18. Mori J., Boidi J. P., Fresia P. // Atti Acad. Med. Lombarda. — 1965. — Vol. 19. — P. 438-447.
19. Maeda S, Yonezawa K, Yabana T. // Ther. Res. — 1985. — Vol. 2, № 5. — P. 915-921.
20. OkazakiI. // Ther. Res. — 1985. — Vol. 2, № 5. — P. 911-913.
21. GuslandiM. Ulcer-healing drugs and endogenous prostaglandins. // Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. Toxicol. — 1985. — Vol. 23, № 8. — P. 398-402.
22. Suwa T., Fukushima K., Kyogoku K., Mori Y. Changes in synthetic activity of sulfated mucosubstances in healing process of acetic acid ulcer in rats and effect of anti-ulcer agents. // Jap. J. Pharmacol. — 1984. — Vol. 34. — P. 480-482.
23. Takagi K., Yano S. Effect of anti-ulcer drugs on gastric mucous hexosamine in rats subjected to several ulcerogenic conditions. // Chem. Pharm. Bull. — 1972. — Vol. 20. — P. 1170-1174.
24. Arakawa T., Nakamura H., Chono S. et al. // J. Exp. Med. — 1983. — Vol. 140, № 4. — P. 407-412.
CD О
