CC BY
23УДК 633.63:581.143.6
Гаплоидный партеногенез
как перспективный приём получения
гомозиготных линий сахарной свёклы
E.H. ВАСИЛЬЧЕНКО, старший научный сотрудник, Е.О. КОЛЕСНИКОВА, канд. биолог, наук
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова»
(e-mail: biotechnologiya@mail.ru)
Введение
В последние годы всё более широкое применение в селекции культурных растений находят методы культуры изолированных тканей и органов, среди которых особое место занимает культивирование не-оплодотворённых семязачатков для получения гомозиготных линий [1].
Разработка метода гаплоидного партеногенеза у сахарной свёклы, начатая в прошлом веке, продолжается в настоящее время, сопровождаясь совершенствованием специфических условий индукции неоплодотворённых семязачатков и культивированием гаплоидных регенерантов, выявлением новых генетических рекомбинаций и включением созданных дигаплоидных линий в селекционный процесс [2, 3].
Необходимым условием при формировании реституционных гомозиготных линий сахарной свёклы является первоначальная оценка морфологических признаков растений-регенерантов, проведение ци-тофотометрического анализа уровня плоидности, исследование полиморфизма изоферментных спектров в культивируемых in vitro гаплоидных регенерантах [4, 5].
Большое значение в регуляции процесса активации мегагамет играет консистенция и состав питательных сред для культивирования изолированных семязачатков сахарной свёклы [6, 7].
Материалы и методы
Для исследований использовали селекционные материалы лаборатории ЦМС и лаборатории исходного материала ФГБНУ ВНИИСС им. А.Л. Мазлумова. Объектами исследования были неоплодотворённые семязачатки и гаплоидные растения-регенеранты сахарной свёклы (Beta vulgaris L.), культивируемые в условиях in vitro. При разработке новых приёмов культивирования неоплодотворённых семязачатков использовалась разная консистенция питательной среды (жидкая и твёрдая фазы). Отбор полученного
материала осуществляли с помощью цитофотоме-трии на приборе Райес.
Результаты экспериментов и их анализ
Проведённые исследования показали, что при выращивании семязачатков в жидкой питательной среде первое образование микроструктур происходит уже через три недели после пассирования и продолжается в течение 12 недель, что позволяет длительно сохранять жизнеспособность изолированных экс-плантов и стимулировать развитие новообразований. Наилучшей средой для дифференциации клеток и тканей семязачатков оказалась жидкая питательная среда с содержанием 0,5 мг/л БАП, способная вызывать пролиферацию новообразований до 11,5 %. Последующий перенос семязачатков на твёрдую ага-ризованную среду с добавлением 6-БАП — 0,5 мг/л + + ИУК — 0,05 мг/л позволяет индуцировать морфогенез гаплоидных регенерантов. Прекультивирование неоплодотворённых семязачатков на питательной среде жидкой консистенции активизирует процесс пролиферации ядер и клеток женского гаметофита, что при пересадке на агаризованную среду стимулирует формирование растений-регенерантов в среднем до 6,02 %. Культивирование непосредственно на твёрдой питательной среде индуцирует 3,5 % регенерантов. Это дало возможность усовершенствовать метод индуцирования партеногамии на основе двух-этапного культивирования.
Развитие незрелых семязачатков, пассируемых на жидких средах, происходит путём прямой регенерации и через каллус (рис. 1).
Растения-регенеранты различались по морфологическим признакам. Часть растений характеризовалась более узкими и удлинёнными листовыми пластинами, более длинными черешками, имеющими зелёную или слегка розовую окраску. Другие микроклоны имели широкие листовые пластинки с волнистым краем, короткие черешки и меньшую высоту (рис. 2).
Рис. 2. Фенотипическиеразличиярастений-регенерантов
Рис. 1. Индукция гаплоидныхрегенерантов
Цитофотометрическая оценка уровня плоидности регенерировавших растений сахарной свёклы в культуре in vitro выявила гаплоидные, диплоидные и мик-соплоидные формы (рис. 3).
Для дальнейших исследований был отобран материал с одинарным (n = 9) набором хромосом.
Наиболее ответственным этапом при дальнейшем культивировании полученных гаплоидных реге-нерантов является период стабилизации ростовых процессов у индуцированных гаплоидов, отбор наиболее жизнеспособных, активно растущих и хорошо размножающихся растений. При первом пассаже отмечается незначительное образование дополни-
Гаплоидное растение n=9
Диплоидное растение 2n=18
Миксоплоидное растение 2n=9(18)
Рис. 3. Цитофотометрическая оценка уровня плоидности растений-регенерантов сахарной свёклы в культуре in vitro
№ 6 • 2018 САХАР 21
Рис. 4. Стабилизация ростовых процессов гаплоидныхрегенерантов
тельных побегов. Дальнейшее культивирование на ростовой среде (ГК, 6-БАП, Кн — по 0,2 мг/л) приводит к стабилизации ростовых процессов. Путём чередования питательных сред (безгормональная и ростовая) проводят отбор жизнеспособных регенерантов (рис. 4).
Стабилизирующий отбор (3-4 пассажа) нормально развитых гаплоидных растений-регенерантов обеспечивает выравненность материала по морфологическим признакам и высокую способность к формированию адвентивных побегов.
Заключение
Таким образом, инновационным приёмом проведённых экспериментов при индуцировании партено-гамии является использование прекультивирования неоплодотворённых семязачатков на питательной среде жидкой консистенции, которая, активизируя процесс пролиферации ядер и клеток женского гаме-тофита, стимулирует процесс формирования гаплоидных регенерантов в два раза. Цитофотометриче-ский анализ уровня плоидности позволяет идентифицировать на ранних этапах гаплоидные растения-ре-генеранты, отбирать и формировать линии сахарной свёклы в культуре in vitro.
Список литературы
1. Знаменская, В.В. Микроклонирование in vitro как метод поддержания и размножения линий сахарной свёклы. — В сб.: Энциклопедия рода Beta. Биология, генетика и селекция свёклы (науч. тр. Института цитологии и генетики СО РАН). — Новосибирск, 2010. - С. 420 -437.
2. Chen, J.F. In vitro haploid and diploid production via unfertilized ovule culture / J.F. Chen, A.A. Malik // Plant Cell and Tissue Culture. - 2011. - 104 (3). -Р. 311-319.
3. Murovec, J. Haploids and Doubled Haploids in Plant Breeding / B. Bohanec, J. Murovec // Plant
Breeding, Dr. Ibrokhim Abdurakhmonov (Ed.). - 2012. -Р. 87-106.
4. Васильченко, Е.Н. Индуцирование гаплоидной партеногамии сахарной свёклы в условиях in vitro // Сахарная свёкла. - 2016. - № 6. - С. 2-4.
5. Жужжалова, Т.П. Гаплоидный партеногенез in vitro у сахарной свёклы (Beta vulgaris): факторы и диагностические признаки / Т.П. Жужжалова [и др.]. -Сельскохозяйственная биология. - 2016. - Т. 51. -№ 5. - С. 636-644.
6. Tomashevska-Sowa, M. Cytometric analyses of sugar beet (B. vulgaris L.) plants regenerated from unfertilized ovules cultured in vitro. 2010. - С. 1-11.
7. Tomashevska-Sowa, M. Effect of growth regulators and other components of culture medium on morphogenesis of sugar beet (Beta vulgaris L.) / Acta agrobotanica. Vol. 65 (4), 2012. - С. 91-100.
Аннотация. Представлены результаты изучения консистенции и состава питательных сред для культивирования изолированных семязачатков сахарной свёклы. Показано, что гормональный состав питательной среды по Гамборгу (В5) влияет на направления морфогенетического развития изолированных семязачатков - через прямую регенерацию и через каллус. Цитофотометрическая оценка позволила отобрать материал с одинарным (n = 9) набором хромосом. Ключевые слова: сахарная свёкла, индукция, партеногамия, семязачатки, цитофотометрия, гаплоидные растения. Summary. The results of the study of texture and composition of culture media for the cultivation of sugar beet isolated ovules. It is shown that the hormonal composition of the culture medium of Gamborg (B5) affects the direction of the morphogenetic development of isolated ovules - through direct and regeneration through callus. Cytophotometry evaluation allowed to select with a single material (n = 9) chromosome. Keywords: sugar beet, induction parthenogamy ovules, cytophotometry, haploid plants.
