CC BY
18
treatment options. 16 adult pts (median age 22, range 16 — 51 y.o.) with refractory cGVHD were enrolled. 6 pts were on steroids upon inclusion. 11 patients had severe (NIH) cGVHD, 6 — moderate, and have received 1—3 anti-cGVHD treatments before IL-2. Pts received IL-2 sc injections 1 MIU 3 times a week. Median duration of treatment was 2.5 moths (range 1 — 8 months). Partial clinical response was observed in 5 pts, complete response in 2 pts with overall response of 44 %. There
was an improvement of Karnofsky in 25 % of pts, reduction in NIH severity scores in 37.5 % of and any objective response also in 44 % of pts. With median follow-up of 14 months overall survival was 62.5 %, non-relapse mortality was 12.5 % (2 pts), 25 % of patients had a relapse of underlying disease.
Keywords: allogeneic HSCT, chronic graft-versus-host disease, bronchiolitis obliterans, interleukin-2.
© Коллектив авторов, 2015 г. УДК 616-006.446-036.11:616.419
И. М. Бархатов, Н. Ю. Цветков, А. И. Шакирова, Д. С. Романюк, О. Г. Смыкова, Л. С. Зубаровская, Б. В. Афанасьев
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА У ПАЦИЕНТОВ С ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ
Кафедра гематологии, трансфузиологии и трансплантологии Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова; Институт детской онкологии, гематологии и трансплантологии имени Р. М. Горбачевой, Санкт-Петербург
ВВЕДЕНИЕ
Согласно современным представлениям,основ-нойпричиной развития онкогематологических заболевании является наличие генетических аберрации, обусловливающих морфологические и функциональные особенности опухолевои популяции. Вместе с тем имеются данные о выявлении опухолевых маркеров в популяции стромальных клеток костного мозга [1—3].
Таким образом, современное понимание леике-могенеза может включать не только изучение роли специфических генетических мутации, но и влияние клеточного окружения, в котором происходит пролиферация и развитие гемопоэтических стволовых клеток, так называемых костно-мозговых ниш [4, 5], представленных клетками стромального микроокружения. Роль стромальных клеток костного мозга в регуляции гемопоэза была впервые описана в 60-х годах XX в. в ходе оригинальной работы А. Я. Фриденштеина [6]. Клетки стромы костного мозга представлены несколькими типами, среди которых наиболее изученнои и перспективнои с кли-ническои точки зрения является популяция мезен-химных стволовых клеток (МСК), обладающих способностью подавлять иммунные конфликты при
аллогеннои, трансплантации [8]; замещать и вос-становливать функции поврежденных негемопоэ-тическихтканеи [7], поддерживать кроветворение при котрансплантации с гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК) [9], что выражается в воз-деиствии на пролиферацию и дифференцировку ГСК различных ростков, включая миелоидные и лимфоидные предшественники.
Таким образом, изучение функции стромальных клеток в аспекте возможного участия в патогенезе онкогематологических заболеваний представляется актуальным.
Целью работы явилась сравнительная оценка пролиферативного потенциала стромальных клеток костного мозга (СККМ) от пациентов с острыми лейкозами и здоровых доноров при культивировании in vitro, их способности к поддержанию нормального гемопоэза и к дифференцировке клеток, а также анализ генно-экспрессионного профиля стромальных клеток костного мозга.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В исследование был включен материал 10 пациентов с диагнозом острый лейкоз (7 пациентов с острым миелоидным лейкозом, 1 пациент с острым лимфоб-ластным лейкозом и 1 пациент с ювенильным миело-моноцитарным лейкозом) в возрасте от 0 до 45 лет острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), а также 7 здоровых доноров в возрасте от 23 до 45 лет.После про-ведениямиелоэксфузии проводилась селекция ядро-содержащих клеток с последующей эксплантацией на культуральную поверхность с культуральной средой aMEM, содержащей 20 % сыворотки, а также антибиотики (пенициллин (100 U/ml), стрептомицин (100 mg/ml) («Gibco»). Культивирование проводили в стерильных закрытых чашках при температуре 37 оС в условиях абсолютнойвлажности и 5 % СО2 в воздухе. Все варианты культур исследовались в 2-х повторах. Для оценки пролиферативных характеристик СККМ проводился анализколониеобразующих единиц фибробластов (CFU-f) — колонии на 10 суток в чашке фиксировали 96о этиловым спиртом в течение 30 минут и окрашивали краской Романовского в разведении 1:10 в течение 30 — 40 минут. При анализе колонии дифференцировали как большие (более 20 клеток) и малые (менее 20 клеток).
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
С целью индукции остеогенной и адипогенной дифференцировки МСК-подобных клеток моно-слойной культуры ПК через 7—10 дней удаляли кондиционную среду и к прилипшей фракции клеток добавляли новую полную питательную среду (в качестве контроля), либо полную среду с индукторами дифференцировки. Индукция остеогенной дифференцировки достигалась добавлением в культуральную среду b-глицерофосфата 7х 10-3М; дексаметазона 1х 10-8М; аскорбиновой кислоты 2х 10-4М. Адипогенная дифференцировка мезенхи-мальных предшественников индуцировалась добавлением дексаметазона 1х 10-7М; инсулина 1х 10-9М. С целью выявления клеток, способных к дифференцировке в остеоциты, прилипшую фракцию клеток окрашивали по методу фон Косса или ализарином красным. Остеоциты выявляли по характерным включениям кальция черного или красного цвета соответственно. Для визуализации клеток монослойной культуры ПК, дифференцировавшихся в адипогенном направлении, клетки прилипающей фракции фиксировали в парах формалина в течение 10 минут и инкубировали в рабочем растворе судана красного О в течение 1 часа при комнатной температуре. Адипоциты выявляли по липидным включениям, окрашивающимся в ярко-оранжевый цвет.
Оценка гемостимулирующей активности проводилась в культуральной среде «агаровая капля-жидкая среда» [10]. В качестве источника колоние-стимулирующих факторов использовали монослой культуры прилипающих клеток костного мозга. В качестве клеток-мишеней были использованы яд-росодержащие клетки здорового донора. Колонии подсчитывали на 7 день культивирования. Колони-еобразующую способность (КОС) и кластерообра-зующую способность (КлОС) оценивали по числу колоний (малые колонии, содержащие 20 — 40 клеток; средние колонии — 41 — 100 клеток; большие колонии — более100 клеток) и кластеров (большие кластеры — 10—19 клеток; малые кластеры — 5 — 9 клеток).
Помимо этого проводилась оценка экспрессии генов факторов адгезии SELECTIN, CXCR4, VCAM и PECAMотносительно гена ABL. При постановке реакциииспользовался мастер-микс производства компании «Синтол» (Россия), адаптированный для ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени.
Статистическая обработка данных была проведена с использованием пакета программ для статистического анализа «Statistica», версия 6.0. В случае обнаружения статистически значимых различии проводилось последующее попарное сравнение вариационных рядов исследуемых групп с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни для двух независимых выбо-
Рис. 1. Колониеобразующая единица фибробластов (КОЕ-Ф)
рок. Корреляции между вариационными рядами оценивали с использованием коэффициента корреляции Спирмана (г). Значения р<0,05 считались статистически значимыми.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При оценке пролиферативных характеристик стромальных клеток было выявлено увеличение пролиферативной активности клеток стромальной популяции костного мозга пациентов по сравнению со здоровыми донорами, выражающейся в увеличении числа как больших (р = 0,02), так и малых колоний (р = 0,01) СККМ (рис. 1).
Изменения пролиферативной активности могут быть обусловлены как воздействием опухолевого клона, так и предшествующими курсами химиоте-
ш* л
кы__^_._^_
Рис. 2. Структура КОЕ-Ф остеогенных предшественников. Окраска ализарином красным. Увеличениех 100
Рис. 3. Структура КОЕ-Ф адипогенных предшественников. Окраска Суданом красным О. Увеличениех 100
рапии, что требует более детального изучения в выявлении ключевого фактора.
При оценке гемостимулирующей активности СККМ нами были получены данные оболее выраженной способности к поддержке гемопоэза стромальных клеток у пациентов с острыми лейкозами. Было отмечено увеличение количества больших (p = 0,02) и малых (p = 0,01) колоний гранулоцитар-но-макрофагальных предшественников при использовании в качестве фидера стромальных клеток, выделенных у пациентов с острым лейкозом. Это, в свою очередь, может указывать на возможную роль стромального микроокружения в поддержке клеток опухолевого клона, описанную ранее [11].
Сравнение способности к «ортодоксальной» дифференцировке выявило повышение как осте-огенных (p = 0,03), так и адипогенных (p = 0,03) КОЕ-Ф (рис. 2; 3) при лейкозах.
Этоподтверждает данные группы Brentani [12], указывающей на изменения в экспрессии маркеров остеогенеза и на активность щелочной фосфа-тазы в стромальных клетках. Вместе с тем, нам не удалось найти описания изменений в способности к адипогенезу у пациентов с острыми лейкозами, что, по всей видимости, требует более детального изучения данного феномена.
Также были выявлены значимые различия в экспрессии генов, являющихся факторами адгезии гемопоэтических клеток в костном мозге. Нами было установлено, что у пациентов с острым лейкозом медиана уровняотносительной экспрессии генов SELECTIN и VECAM в стромальной популяции была выше по сравнению со таковой у здоровых доноров (p = 0,008 и p = 0,04 соответственно). Следует также отметить, что при исследовании экспресси-онного профиля генов PECAM и CXCR4 выявить
схожую закономерность на исследуемой выборке не удалось. Нами было выявлено снижение уровня относительной экспрессии гена CXCR4 у пациентов старшей возрастной группы (p = 0,05). Следует отметить, что изменение профиля экспрессии адгезионных факторов имеет важное значение в те-чениепострансплантационного периода и обуславливает как кинетику приживления гемопоэтичес-ких клеток донора, так и функционирование трансплантата [13].
ВЫВОДЫ
СККМ пациентов с острым лейкозом в сравнении с группой здоровых доноров характеризуются более высокой пролиферативной активностью и экспрессией молекул, опосредующих хоуминг ге-мопоэтических стволовых клеток, что можно объяснить реакцией стромы на предшествующие курсы химиотерапии и миелосупрессию. Клетки стро-мальной популяции костного мозга пациентов с острыми лейкозами характеризуются более выраженной способностью к остеогенной и адипоген-ной дифференцировке.
ЛИТЕРАТУРА
1. Gunsilius, E. Evidence from a leukaemia model for maintenance of vascular endothelium by bone-marrow-derived endothelial cells/ E. Gunsilius [et al. ]. // Lancet. — 2000. — Vol. 9216,№ 355. - P. 1688-91.
2. Flores-Figueroa, E. Mesenchymal stem cells in myelo-dysplastic syndromes: phenotypic and cytogenetic characterization / E. Flores-Figueroa [et al. ]// Leuk. Res. — 2005. — Vol. 29, № 2. — P. 215 — 24.
3. Blau, O. Chromosomal aberrations in bone marrow mesenchymal stroma cells from patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloblasticleukemia / O. Blau [et al. ] // Exp. Hematol. — 2007. — Vol. 35, № 2. — P. 221—9.
4. Scadden, D. T. The stem cell niche in health and leukemic disease / D. T. Scadden // Best Pract Res Clin Haematol. — 2007. — Vol. 20б № 1. — P. 19 — 27.
5. Konopleva, M. Therapeutic targeting of microenvironmental interactions in leukemia: mechanisms and approaches / M. Konopleva [et al. ] // Drug. Resist. Updat. — 2009. — Vol. 12, № 4 — 5. — P. 103—13.
6. Friedenstein, A. J. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo / A. J. Friedenstein [et al. ] // Transplantation. — 1974. — Vol. 17. №4. — P. 331—40.
7. Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues / D. J. Prockop // Science. — 1997 — Vol. 276, № 5309. — P. 71—4.
8. Le Blanc, K. Mesenchymal stromal cells: Tissue repair and immune modulation / K. Le Blanc [et al. ] //Cytotherapy. — 2006. — Vol. 8, № 6. — P. 559 — 61.
9. Le Blanc, K. Transplantation of mesenchymal stem cells to enhance engraftment of hematopoietic stem cells / K. Le Blanc [et al. ] // Leukemia. — 2007. — Vol. 21, № 8. — P. 1733 — 8.
10. Афанасьев, Б. В. Клонирование кроветворных клеток больных с различными формами гемопоэтических дисплазий в агаре (клинико-культуральныесопоставле-ния) / Б. В. Афанасьев [идр. ] //Терапевт. арх. — 1982. — № 8. —С. 97— 103.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
11. Podar, K. The malignant clone and the bone-marrow environment / K. Podar [et al. ] // Best Pract. Res. Clin. Haematol. — 2007. — Vol. 20, № 4. — P. 597 — 612
12. Borojevic, R. 1. Bone marrow stroma in childhood myelodysplastic syndrome: composition, ability to sustain hematopoiesis in vitro, and altered gene expression / R. 1, Borojevic [et al. ] //Leuk Res. — 2004. — Vol. 28, № 8. — P. 831—44.
13. Chamberlain, G. 1. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing / G. 1 Chamberlain, J. Fox, B. Ashton, J. Middleton //Stem. Cells. — 2007. — Vol. 25, № 11. — P. 2739 — 49.
РЕЗЮМЕ
И. М. Бархатов, Н. Ю. Цветков, А. И. Шаки-рова, Д. С. Романюк, О. Г. Смыкова, Л. С. Зуба-ровская, Б. В. Афанасьев
Функциональные характеристики стромальных клеток костного мозга у пациентов с острыми лейкозами
Патогенез острых лейкозов связан с наличием генетических и, как следствие, функциональных аберраций в ге-мопоэтических стволовых клетках. Вместе с тем, в качестве одного из факторов, способствующих прогрессии заболевания, могут рассматриваться также и клетки стромального-пулла костного мозга. В данной работе была проведена оценка основных функциональных характеристик стромальных клеток: пролиферативная активность, способность к поддержке гемопоэза и дифференцировке, а также анализ экспрессии факторов адгезии гемопоэтических стволовых кле-
ток. Стромальные клетки пациентов с острым лейкозом в сравнении с группой здоровых доноров характеризуются более высокой пролиферативной активностью и выраженной способностью к остеогенной и адипогенной дифферен-цировке с выраженной экспрессией молекул, опосредующих хоуминг гемопоэтических стволовых клеток.
Ключевые слова: стромальные клетки костного мозга, острые лейкозы, функциональные характеристики.
SUMMARY
I. M. Barhatov, N. Y. Tsvetkov, A. I. Shakirova, D. S. Romanyuk, O. G. Smykova, L. S. Zubarov-skaya, B. V. Afanasyev
Functional characteristics of bone marrow stromal cells in patients with acute leukemia.
Pathogenesis of acute leukemia is associated with the presence of genetic and functional aberrations in hematopoietic stem cells. However, as one of the possible factors contributing to the progression of disease could be regarded as the pull of the stromal cells of bone marrow. In this paper we evaluated the major functional characteristics of stromal cells: proliferative activity, hematopoiesis supportive and differentiation ability, as well as analysis of the expression of adhesion molecules. Stromal cells derived from acute leukemia patients in comparison with healthy donors are characterized by a high proliferative activity and a pronounced ability to osteogenic and adipogenic differentiation with prominent expression of hematopoietic stem cells homing mediating molecules.
Keywords: bone marrow stromal cells, acute leukemia, functional characteristics.
© Коллектив авторов, 2015 г. УДК 378.180.6:61(071.1):613.86
О. В. Тюсова, А. М. Шапоров, О. В. Павлова, Г. Г. Лебедева, Е. Р. Исаева
СОЦИАЛЬНО-ПСИХОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И ПРОФЕССИОНАЛЬНАЯ НАПРАВЛЕННОСТЬ СТУДЕНТОВ МЕДИЦИНСКОГО ВУЗА
Кафедра общей и клинической психологии, отдел содействия трудоустройству выпускников Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова
ВВЕДЕНИЕ
Изучение личностных ресурсови формирование профессиональных интересов студентов высшего учебного заведения (вуза) являются актуальными задачами в условиях современного учебного и воспитательного процесса [1, 2, 5, 6]. Разработка программ профессионального развитияна основе ин-
дивидуального психологического профиля студентов может помочьнынешнему поколению молодежи быстрееадаптироватьсяк обучению в вузе, осознать свои профессиональные цели и возможности, а преподавателям — облегчить решение задач обучения, воспитания и социализации студентов [3, 4]. Результаты проведенного исследования являются важным шагом в изучении профессиональной направленности и создании программы комплексного психолого-педагогического сопровождения студентов.
Целью проведенного исследования являлосьи-зучение социально-демографических характеристик, личностных свойств и особенностей саморегуляции студентов медицинского вузав связи с профессиональной направленностью. Для достижения этой цели были поставлены задачи:
1) провести анкетирование и психологическое тестирование студентов;
2) изучить особенности профессиональной направленности студентов;
3) выявить социально-психологические особенности студентов;
4) определитьзначимые различия личностных свойств и особенностей саморегуляции между юношами и девушками.
