CC BY
135
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
УДК 579.22:631.465
doi: 10.15407/biotech8.03.056
ГАЛОФИЛЬНОСТЬ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СОЛОНЧАКОВ ЮЖНОГО КАВКАЗА
Э. Квеситадзе Грузинский технический университет, Тбилиси, Грузия
E-mail: blgeorgia@gmail.com
Получено 28.05.2015
Работа посвящена выделению, очистке, таксономической характеристике и оценке возможности практического использования в биотехнологических процессах сельского хозяйства культур гало-фильных микроскопических грибов из солончаков Восточной Грузии (средняя часть Южного Кавказа). Во всех почвенно-климатических зонах доминируют роды Aspergillus, Penicillium и Fusarium, затем Trichoderma и Mucor, остальные — встречаются сравнительно редко. Род Aspergillus широко представлен в каштановой почве и черноземе. В серой лесной почве преобладает Penicillium. По результатам экспедиций в засоленных регионах создана коллекция галофильных микроорганизмов, насчитывающая 96 изолятов микроскопических грибов. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что в почвах с сильной засоленностью преобладают галотолеранты и экстремальные галофилы и практически не представлены слабые галофилы. В слабозасоленных почвах крайне редко встречаются экстремальные галофилы и доминируют слабогалофильные формы грибов.
Ключевые слова: галофилы, микроскопические грибы, экстремофилы, энзимы.
Экстремофилы являются уникальными формами микроорганизмов и благодаря своей устойчивости к критическим условиям имеют высокий биотехнологический потенциал. Интуитивное применение микроорганизмов берет начало с античных времен, когда их использовали для приготовления засоленных продуктов питания, в производстве хлеба, сыра, вина и др. В настоящее время микроорганизмы, действующие в обычных и экстремальных условиях (высокие концентрации соли, низкие и повышенные температуры, крайние значения кислотности среды и пр.), широко используют в различных отраслях промышленности, в медицине и особенно активно — в сельском хозяйстве и пищевой промышленности. С учетом действия этих микроорганизмов разработаны биотехнологии, связанные с очисткой почвы и водоемов от токсических соединений. Использование препаратов энзимов в разных отраслях промышленности (при изготовлении моющих средств, в производстве этилового спирта и других органических растворителей, биоэтанола и др.) связано с энзимами, выделенными из экстремофильных микроорганизмов. Исследования экстремофилов особенно активизировались в последние 20 лет. Это, в частности, обусловлено новыми аспектами
практического применения галофильных микроорганизмов. В этой связи следует отметить галофильные консорциумы микроорганизмов, состоящие из бактерий, микроскопических грибов и актинобактерий, как саморазмножающиеся в солончаках формы микроорганизмов, часто изменяющие кислотность почв и способствующие существенному повышению урожайности риса, пшеницы, сои и других с/х культур [1-3].
В подавляющем большинстве в засоленных регионах соль глубоко проникает в почву и, как правило, ее удаление связано с серьезными проблемами. В необрабатываемых засоленных почвах устанавливается равновесие в диффузии соли между разными слоями почвы. В случае обильных осадков, способствующих вымыванию солей из верхних частей почвы, начинается диффузия соли из более глубинных слоев. И только благодаря продолжительным и систематическим осадкам проблема засоленности может быть решена естественным образом. В других случаях физические, химические и механические технологии, связанные со снижением концентрации соли в почвах, не дают желаемого результата, поскольку соль вновь диффундирует в верхние слои
56
Experimental articles
почвы, и в течение непродолжительного времени высокая концентрация соли в этих слоях вновь восстанавливается. Как было неоднократно показано, использование галофильных микроорганизмов является эффективным средством обработки засоленных почв, поскольку, уменьшая концентрацию соли и изменяя кислотность почвы, галофильные микроорганизмы существенно повышают урожайность почв.
Цель настоящей работы — выделение и оценка использования в сельском хозяйстве и биотехнологических процессах культур галофильных микроскопических грибов из солончаков Восточной Грузии (средняя часть Южного Кавказа), где их существование наиболее предположительно.
Материалы и методы
Для выделения экстремофильных микроорганизмов были взяты пробы почв из разных экологических ниш Южнокавказского региона, в частности из альпийской зоны (гумусно-карбонатные почвы), субальпийской зоны (горнолуговые почвы), влажной субальпийской климатической зоны (болотные и подзолистые почвы низменности), степной зоны (чернозем и каштановая почва), полупустынной зоны (каштановая, засолeнная почвa и солончаки), сухой субтропической климатической зоны (коричневая почва, чернозем и аллювиальная почва), континентальной климатической зоны (серая лесная и подзолистые почвы, вулканические породы). С целью выделения и изучения галофильных микромицетов были взяты образцы почв и воды из солончаков и соленых озер Восточной Грузии (Квемо Картли, Кахетия), имеющих общую протяженность вдоль и поперек Кавказского хребта, превышающую по длине 300 км, в частности:
- териториально удаленных друг от друга местностей Алазанской долины (длина до 150 км, ширина в среднем 50 км), характеризующихся местами сильной, средней и слабой засоленности;
- териториально удаленных друг от друга озер (Кумиси, Красногорск) и почв центральной долины Квемо Картли длиной свыше 180 км.
Первоначально для выделения культур микроскопических грибов из вышеупомянутых зон брали по 10 усредненных проб [4]. Микробиологические посевы проводили общепринятыми методами [5, 6].
Для выделения микроскопических грибов использовали синтетические питательные среды:
1. Универсальная среда следующего состава в пересчете на 1 л: 0,5 л пивного сусла 7 оВ; 0,5 л водопроводной воды; агар — 20,0 г (pH 5,5-6,0).
2. Окисленная среда Чапека (для подавления роста бактерий) (%): глюкоза — 2,0; NaNO3 — 0,91; KH2PO4 — 0,1; MgSO4 • 7H2O — 0,05; KCl — 0,05; FeSO4 • H2O — 0,002, агар — 2,0 (pH 3,5-4,2).
3. Среда Чапека-Догса (%): сахароза — 3,0; NaNO3 — 0,2; K2HPO4 — 0,1; MgSO4 • 7H2O — 0,05; KCl — 0,05; FeSO4 • H2O — 0,001; агар — 2,0 (pH 4,5-5,0).
Режим стерилизации — 0,5 атм в течение 30 мин. Культивирование грибов проводили в поверхностных и глубинных условиях при температурных режимах от 28 до 55 °С, в течение от 3 до 10 дней. Для выделенных культур грибов сначала определяли таксономическую принадлежность (класс, порядок), что устанавливалось оценкой особенностей репродуктивных органов. После первичного выделения микрофлоры из почв, из первичных посевов, путем многократных пересевов выделены чистые культуры галофильных микромицетов, для идентификации которых использовали специальные определители [7-9].
Колониеобразующие единицы (КОЕ) выделенных микроскопических грибов определяли с пересчетом на 1 г сухой почвы по формуле: A = abv/g [10].
С целью установления степени экс-т ре мо фильности выделенных культур микромицеты выращивали при температуре 5-55 °С, с интервалом 5 °С, при рH от 2,0 до 10,0, с интервалом 0,5. Для выявления галофильных культур в исходную питательную среду вносили NaCl в разных концентрациях — от 0,5 М до 4 М (соответственно 2,93%-23,2%). Галофильные микроорганизмы устойчивы к высокому осмотическому давлению. Экстремальные галофилы развиваются в жидких питательных средах, содержащих 25% NaCl, и вследствие приобретенных высоких адаптационных способностей даже не растут в отсутствие высоких концентраций соли [11, 12].
В солончаках Южного Кавказа, где 7-8 млн. лет тому назад в течение длительного периода было море и, следовательно, концентрация соли довольно высокая, для выделения культур и установления степени
57
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
галофильности почвенных микроорганизмов использовали агаризованную среду, содержащую от 0 до 4М NaCl, при разных значениях температуры. Это позволило не только выделить галофильные микроскопические грибы из засоленных почв, но и в зависимости от оптимальных для роста концентраций соли классифицировать их на слабые, умеренные, галотолерантные и экстремальные галофилы.
В частности, группу умеренных галофилов составили культуры микроскопических грибов, для существования которых нужна среда обитания с 0,5 М NaCl. Для культур умеренно галофильных микромицетов оптимальная для роста концентрация соли приблизительно такая же (0,5 М NaCl), но максимальная концентрация соли, при которой они способны существовать, составляла 3 М NaCl. К умеренным галофилам следует отнести культуры грибов с интенсивным ростом и при 1,5-2,0 М NaCl. Галотолерантные микроскопические грибы характеризуются оптимальным ростом в диапазоне концентрации соли, соответствующей 1,5-2,0 молярной концентрации NaCl. Экстремальным галофилам для инициации и нормального роста требуется концентрация соли не менее 1 M NaCl. Оптимальной концентрацией соли для роста экстремальных галофилов считается 2,5-3 М NaCl, хотя эти культуры выдерживают (сохраняют характерные признаки метаболизма) и при концентрации соли, равной 4 M NaCl.
Скрининг галофильных микромицетов — продуцентов гидролаз осуществляли при глубинном культивировании. Посевным материалом служила суспензия конидий 10-дневных культур. Глубинное культивирование отдельных штаммов микроскопических грибов проводили в 750 мл конических колбах Эрленмейера, на термостатической качалке (180-200 об/мин), при температуре 30 °С, в течение 72-120 ч.
Для выявления продуцентов целлюлаз проводили глубинное культивирование в жидкой питательной среде такого состава (%): микрокристаллическая целлюлоза — 0,1; NaN03 — 0,3; KH2PO4 — 0,2; MgSO4 • 7H2O — 0,05; экстракт кукурузы — 1,5; pH 5,0-5,5.
С целью выявления продуцентов ксиланаз глубинное культивирование проводили в жидкой среде, в состав которой входили (%): соевая мука — 3,0; Na2HPO4 — 1,5; (NH4)2SO4 — 0,2; KCl — 0,05; MgSO4 — 0,015; pH 4,2.
Для определения продуцентов амилаз глубинное культивирование осуществляли в жидкой среде такого состава (%): крахмал — 6,0; NaN03 — 0,91; KH2pO4 — 0,1; MgSO4 • 7H2O — 0,05; KCl — 0,05; FeSO4 • H2O — 0,0002; солодовые ростки — 3,0; pH 5,0-5,5.
Продуценты протеаз определяли в глубинных условиях на среде, в состав которой входили (%): KN03 — 0,1; KH2PO4 — 0,1; MgSO4 • 7 H2O — 0,007; KCl — 0,05; FeSO4 • H2O — 0,005; дрожжевой экстракт — 0,5; казеин — 0,1; pH 5,0.
Продуценты пектиназ выявляли глубинным культивированием в жидкой среде следующего состава (%): лактоза — 0,1; глюкоза — 0,1; KH2PO4 — 0,3; (NH4)2 SO4 — 0,5; MgSO4 — 0,03; pH 5,0.
Активность энзимов определяли общепринятыми международными методами [13-19].
Результаты и обсуждение
В результате многочисленных экспедиций — с 1978 по 1994, а затем с 1996 по 2010 гг. — в разных регионах Грузии было выделено свыше 6 500 культур бактерий, микроскопических грибов и актинобактерий.
Проведенные нами исследования показали: микрофлора сухой субтропической и степной климатических зон многочисленна, но сравнительно однообразна. Это характерно и для континентальной климатической зоны. Микрофлора альпийской и субальпийской зон также разнообразна, но малочисленна. Микрофлора полупустынной зоны немногочисленна и весьма специфична.
Среди выделенных микроскопических грибов установлены доминантные роды. Следует отметить, что во всех почвенноклиматических зонах доминируют роды Aspergillus, Penicillium и Fusarium, затем Trichoderma и Mucor. Остальные роды встречаются сравнительно редко. Род Aspergillus также широко представлен в каштановой почве и черноземе, а в серой лесной почве преобладает род Penicillium (рис. 1).
Полученные результаты показали, что во всех почвенно-климатических зонах Восточной Грузии определяются микроскопические грибы как доминантный таксономический вид микроорганизмов, которые по-разному реагируют на температуру. Среди микроскопических
58
Experimental articles
Рис. 1. Частота встречаемости родов микроскопических грибов в разных почвах Южного Кавказа
грибов, выделенных из почв наиболее жаркого региона (Сигнаги), преобладают термофилы и термотолеранты. Среди микромицетов, выделенных из кислой и щелочной почв, чаще встречаются ацидо- и алкалифилы. Большинство галофильных штаммов выделены из сильно засоленных почв и солончаков и растут в основном в широком диапазоне pH. Особую группу составляют галоалкалофилы, растущие при высоких концентрациях соды и сочетающие свойства галофилов и алкалофилов. Таким образом, на основе проведенных селекционных работ создана коллекция экстремофильных (термо-, ацидо-, алкали- и галофильных) микроскопических грибов, насчитывающая 234 культуры. С целью более детальной качественной оценки галофильных микроскопических грибов выбраны два региона Восточной Грузии — равнинные солончаки Кахетии и Квемо Картли, характеризующиеся особенно высокой концентрацией соли, где, по имеющимся данным, могли концентрироваться галофильные микромицеты [20].
Установлено, что наиболее многочисленной и разнообразной галофильной микрофлорой, включая микроскопические грибы, характеризуются почвы в непосредственной близости от соленого озера Кумиси (Картли) и периферийных частей Алазанской долины, расположенных вдоль Кавказского хребта (Кахетия).
Выбранные для селекции галофильных микромицетов регионы действительно
оказались местами интенсивного обитания галофилов. Всего в результате экспедиций по солончакам Восточной Грузии выделено 196 галофильных культур микроскопических грибов, из них 94 — из засоленных почв Кахетинского региона и 102 — из солончаков Квемо Картли. Другая серия галофильных микроскопических грибов выделена из сильно засоленных озер в административном центре Сигнаги (поселок Красногорск) — 20 культур. Данные опытов приведены в табл. 1 и 2.
В результате опытов по анализу и селекции галофилов, встречаемых в солончаках Кахетинской равнины, выделены 4 культуры экстремально галофильных микромицетов, 14 галотолерантных, 16 умеренных и 10 слабогалофильных штаммов. После определения видовой принадлежности установлено, что из 4 экстремально галофильных культур 3 — представители рода Aspergillus. Группу галотолерантов составили культуры, относящиеся к родам AspergШus, Fusarium, Allesheria и Penicillium. Умеренные галофилы были представлены практически всеми существующими в регионе родами микроскопических грибов.
По некоторым данным [21], в солончаковых почвах галотолерантные формы микроорганизмов, занимающие усредненное положение по степени галофильности, количественно доминируют не только над нега-лофильнымы микроорганизмами, но и над другими формами галофилов той же таксономической группы. По результатам наших
59
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
Таблица 1. Культуры галофильных микроскопических грибов, выделенных в Восточной Грузии (Кахетия)
№ Mикроскопический гриб Среда выделения культур Отношение к концентрации NaCl (M) Оптимальная концентрация роста NaCl (M) Степень галофильности
1 Aspergillus sp. A 25 Сильнозасоленная зона 1M-4M 3M Экстремальный галофил
2 Aspergillus sp. A 26 1M-4M 3M Экстремальный галофил
3 Aspergillus sp. A 27 0,2M-3M 2,5M Галотолерант
4 Aspergiluus sp. A28 0,5M-3M 2,5M Галотолерант
5 Aspergillus sp. A29 1M-4M 3M Экстремальный галофил
6 Aspergillus sp. A30 0,5M-3M 2,5M Умеренный галофил
7 Aspergillus sp. A31 0,2M-3M 3M Галотолерант
8 Penicillium sp. A32 0,5M-3M 2,5M Умеренный галофил
9 Penicillium sp. A33 0,2M-3,5M 2,5M Галотолерант
10 Penicillium sp. A34 0,2M-3,5M 3M Галотолерант
11 Penicillium sp. A35 0,2M- 4M 3M Галотолерант
12 Chaetomium sp. A 37 0,2 M -3,5M 3M Галотолерант
13 Chaetomium sp.A36 0,2 M -3,5M 3M Галотолерант
14 Chaetomium sp. A38 0,2 M -3,5M 2,5M Галотолерант
15 Chaetomium sp. A39 0,5 M -3M 3M Умеренный галофил
16 Fusarium sp. A 43 1 M — 4M 3M Экстремальный галофил
17 Fusarium sp. A44 0,2M-3M 3M Галотолерант
18 Trichoderma sp. A 40 0,2M-3M 3M Галотолерант
19 Trichoderma sp. A 41 0,2M-3M 2,5M Галотолерант
20 Trichoderma sp. A 42 0,5M-3,5M 3M Умеренный галофил
21 Aspergillus sp. A13 Среднезасоленная зона 0,5M-3M 3M Умеренный галофил
22 Aspergillus sp. A14 0,5M-3M 3M Умеренный галофил
23 Penicillium sp. A15 0,2M-3M 3M Галотолерант
24 Penicillium sp. A16 0,5M-3M 2,5M Умеренный галофил
25 Penicillium sp. A17 0,5M-3M 2,5M Умеренный галофил
26 Penicillium sp. A18 0,5M-3M 2,5M Умеренный галофил
27 Penicillium sp.A19 0,5M-3M 2,5M Умеренный галофил
28 Penicillium sp. A20 0,2M-3,5M 2,5M Галотолерант
29 Cladosporium sp. A21 0,5M-3M 2,5M Умеренный галофил
30 Cladosporium sp. A22 0,5M-3M 2,5M Умеренный галофил
31 Mucor sp. A23 0,5M-3M 2,5M Умеренный галофил
32 Mucor sp. A24 0,5M-3M 2,5M Умеренный галофил
33 Aspergillus sp. A1 ей И О СО Ч ей И И 0) Ч О о ей СО О О ей ч о 0,2M-2M 1,5M Слабый галофил
34 Aspergillus sp. A2 0,2M-2M 1,5M Слабый галофил
35 Aspergillus sp.A3 0,1M-2M 1,5M Слабый галофил
36 Aspergillus sp.A4 0,1M-2M 1,5M Слабый галофил
37 Penicillium sp.A5 0,2-2,5M 1,5M Слабый галофил
38 Penicillium sp. A6 0,5M-3M 2,5M Умеренный галофил
39 Aspergillus sp. A11 0,2-2,5M 1,5M Слабый галофил
40 Aspergillus sp. A12 0,1-2M 1,5M Слабый галофил
41 Fusarium sp.A7 0,15-0,2M 1,5M Слабый галофил
42 Fusarium sp. A8 0,1-2,5M 1,5M Слабый галофил
43 Fusarium sp. A9 0,1-2,5M 1,5M Слабый галофил
44 Fusarium sp. A10 0,2-3M 2M Галотолерант
60
Experimental articles
Таблица 2. Культуры галофильных микроскопических грибов, выделенных в Восточной Грузии (Картли)
№ Mикроскопический гриб Отношение к концентрации NaCl (M) Оптимальная концентрация роста NaCl (M) Степень галофильности
1 2 3 4
1 Aspergillus niger K10-15 0,2 M-3M 3M Галотолерант
2 A. niger K 2-12 0,2 M-3M 2,5M Галотолерант
3 A. niger K 8-16 0,2 M-3,5M 2,5M Галотолерант
4 A. niger K 2-1 1 M-4M 3M Экстремальный галофил
5 Aspergillus flavus K2-8 0,5 M-3M 2,5M Умеренный галофил
6 Aspergillus sp. K-1 1 M-4M 3M Экстремальный галофил
7 Aspergillus sp.K-2 0,2M-4M 3M Галотолерант
8 Aspergillus sp. K-3 0,2 M-2,0M 1M Слабый галофил
9 Aspergillus sp. K-4 0,5 M-3,5M 2,5M Галотолерант
10 A. niger K M6-11 0,5 M-2M 1M Слабый галофил
11 A. niger K M11-18 1 M-4M 3M Экстремальный галофил
12 A. niger KM2-5 0,3 M-2,0M 1M Слабый галофил
13 A. niger K M2-2 0,2 M-2,5M 2M Галотолерант
14 Penicillium sp. KM-5 0,5 M-3M 2,5M Умеренный галофил
15 Penicillium sp. KM-6 0,5 M-3M 2,5M Умеренный галофил
16 Penicillium sp. KM-7 0,2 M-3M 2,5M Галотолерант
17 Penicillium sp. KM-8 0,2 M-3M 3M Галотолерант
18 Penicillium sp. K-5-13 0,2 M-4M 2,5M Галотолерант
19 Penicillium sp. K-9 1 M-4M 3M Экстремальный галофил
20 Penicillium sp. K3-3 0,5 M-3M 2,5M Умеренный галофил
21 Penicillium sp. K6-2 0,2M-3M 2,5M Галотолерант
22 Penicillium sp. KM-19 0,2 M-2,0M 1M Слабый галофил
23 Penicillium sp. KM3-17 0,2 M-4M 2,5M Галотолерант
24 Penicillium sp. KM4-4 1 M-4M 3M Экстремальный галофил
25 Penicillium sp.KM6-3 0,5 M-3M 2,5M Умеренный галофил
26 Penicillium sp. KM6-1 0,2 M-3M 2,5M Галотолерант
27 Penicillium sp. KM-10 1 M-4M 3M Экстремальный галофил
28 Penicillium sp. K-12 0,2M-3M 2,5M Галотолерант
29 Penicillium sp. KM-11 0,2 M-3M 2,5M Галотолерант
30 Penicillium sp KM-27 0,2 M-4M 2,5M Галотолерант
31 Penicillium sp.KM-28 0,2 M-4M 2,5M Галотолерант
32 Trichoderma sp. K2-3 0,2 M-3M 2,5M Галотолерант
33 Trichoderma sp. K2-6 0,5 M-3M 2,5M Умеренный галофил
34 T. lignrtum K2-7 0,5 M-3M 2,5M Умеренный галофил
35 Chaetomium sp. KM4-2 0,2 M-3,5M 2,5M Галотолерант
36 Chaetomim sp.KM1-3 0,5 M-3M 2,5M Умеренный галофил
37 Chaetomium sp.KM-14 0,5 M-3M 2 M Слабый галофил
38 Chaetomium sp. KM-15 0,5 M-3M 2,5 M Умеренный галофил
39 Chaetomium sp. KM-16 0,5 M-3M 0,5-3M Умеренный галофил
40 Chaetomium sp.KM-17 0,2 M-3M 2,5 M Галотолерант
61
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
табл. 2. окончание
1 2 3 4 5
41 Fusarium sp. KM3-1 0,2 M-4M 3M Галотолерант
42 Fusarium sp. KM3-5 1 M-4M 3M Экстремальный галофил
43 Fusarium sp. KM6-1 0,2 M-3M 2,5M Галотолерант
44 Fusarium sp. KM-18 0,2 M-3M 2,5M Галотолерант
45 Mucor sp. K-19 0,5 M-3M 2,5M Умеренный галофил
46 Mucor sp. K-20 0,5 M-3M 2,5M Умеренный галофил
47 Mucor sp. K-21 0,5 M-3M 2,5M Галотолерант
48 Mucor sp. K-22 0,2 M-2,0M 1,5M Слабый галофил
49 Rhizopus sp. K-23 0,2 M-3M 2,5M Галотолерант
50 Rhizopus sp.K-24 0,2 M-2M 1M Слабый галофил
51 Rhizopus sp. K-25 0,2 M-3M 2,5M Галотолерант
52 Rhizopus sp. K-26 0,2 M-2M 1M Слабый галофил
исследований большинство микрофлоры в солончаках равнин Квемо Картли составили га-лотолерантные формы микромицетов (рис. 2).
В солончаках соленых озер Кумиси и Красногорска установлено наличие 25 га-лотолерантных штаммов, 7 культур отнесены к экстремальным, 12 — к умеренным и 8 — к слабым галофилам. Следует отметить, что во всех родах микроскопических грибов, идентифицированных в солончаках этого региона, встречаются преимущественно галотолерантные формы микромицетов. Жизненный рН-диапазон подавляющего большинства галофильных культур колеблется в пределах кислотности от рН 3,0-4,0 до 8,0-10,0. Как показывают наши экспериментальные данные, для галоалкалифилов рН-диапазон роста и метаболической активности сдвинут в щелочную сторону — до рН 12,5. Несомненно, существование галоал-калифилов в средах обитания галофильных микроорганизмов — важный и интересный факт, поскольку щелочные среды в солончаках Восточной Грузии встречаются довольно часто и развиваться там могут только галото-лерантные формы микроскопических грибов и бактерий.
Таким образом, по результатам экспедиций в засоленных регионах создана коллекция галофильных микроорганизмов, в которой содержится 96 культур микроскопических грибов. Проведенные исследования свидетельствуют, что в большинстве случаев, например в почвах с сильной засоленностью, преобладают галотолеранты и экстремальные галофилы и практически не встречаются слабые галофилы. В свою очередь, в слабоза-
соленных объектах крайне редко встречаются экстремальные галлофилы и доминируют слабогалофильные формы грибов (рис. 3).
Следует отметить, что созданная нами коллекция экстремофильных (галофиль-ных) микроскопических грибов, насчитывающая более 300 культур, является одной из нескольких во всей Европе. Коллекция объединяет культуры галофилов, галоалка-лифилов, галотермофилов, термофилов, ал-калифилов, алкалитермофилов, ацидофилов и ацидотермофилов.
Определение степени экстремофильности микроскопических грибов в солончаках Грузии
Известно, что жизненные границы микроорганизмов определяет рН среды обитания. В природе чаще встречаются экосистемы с нейтральной или средней кислотностью, вследстствие чего большинство микроорганизмов адаптировано к существованию в условиях умеренной концентрации водородных ионов (околонейтральной рН); однако существуют микроорганизмы, способные к росту при рН среды, существенно удаленной от нейтральной. Наглядным примером является наличие галоалкалифилов в солончаках. Базируясь на этой информации, можно было предположить наличие галоалкалифи-лов в созданной нами коллекции галофиль-ных микроскопических грибов [22].
В табл. 3 и 4 представлены галофильные культуры грибов, проявляющие экстремальность по отношению к рН среды. Как видно из табл. 3, из 44 штаммов микроскопических
62
Experimental articles
Рис. 2. Частота встречаемости родов микроскопических грибов, распространенных в солончаках равнины Квемо Картли
грибов, выделенных из солончаков Кахетии, 15 галофилов оказались экстремальными относительно кислотности среды. Среди них преобладали алкалифилы (10 культур). Сравнительно реже встречались рН-толеранты (5 культур). Почвы сильной степени засоленности также характеризовались обилием экстремофильных по отношению к рН микроорганизмов (9 экстремофилов). Из зоны средней степени засоленности отобраны лишь 2, а из зоны слабой засоленности — 4 экстремофильных гриба.
Известно, что некоторые представители родов Penicillium, Fusarium и Aspergillus способны к росту в диапазоне рН 2,0-10,0 [23]. Выявлены галофильные грибы, характеризующиеся рН-толерантностью и принадлежащие именно к этим родам. Наличие га-лоалкалифилов не установлено лишь в родах Allesheria и Cladosporium (табл. 3).
Рис. 3. Частота встречаемости галофильных микроскопических грибов в соленых почвах Кахетинской равнины
Подобно микрофлоре солончаков Кахетинской равнины, в выделенной микрофлоре засоленных почв Квемо Картли определялись алкалифильные штаммы (11 культур) (табл. 4). Кроме родов Chaetomium и Mucor, алкалифилы встречались почти среди всех родов микроскопических грибов, распространенных в солончаках равнины Квемо Картли, а рН-толерантные формы были характерны только для культур микроскопи-чексих грибов родов Aspergillus, Chaetomium и Fusarium.
Пять культур алкалифильных микроскопических грибов из коллекции солончаков Кахетинской равнины были оценены как экстремофилы одновременно по трем параметрам устойчивости — к рН, температуре и концентрации NaCl (Aspergillus sp. A 25, Chaetomium sp. A 36, Trichoderma sp. A40, Trichoderma sp. A41, Fusarium sp.
Таблица 3. Экстремофильные по рН микроскопические грибы, распространенные в солончаках Кахетинской равнины
№ Микроскопический гриб Место взятия пробы Жизненный рН-диапазон культуры Оптимальное значение рН Характеристика культуры
1 Aspergillus sp. A25 Почвы сильной степени засоленности 5,0-10,0 9,0 Алкалифил
2 Aspergillus sp. A26 5,0-10,0 9,0 Алкалифил
3 Aspergillus sp. A29 2,5-10,0 4-8,0 рН-толерант
4 Aspergillus sp. A31 2,5-10,0 4-8,0 рН-толерант
5 Penicillium sp. A33 2,5-10,0 3,5-7,5 рН-толерант
6 Penicillium sp. A34 4,5-10,0 9,0 Алкалифил
7 Chaetomium sp. A36 4,5-10,0 9,0 Алкалифил
8 Trichoderma sp.A40 4,5-10,0 9,0 Алкалифил
9 Trichoderma sp.A41 4,5-10,0 9,0 Алкалифил
10 Mucor sp. A-23 Почвы средней степени засоленности 4,5-10,0 4,0 Алкалифил
11 Mucor sp. A-24 4,5-10,0 5,5 Алкалифил
12 Aspergillus sp. A2 Зона слабой степени засоленности 4,5-10,0 9,0 Алкалифил
13 Fusarium sp. A7 2,5-10,0 4,5-8,0 рН-толерант
14 Fusarium sp. A8 2,5-10,0 4,5-8,0 рН-толерант
15 Fusarium sp. A10 4,5-10,0 9,0 Алкалифил
63
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
Таблица 4. Экстремофильные по рН микроскопические грибы, распространенные в солончаках равнины Квемо Картли
№ Микроскопический гриб Жизненный рН-диапазон культуры Оптимальное значение рН Экстремофильность культуры
1 Aspergillus niger K10-15 2,5-10,0 О 1 -4 О рН-толерант
2 Aspergillus niger K 2-1 4,0-10,0 9,0 Алкалифил
3 Aspergillus niger K2-8 4,0-10,0 9,0 Алкалифил
4 Aspergillus niger K-2 2,0-10,0 О 1 -4 О рН-толерант
5 Aspergillus niger KM2-5 4,0-10,0 9,0 Алкалифил
6 Aspergillus niger KM2-2 4,0-10,0 9,0 Алкалифил
7 Penicillium sp. KM-8 2,5-10,0 О 1 -4 О рН-толерант
8 Penicillium sp. K6-2 4,0-10,0 9,0 Алкалифил
9 Penicillium sp. KM3-17 2,5-10,0 сл 0 1 -4 О рН-толерант
10 Penicillium sp. KM6-3 4,0-10,0 9,0 Алкалифил
11 Penicillium sp. KM-12 2,5-10,0 ел 0 1 -4 О рН-толерант
12 Trichoderma sp. K2-6 5,0-10,0 9,0 Алкалифил
13 Trichoderma sp. K2-6 4,0-10,0 9,0 Алкалифил
14 Trichoderma lignetum. K2-7 4,0-10,0 9,0 Алкалифил
15 Chaetomium sp. KM-15 2,5-10,0 сл 0 1 -4 О рН-толерант
16 Fusarium sp. KM3-1 2,5-10,0 СЛ 0 1 -4 О рН-толерант
17 Fusarium sp. KM6-1 5,0-10,0 9,0 Алкалифил
18 Rhizopus sp. K-24 4,0-10,0 9,0 Алкалифил
A10), а из микрофлоры солончаков равнины Квето Картли экстремофильными оказались 4 культуры (табл. 5).
С целью характеристики выделенных из разных экологических ниш Кавказа экстре-мофильных культур микроскопических грибов проведен скрининг продуцентов энзимов (а-амилаза, глюкоамилаза, целлюлаза, кси-ланаза, протеиназа и пектиназа) в условиях глубинного культивирования [24].
В результате выявлены 27 штаммов-про-дуцентов а-амилазы, 43 — глюкоамилазы, 42 — целлюлазы, 16 — ксиланазы, 4 — про-теиназы и 2 — пектиназы (опыты продолжаются). Из них 17 культур характеризуются способностью продуцирования двух энзимов, а 25 культур-продуцентов энзимов являются экстремофилами по двум признакам.
Наиболее активные продуценты а-амилаз — черные и зеленовато-желтые аспергиллы-галофилы. Среди продуцентов целлюлаз преобладают роды Aspergillus, Сhaеtomium и Penicillium [25].
Метаболическую активность галофиль-ных/галоалкалифильных микроскопиче-
ских грибов оценивали и по их способности осуществлять детоксикацию контаминантов разной химической структуры. С этой целью грибы-галофилы инкубировали с токсическими соединениями как в поверхностных, так и в погруженных (глубинных) условиях культивирования. В частности, в питательную среду вносили бензол, тринитротолуол (ТНТ) и углеводороды нефти (в отдельных опытах радиоактивные по углеродному атому).
Рассматриваемый вопрос может стать предметом отдельного патента или объемной публикации, а здесь отметим, что некоторые грибы галофилы являются активными деструкторами всех вышеуказанных токсических соединений, существенно понижая их концентрации, а в ряде случаев полностью метаболически трансформируя углеродный скелет токсикантов (окислительная деградация) до уровня обычных клеточных метаболитов. Несомненно, детоксикационная активность галофильных микроскопических грибов дает основание по-новому оценить их экологический потенциал.
64
Experimental articles
Таблица 5. Разносторонние экстремофильные микроскопические грибы, распространенные в солончаках Грузии
Зона Название культуры Характеристика культуры
Регион Кахетии Aspergillus sp. A26 Алкалифил, термофил, экстремальный галофил
Chaetomium sp. A36 Алкалифил, термофил, галотолерант
Trichoderma sp. A40 Алкалифил, термотолерант, галотолерант
Trichoderma sp. A41 Алкалифил, термотолерант, умеренный галофил
Fusarium sp. A10 Алкалифил, психротолерант, галотолерант
Регион Квемо Картли Aspergillus sp. К2 рН-толерант, термофил, галотолерант
Aspergillus sp. КМ 2-2 Алкалифил, термотолерант, галотолерант
Trichoderma sp. К 2-6 Алкалифил, термофил, умеренный галофил
Fusarium sp. К 3-1 рН-толерант, психротолерант, галотолерант
REFERENCES
1. Oren A. Bioenergetic Aspects of Holophilism. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1999, 63 (2), 334-348.
2. Rengpipat S, Lowe S., Zeikus J. Effect of Extreme Salt Concentration on the Physiology and Biochemistry of Halobacterioides acetoethilicus. J. Bacteriol. 1988, 3 (65), 3071.
3. Rothschild L. J., Giver L. J., White M. R., Mancinelli R. L. Metabolic activity of microorganisms in evaporates. J. Mycol. 1994, V. 30, P.431-438.
4. Fomin G. S, Fomin A. G. Soil. Monitoring on quality and ecologic safety in accordance with international standards. Moscow (VNII standard). 2001, P. 86.
5. Zviagintsev D. G. Methods of Soil Microbiology and Biochemistry. Moscow State University.
1980, P. 12-19.
6. Waksman S. A. Soil fungi and their activities. Soil. Sci. 1916, 2 (1), 103-105.
7. Litvinov M. A. Determinates of microscopic soil fungi. Leningrad. 1967, 280 p.
8. Malloch D. Moulds, Their Isolation, Cultivation, and Identification. University of Toronto Press. Toronto-Buffalo-London.
1981, 114 p.
9. Frank M. Dugan. The Identification of Fungi. The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota U S A. 2006, 134 p.
10. Dudka N. A. The methods of experimental mycology. Kiev. 1982, 439 p. (In Russian).
11. Ventosa A., Nieto J. J., Oren A. Biology of Moderately Halophilic Aerobic Microorganisms. MMBR. 1998, V. 62, P. 504-544.
12. Demirjian D. C., Moris-varas F, Cassidy C. S. Enzymes from extremophiles. Cur. Op. Chem. Biol. 2001, V. 5 (2), 144-151.
13. Rukhlyadea A. P., Goryacheva M. T. Determination of enzymes amylolytic
activity. Enzymes and alcohol industry. 1960, V. 1, P. 9.
14. Dahlguist A. J. Determination of glucoamylase activity. Biochem. 1961, V. 80, P. 547.
15. Ghose T. K. Measurement of cellulase activities. Pure Appl. Chem. 1987, V. 59, P. 257-268.
16. Somogyi M. Determination of reducing sugars. J. Biol. Chem. 1952, V. 195, P. 199-228.
17. Nelson N. A. Protometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. J. Biol. Chem. 1944, P. 153-157.
18. Anson M. Z. The estimation of pepsin, trypsin, papain and cothepsin with hemoglobin. Gen. Physiol. 1938, 22 (1), 79-83.
19. Kvesitadze E., Adeishvili E., Gomarteli M., Kvachadze L., Kvesitadze G. Cellulase and xylanase activity of fungi in a collection isolated from the southern Caucasus. Intern. Biodeter. Biodegr. 1999, V. 43, P. 189-196.
20. Lizama C., Monteoliva-Sanchez M, Suarez-Garcia A., Rosello-Mora R., Aguilera M., Campos V., Ramos-Cormenzana A. Halorubrum tebenquichense sp. nov., a novel halophilic archaeon isolated from the Atacama Saltern, Chile. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002, V. 52, P. 149-155.
21. Hildebrant U., Janetta K., Ouziad F., Renne B., Nawrath K., Bothe H. Arbuscular micorrhizal colonization of halophytes in central European salt marshes. Micorrhiza. 2001, V. 10, P.175-183.
22. Razak A. A., Bachmann G., Ali Th. M., Far-rag R. Activities of microflora in soils of upper and lower Egypt. African J. Mycol. Biotech. 1999, 7 (1), 1-19.
23. Kvesitadze G. I. Enzymes of Microorganisms Living under Extreme Conditions. Ed.
65
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
W. Kretovich. Moskva: Nauka. 1990, 52 p. (In Russian).
24. Kvesitadze G. I., Kvachadze L. L., Kvesita-dze E. G. Selection of thermophilic cellulase-producing micromycetes. Appl. Biochem. Microbiol. 1997, V. 33, P. 132-137.
25. Kvesitadze E. G., Nizharadze D. N., Buachidze T. Sh., Kvesitadze G. I. Thermostability and physical-chemical properties of endo- and exoglucanases of thermophilic microscopic fungi. Biochemistry. 1997, V. 62, P. 176-183.
ГАЛОФІЛЬНІСТЬ МІЦЕЛІАЛЬНИХ ГРИБІВ, ВИДІЛЕНИХ ІЗ СОЛОНЧАКІВ ПІВДЕННОГО КАВКАЗУ
Е. Квесітадзе
Грузинський технічний університет, Тбілісі, Грузія
E-mail: blgeorgia@gmail.com
Роботу присвячено виділенню, очищенню, таксономічній характеристиці та оцінюванню можливості практичного використання в біотехнологічних процесах сільського господарства культур галофільних мікроскопічних грибів із солончаків Східної Грузії (середня частина Південного Кавказу). В усіх ґрунтово-кліматичних зонах домінують роди Aspergillus, Penicillium і Fusarium, далі Trichoderma та Mucor, решта — трапляються порівняно рідко. Рід Aspergillus широко представлений у каштановому ґрунті й чорноземі. У сірому лісовому ґрунті переважає Penicillium. За результатами експедицій у засолених регіонах створено колекцію га-лофільних мікроорганізмів, що налічує 96 ізолятів мікроскопічних грибів. Проведені дослідження свідчать про те, що в ґрунтах із сильною засоленістю переважають галотоле-ранти та екстремальні галофіли і практично відсутні слабкі галофіли. У слабозасолених ґрунтах вкрай рідко трапляються екстремальні галофіли, а домінують слабогалофіль-ні форми грибів.
Ключові слова: галофіли, мікроскопічні
гриби, екстремофіли, ензими.
THE HALOPHILICITY OF FILAMENTOUS FUNGI ISOLATED FROM SALINE SOILS OF SOUTH CAUCASUS
E. Kvesitadze
Georgian Technical University,
Tbilisi, Georgia
E-mail: blgeorgia@gmail.com
The work is devoted to the isolation, purification, determination of taxonomical characteristics and application in soil improvement and other biotechnological processes halophilic microscopic fungi strains isolated from saline soils of Eastern Georgia (middle part of South Caucasus), where their existence is maximally supposed. In all soil-climatic zones the dominate forms of spread fungi are genera Aspergillus, Penicillium and Fusarium, followed by Trichoderma and Mucor. Other genera are met less intensively. The genera Aspergillus is widely spread in chestnut soils and in black soil, in green forest soils the genera Penicillium is prevailing. According to the results of our expeditions to the regions with high salinity, the collection of 96 halophilic microscopic fungi has been created. The investigations showed that halotolerants and extreme halophiles dominanted in highly saline soils, while weak halophiles were practically absent. In the soils with weak salinity weak halophiles prevailed.
Key words: halophiles, microscopic fungi, extre-mophiles, enzymes.
66
