CC BY
77
УДК 616.15-097:57.083.3
I.N. Kogarko1, A.Yu. Baryshnikov2, S.B. Kogarko1, A.K. Golenkov3, B.S. Kogarko1, S. Macceo4
GAMMAPATHY: THE DETECTION OF IMMUNOGLOBULINS' FREE LIGHT CHAINS IN BLOOD SERUM BY IMMUNOCHEMICAL ANALYSIS (PART I)
1N.N. Semenov Instituir of chemical physics of RAS, Moscow 2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow 3M.F. Vladimirsky Research Clinical Institute, Moscow
4The Binding Site, Ltd.
ABSTRACT
This review summarizes the data obtained in clinics which are specialized on treatment of different types of gammapathy. The part I of review discusses the up-to-date methods of diagnosis the gammapathy based on the dete-cion of immunoglobulins' light free chains in blood serum and urine. The authors make a point of advantages of «Freelight» method which is considered to be more sensitive and quantitative method. This method also gives a prompt reply, the necessary step in diagnosis of gammapathy and differential diagnosis.
Key words: gammapathy, free light chains of immunoglobulins.
И.Н. Когарко1, А.Ю. Барышников2, С.Б. Когарко1, A.K. Голенков3, Б.С. Когарко1, С. Маццео4*
ГАММАПАТИИ: ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНЫХ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ (ЧАСТЬ 1)
1ИХФ РАН им. Н.Н. Семенова, Москва 2 ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН,
115478 Москва, Каширское ш., 24 3МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, Москва 4The Binding Site, Ltd., Бирмингем, Великобритания
РЕЗЮМЕ
Настоящий обзор представляет собой совокупность клинических данных, полученных в различных клиниках мира, специализирующихся на лечении разного вида гаммапатий. В 1-й части обзора отражены современные лабораторные методы диагностики гаммапатий на основе определения свободных легких цепей иммуноглобулинов в сыворотке крови и моче. Особо подчеркиваются преимущества определения свободных легких цепей по сыворотке крови методом «Фрилайт» — более чувствительным, количественным методом, позволяющим давать наиболее быстрый ответ при постановке диагноза и дифференциальной диагностике.
Ключевые слова: гаммапатии, свободные легкие цепи иммуноглобулинов.
*Когарко Иветта Николаевна — д. мед. наук, ведущий научный сотрудник отдела динамики химических и биологических процессов; тел. 8 903 135 31 79
Барышников Анатолий Юрьевич — д. мед. наук, профессор, директор НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей
Когарко Сергей Борисович — научный сотрудник отдела динамики химических и биологических процессов Голенков Анатолий Константинович — д. мед. наук, заведующий отделом иммунологии и гематологии Когарко Б.С. — д. физ.-мат. наук, ведущий научный сотрудник отдела динамики химических и биологических процессов Маццео С. — д. биол. наук
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время проблемы диагностики и лечения гаммапатий приобретают все большее значение в связи с участием врачей разных специальностей, имеющих опыт лечения таких больных и обычно возглавляемых гематологом или онкологом.
По рекомендациям Британского форума по гам-мапатиям (2005 г.) одна из форм гаммапатий — множественная миелома — определяется как плазмокле-точная опухоль. 150 лет назад доктор Генри Бенс-Джонс описал 1-й случай множественной миеломы в журнале «Ланцет». Этот случай был описан им как болезнь с нетипичными свойствами мочи. Наличие в моче легких цепей являлось причиной нетипичных свойств мочи, упомянутых Бенс-Джонсом. Легкие цепи присоединяются к тяжелым, образуя интактный иммуноглобулин.
На рис.1 представлена схема продуцирования плазматическими клетками тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Клетки продуцируют 1 из 5 типов тяжелых цепей (IgG, А, М, D и Е) и 1 из 2 типов легких (каппа или лямбда). Продуцирование легких цепей на 40% больше, чем тяжелых, обеспечивает правильное построение молекулы интактного иммуноглобулина. Легких цепей типа каппа вырабатывается в 2 раза больше, чем типа лямбда. Каппа является мономером и меньше по размеру, чем димер лямбда.
Легкие цепи продуцируются всеми плазматическими клетками, включая нормальные плазматические клетки, и высвобождаются в кровь. Легкие цепи продуцируются при всех типах миеломы, в том числе в 82 % при несекретирующей множественной миеломе. Поэтому определение легких цепей в сыворотке крови может быть использовано как более эффективные метод для диагностики и мониторинга больных с моно-клональными гаммапатиями.
Продуцирование свободных легких цепей плазматическими клетками
Kappa Lambda
Production rate of 2:1 (К:Л)
Рис. 1. Продуцирование свободных легких цепей плазматическими клетками:
Соотношение продукций каппа к лямбда -2:1
ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНЫХ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ В КЛИНИКЕ
Данный метод позволяет обнаружить и проводить мониторинг до 82 % случаев при несекретирующей множественной миеломе [10]. При этом виде множественной миеломы наблюдается продукция достаточного количества легких цепей для их определения в 80 % случаев. Оставшиеся 20 % составляют больные, которые вообще не продуцируют ни легких цепей, ни М-протеина. Данный метод может обнаружить и проводить мониторинг больных первичным амилоидозом, включая даже тех, у которых не выявлен М-протеин методом электрофореза с иммуннофиксацией [1; 2; 7]. Данный метод также может быть использован для мониторинга терапевтического ответа или резистентности при лечении больных множественной миеломой с ин-тактным иммуноглобулином и множественной миело-мой легких цепей [1; 3; 11]. В последнее время метод был включен в исследование по оценке степени риска перехода моноклональной гаммапатии неопределенного генеза в множественную миелому [12].
Все плазматические клетки продуцируют в избытке свободные легкие цепи, поэтому возможно определение концентрации свободных легких цепей в популяции, взятой по методу свободной выборки. На рис. 2 отмечены результаты у людей в возрасте от 20
s
Е « О" й 8
Я «
t ■ .■I.
40
.M
80
80
Aje - •» Age'
К, Ь, кД. ratios, and cystatln С results by age In 282 noimal samples from the Mayo Clinic. (FLC = free light chain; red ■ fresh serum, black ■ frozen serum.)
Katzmann etal. Clin Chem. 2002:1437-1444. „
Рис. 2. Концентрация свободных легких цепей каппа, лямбда, соотношения каппа к лямбда и цистатина С в сыворотке крови больных разных возрастных групп:
А — по оси X — возраст пациентов, по оси У — концентрация свободных легких цепей типа каппа; В — по оси X —возраст пациентов, по оси У — концентрация свободных легких цепей типа лямбда;
С — по оси X — возраст пациентов, по оси У — соотношение концентраций свободных легких цепей каппа к лямбде;
D — по оси X — возраст пациентов, по оси У — концентрация цистатина С
до 60 лет и от 50 до 90. На графике А на оси Y отложена концентрация каппа цепей, а на оси X — возраст взятых в исследование людей. Очевидно, что концентрация цепей типа каппа увеличивается с возрастом. На графике В на оси Y отложена концентрация цепей типа лямбда, а на оси X - возраст взятых в исследование людей. Очевидно, что концентрация цепей типа лямбда значительно увеличивается с возрастом. Однако график С показывает, что соотношение концентраций каппа и лямбда цепей с увеличением возраста практически не меняется. Была поставлена задача проанализировать, почему происходит значительное увеличение концентрации цепей типа лямбда с возрастом. Так как легкие цепи фильтруются почками, проанализировали изменение функции почек при помощи определения Цистатина-С с увеличением возраста (что представлено на графике D). Очевидно, что фильтрационная способность почек уменьшается с возрастом. Это и приводит к увеличению концентрации цепей типа лямбда с увеличением возраста. Напомним, что лямбда является димером и в 2 раза больше по размеру, чем каппа.
Были проанализированы соотношения концентраций свободных каппа и лямбда легких цепей в сыворотке крови в норме при использовании предлагаемого метода, рассмотрены результаты от 282 здоровых доноров в возрасте от 20 до 90 лет и выявлен интервал значений каппа и лямбда цепей для нормы [8].
Каковы границы показателей в норме? Концентрация легких цепей типа каппа с 95% достоверностью находится в интервале от 3,3 до 19,4 мг/л, а типа лямбда с той же достоверностью — от 5,7 до 26,3 мг/л. Отношение концентраций цепей типа каппа к типу лямбда для всех 282 случаев находится в пределах так называемого диагностического интервала от 0,26 до 1,65 (рис. 3).
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНЫХ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ДИАГНОЗА
Проведем анализ жалоб, предъявляемых пациентами, и методов диагностики, применяемых традиционно в клинике. Обычно наличие свободных легких цепей определяют по моче, а не в сыворотке крови, как производится предлагаемым методом.
Как результат 2 обширных проведенных исследований отмечено, что после 50 лет 58 % больных жалуются на боли в спине, 32 % — на слабость, 73 % имеют анемию и 11 % — с минимум симптомов или без них [9]. По данным доктора Браена Дари из международной ассоциации по изучению миеломы, 25 % больных с множественной миеломой был поставлен диагноз при обследовании терапевтом [5].
Если существует подозрение, что у пациента мо-ноклональная гаммапатия, ему назначают исследование с помощью электрофореза белков сыворотки крови или мочи. Кроме того, другими диагностическими методами являются: электрофорез с иммунофиксаци-ей, капиллярный электрофорез и электрофорез белков мочи, собранной в течение суток.
Рассмотрим метод электрофореза белков мочи. Это классический тест при множественнрй миеломе. Метод прост в практике, может быть частично автоматизирован и дает количественную оценку. Самым серьезным недостатком этого метода является получение положительного результата только при протеинурии переполнения. Что это такое?
На рис.4 дана схема нефрона. В почке содержится приблизительно 500 нефронов. Через гломерулы клубочков проходят разнообразные плазменные молекулы белков (включая свободные легкие цепи иммуноглобулинов), которые затем реадсорбируются и мета-болизируются в проксимальных канальцах. Каждый день продуцируется от 500 до 1000 мг свободных легких цепей. Способность одного нефрона к реадсорб-ции состовляет 10 - 30 мг в день. Цепи типа каппа
Концентрация свободныхки^,легких цепей в сыворотке крови в норме
в
Е
+ Normal sera 21-62 years f Normal sera 51-90 years
10 100 Serum kappa, rng/L Katzmann etal. Clin Chem. 2002;1437-1444.
FLC - к monomer 25 kDa
mer 50 kDa
Glomerulus 40-60 kDa fenestrations
10-30g/day reabsorption
Filtration - 3:1 (К:Л)
FLC 3-5 mg/day 'entering urine
Рис. 3. Концентрация свободных легких цепей каппа и лямбда в сыворотке крови в норме:
По оси X — концентрация свободных легких цепей каппа, по оси У — концентрация свободных легких
цепей лямбда. Рис. 4. Схема нефрона
Multiple Myeloma
Mayo Clinic 1985-1998 Serum Protein Electrophoresis
SPEP results MetemallJ
N = 1027 pts with myeloma y
являются мономером и фильтруются в 3 раза быстрее, чем типа лямбда-димер. В результате в сыворотке крови количество цепей типа лямбда выше, чем цепей типа каппа. Это данные для нормы. Соответственно результат анализа мочи показывает обратную зависимость — количество легких цепей каппа больше, чем типа лямбда.
Протеинурия переполнения возникает, когда количество продуцируемых легких цепей превосходит количество цепей, реадсорбируемых в канальцах, и приводит к экскрекции в мочу нереадсорбированных свободных легких цепей.
На рис. 5 представлены данные клиники Майо по определению моноклонального белка в моче. Было проанализировано около 1000 больных с установленным ранее диагнозом множественная миелома. Электрофорез белков мочи показал, что у 22 % не был подтвержден диагноз множественная миелома [9].
Теперь рассмотрим метод электрофореза белков в сыворотке крови — более распространенный тест при подозрении на множественную миелому. При этом определяется количество сывороточных белков, но граница определения лимитирована от 500 до 2000 мг/л и не определяются небольшие концентрации М-протеина.
Multiple Myeloma
Mayo Clinic 1985-1998 Urine Monoclonal Protein
UPEP results N = 972 pts with myeloma
Kyle RA. Mayo Clin Рте. 2003:7821-33.
Рис. 6. Множественная миелома. Определение сывороточных белков крови методом электрофореза
чаи составляют 30 % всех В-клеточных патологий. Надо не забывать использовать сыворотку крови для скрининга. Итак, в случаях подозрения на множественную миелому оптимальной диагностикой является сочетание методов электрофореза сывороточных белков и определения свободных легких цепей в сыворотке крови.
На рис. 7 показан сравнительный анализ чувствительности методов определения легких цепей. Начнем рассмотрение этого рисунка с результатов определения количества легких цепей в моче. Если анализировать результаты электрофореза (ЦРЕР) и электрофореза с иммунофиксацией (и!ТЕ) белков мочи, то очевидно, что по чувствительности эти 2 методики ближе по результатам к нормальным значениям концентраций легких цепей в сыворотке крови, чем нормальным значениям в моче.
Метод электрофореаз с иммунофиксацией ^]ТЕ) белков сыворотки крови менее чувствителен, чем дру-
Рис. 5. Множественная миелома. Определение моноклонального белка в моче методом электрофореза
На рис. 6 представлены данные клиники Майо по электрофорезу сывороточных белков при множественной миеломе. Было проанализировано более 1000 больных. Из них у 11 % не был подтвержден диагноз [9].
Очевидно, что применение электрофореза сывороточных белков для скрининга множественной мие-ломы с интактным иммуноглобулином обосновано. Метод определения свободных легких цепей сыворотки крови (обозначенный sFLC) более чувствителен для определения свободных легких цепей, и потому даже такие типы, как множественная миелома легких цепей, несекреторная множественная миелома и первичный амилоидоз, могут быть определены. Эти слу-
Comparative Sensitivity
1000
а р
Интервал нормальных значений в сыворотке
Интервал нормальных значений в моче
sFLC
Adapted from Bradwell et ai. Serum Free Light Chan Analysis, 3rd ed; 61, 2005.
Рис. 7. Сравнительный анализ чувствительности методов определения легких цепей:
По оси У — концентрация М-протеина, мг/л.
гие методы и дальше от значений нормы. Капиллярный зонный электрофорез белков (CZE) — еще менее чувствительный метод, а электрофорез сывороточных белков (БРЕР) и определение общего количества белков типа каппа и лямбда еще более далеки от значений количества легких цепей в норме.
Метод определения свободных легких цепей иммуноглобулинов достигает нормальных значений концентраций легких цепей как в сыворотке крови, так и в моче. Следовательно, этот метод более чувствителен, чем другие применяемые методики.
Рассмотрим значимость для больного ситуации, когда значение концентрации легких цепей попадает в область между нижней границей чувствительности метода и верхней границей нормы.
На рис. 8 представлены данные больных множественной миеломой легких цепей. Каппа отложена по оси X, лямбда — по оси Y. Квадратами представлены больные множественной миеломой легких цепей типа каппа. У этих больных увеличено количество цепей типа каппа при нормальном уровне количества лямбда цепей. Треугольниками обозначены пациенты с диагнозом множественная миелома легких цепей типа лямбда, у которых имеется повышение количества лямбда цепей при нормальных значениях каппа цепей. Крестиками отмечены значения нормы, а крупными крестами — больные, у которых отношение каппа к лямбда находится в норме при повышенных значениях одновременно и каппа, и лямбда цепей. Это обычно бывает у больных почечной недостаточностью и нарушением фильтрации легких цепей. Такого рода больные не имеют диагноза моноклональной гаммо-патии, а могут быть с диагнозом лимфома и др. Теперь если мы используем только метод электрофореза сывороточных белков, то мы можем пропустить 20 % больных, которым может быть поставлен диагноз только в дальнейшем при прогрессировании болезни.
Чувствительность методов для определения множественной миеломы легких цепей
4 А » » ' V * Lambda LCMM /'А Normal SeraX^tffife^ /
Kappa LCMM flk N - 224 with LCMM
+ Normal sera ■ Kappa LCMM a Lambda LCMM + Renal impairment
х'щу ;
Sensitivity of IFE ^ Sensitivity of SPEP
10 100 1000 10000 100000 Serum Kappa, mg/L
Bradwell et al. Lancet 2003; 361:489-491
Рис. 8 Чувствительность методов диагностики множественной миеломы легких цепей:
По оси X — концентрация свободных легких цепей каппа, по оси У — концентрация свободных легких цепей лямбда.
Метод электрофореза с иммунофиксацией несомненно лучше по чувствительности, но тоже приводит к непостановке диагноза. А предлагаемый метод охватывает 100 % больных множественной миеломой легких цепей, поскольку чувствительность этого метода высока и доходит до значений нормы [4].
В результате обширного исследования было выявлено, что с использованием предлагаемого метода в среднем в 93 % случаев диагноз был установлен при различных типах моноклональных гаммапатий. Если значение отношения каппа к лямбда попадали в интервал нормальных значений, то больному диагноз моноклональная гамма-патия не ставили [6; 7; 11; 8].
В результате ряда других исследований была показана эффективность предлагаемого метода при множественной миеломе с интактным иммуноглобулином различного типа (IgG, А, D и Е) [6], первичном амилоидозе [10], болезни легких цепей [4], а также при несекретирующей множественной мие-ломе [6].
Для оценки использования предложенного метода в клинической практике в клинике Майо было проанализированно более 1000 больных. У 121 больного с пораженной системой плазматических клеток наблюдали нормальное к/1 (подтверждение метода).
В результате данного исследования было установлено, что предлагаемым методом больные с заболеванием, связанным с агрегацией легких цепей в различных органах, определяются в 100 % случаев. В 92 % случаев определяются больные с амилоидозом [7]. В отличие от предложенного метода методом электрофореза сыворотки крови с иммунофиксацией был поставлен диагноз только 71 % больных амилоидозом, методом электрофореза мочи с иммунофиксацией — 84%. Однако применение совместно всех 3 методов давало возможность постановки диагноза в 99 % случаев. У больных с несекретирующей множественной миеломой чувствительность предлагаемого метода составляла 70 %, или 14 из 20 больных. Интересно отметить, что те 6 из 20 больных, у которых значения к/1 попадали в интервал для нормы, получили лечение трансплантацией стволовых клеток. В 5 из 6 случаев наблюдался полный ответ на терапию.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В заключение мы хотим повторить еще раз коротко преимущества определения свободных легких цепей по сыворотке крови. Во-первых, определение не зависит от наличия протеинурии наполнения. Во-вторых, чувствительность метода Фрилайт достигает значений в норме. В-третьих, определение по сыворотке практически легче выполнимо и позволяет избежать трудностей с забором мочи на протяжении 24 ч. И последним преимуществом является короткий период полураспада свободных легких цепей в сыворотке крови, что позволяет давать быстрый ответ на лечение или определять резистентность к лекарственному препарату.
ЛИТЕРАТУРА
1. Abraham R.S., Clark R.J., Bryant S.C. et al. Correlation ofserum immunoglobulin free light chain quanti-tation with urine Bence Jones protein in Light Chain Myeloma // Clin Chem. - 2002. Vol. 4. - P. б55-бб5.
2. Bird J.M., Cavenagh J., Samson D. et al. Guidelines on the diagnosisand management of AL amyloidosis // Br J Haematol. - 2004. - Vol. 12S. - P. б81-700.
3. Bradwell A.R. Serum Free Light Chain Analysis (4th Edition) / Pub: The Binding Site Ltd., 200б. -ISBN:070442S297.
4. Bradwell A.R., Carr-Smith H.D., Mead G.P. et al. Serum test for assessment of patients with Bence Jones myeloma // Lancet. - 2003. - Vol. 361. - P. 489-491.
5. Deerie B.G.M., Hfroussean J.L., Miguel J.S. et al. International uniform response criteria for multiple myeloma // Leukemia. - 2006. - Vol. 20. - P. 1467-1473.
6. Drayson M.T., Tang L.X., Drew R. et al. Serum free light-chain measurements for identifying and monitoring patients with nonsecretory multiple myeloma // Blood. - 2001. - Vol. 97. - P. 2900-2902.
7. Katzmann J., Abraham R.S., Dispenzieri A. et al. Diagnostic performance of Quantitative Kappa and
Lambda Free Light Chain Assays in Clinical Practice // Clin Chem. - 2005. - 51. - P. 878-881.
8. Katzmann J.A., Clark R.J., Abraham R.S. et al. Serum Reference Intervals and Diagnostic Ranges for Free and Free Immunoglobulin Light Chains: Relative Sensitivity for Detection of Monoclonal Light Chains // Clin Chem. - 2002. - Vol. 48. - P. 1437-1444.
9. Kyle R.A., Rajkumar S.V. Multiple myeloma // N. Engl. J. Med. - 2004. - Vol. 351. - P. 1860-1873.
10. Lachmann H.J., Gallimore R., Gillmore J.D. et al. Outcome in systemic AL amyloidosis in relation to changes in concentration of circulating free immunoglobulin light chains following chemotherapy // Br. J. Haematol. - 2003. - Vol. 122. - 78-84.
11. Mead G.P., Carr-Smith H.D., Drayson M.T. et al. Serum Free Light Chains for Monitoring Multiple Myeloma // Br. J. Haem. - 2004. - Vol. 126. - P. 348-354.
12. Rajkumar S.V., Kyle R.A., Therneau T.M. et al. Serum free light chain ratio is an independent risk factor for progression in monoclonal gammopathy of undetermined significance // Blood. 2005. - Vol. 106. - P. 812-817.
Поступила 05.12.2008.
