Функциональное состояние тимуса и коррекция выявленных нарушений у больных ювенильным ревматоидным артритом на этапе санаторно­-курортной реабилитации Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

Оригинальные статьи

УДК 616.72-002.77:611.4:616.092:612.419:615.834-058.86(477.75)

Н.Н. Каладзе, Э.Я. Меметова,

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ТИМУСА И КОРРЕКЦИЯ ВЫЯВЛЕННЫХ НАРУШЕНИЙ У БОЛЬНЫХ ЮВЕНИЛЬНЫМ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ НА ЭТАПЕ САНАТОРНО-КУРОРТНОЙ РЕАБИЛИТАЦИИ

ГУ «Крымский государственный медицинский университет имени С.И. Георгиевского», г. Симферополь

РЕЗЮМЕ

В статье представлены результаты полученные при моделировании адьювантного артрита на 18 белых лабораторных чистопородных крысах линии В условиях данного эксперимента выявлены дистрофические изменения клеточных элементов тимуса. При проведении СКТ тимуса у 32 больных ЮРА, выявлена зависимость атрофических изменений от длительности заболевания и формы. Комплексное санаторно-курортное лечение с использование БРВС на область тимуса, способствовало устранению дистрофических изменений ткани тимуса в эксперименте, а также нормализации уровня а1-тимозина в крови у больных ЮРА.

Ключевые слова: адьювантный артрит, эксперимент, тимус, крысы, дети, ювенильный ревматоидный артрит, диагностика, лечение.

А. К. Загорулько

SUMMARY

In the article morphological changes the fabric of thymus are represented at the design of adjuvant arthritis on 18 white rats of line of «Wistar». In the conditions of this experiment has found dystrophy changes of cellular elements of thymus. During SCT of thymus at 32 patients with JRA, dependence of atrophic changes of the duration of disease and form. Complex sanatorium treatment with using of BRVS on the region of the thymus, is contributed to the normalization of a1-thymozine of blood in patients. Keywords: adjuvant arthritis, experiment, thymus, rats, children, juvenile rheumatoid arthritis, diagnostic, treatment.

Проблема ювенильного ревматоидного артрита (ЮРА) продолжает оставаться одной из наиболее актуальных в современной педиатрической ревматологии.

Ювенильный ревматоидный артрит (ЮРА) - системное аутоиммунное заболевание, неизвестной этиологии, возникающее у детей до 16 лет, с явлениями прогрессирующего эрозивно-деструктивного полиартрита и нередким вовлечением в процесс внутренних органов. Это одно из наиболее частых и самых инвалидизирующих ревматических заболеваний, которое встречается у детей [1,2,6]. Заболеваемость ЮРА составляет от 6 до 19 случаев на 100 000 детского населения в возрасте до 16 лет и от 0,9 до 2,1% всех госпитализированных больных [6].

Развитие научно-обоснованной концепции патогенеза ЮРА за последние годы достигло заметных успехов. Они связаны, главным образом, с выяснением ряда важных патогенетических звеньев аутоиммунного процесса, свойственного этому заболеванию. В то же время, несмотря на установление множества существенных патогенетических деталей, удовлетворительной общей концепции патогенеза ЮРА не существует, что делает исследования в данной области актуальными и перспективными.

В последние годы большое внимание уделяется выяснению роли тимуса в развитии аутоиммунных заболеваний. Тимус является органом, в котором наиболее ярко проявляются тесные клеточные взаимодействия между тремя регуляторными системами - нервной, иммунной и эндокринной, обеспечивающие необходимый молекулярный коммуникационный диалог, направленный на обеспечение физиологических процессов, как в самой железе,

так и в живом организме в целом [3,4,5]. Данный механизм реализуется путем дифференцировки, созревания Т- лимфоцитов, а также селекции ауто -агрессивных клеток, за счет выработки гормонов тимуса, в частности а1-тимозина, контролирующих эти процессы [6,7,8]. Если эти механизмы нарушаются, то может возникать аутоиммунная патология, характерная для ЮРА.

В настоящее время спиральная компьютерная томография (СКТ) является наиболее современным, а также одним из самых информативных методов лучевой диагностики большинства заболеваний, это широко используемый неинвазивный, безболезненный метод обследования, который показывает структурные изменения ткани органа [9,10,11].

В разрешении проблемы патогенеза, лечения и профилактики ЮРА, а также при поиске новых способов коррекции, большую роль должно сыграть создание адекватной модели на животных [12]. Широкое распространение в настоящее время получила научно-обоснованная экспериментальная модель артрита у крыс (подкожное введение полного адью-ванта Фрейнда), которая очень близка по клиническому течению и патологическим изменениям к ревматоидному артриту человека [13,14].

Доказано благоприятное действие физиотерапевтических методов лечения на суставы, в снижение активности воспалительного процесса, выраженности болевого синдрома, а также предупреждении прогрессирования процессов дегенерации. К данному виду терапии относится метод лечения - биорезонансная вибростимуляция (БРВС), проводимая аппаратом БРС-2М.

Таким образом, изучение уровня гормонов тимуса, а также его структурных изменений, актуально

не только для определения их роли в патогенезе иммунопатологических процессов при ЮРА, но и для совершенствования диагностики, прогнозирования течения и терапии данного заболевания.

Целью нашей работы явилось повышение эффективности санаторно-курортной реабилитации детей с ювенильным ревматоидным артритом на основании изучения функциональной активности тимуса, его роли в иммунно-гормональной регуляции и коррекции выявленных нарушений.

Материалы и методы

Экспериментальная часть

С целью изучения морфологических особенностей структуры тимуса проведено исследование на 18 белых лабораторных чистопородных крысах линии <^1§1аг». Животные были 3-х месячного возраста, со средней массой 80-120 гр. Крысы содержались в условиях вивария. Все эксперименты на животных проводились с соблюдением международных принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемые для экспериментальных и других научных целей (Страсбург,1985)[15]. Так, как наша экспериментальная модель сопоставима к детскому возрасту человека, то нами были взяты белые крысы породы <^1§1аг» в возрасте 14-18 дней (8-10 мес. жизни чел.), массой 16-20 гр. Способ моделирования выполняли следующим образом: под кожу задней лапки крыс (субплантарно), вводили полный адьювант Фрейнда 0,01 мл., который содержал 0,01мг БЦЖ, 2 р/нед., после 2х недель жизни, на протяжении 1 месяца. Моделировался аутоиммунный процесс, путем сенсибилизации организма животного в течение 28-30 дней [16].

Животные, у которых предполагалось исследовать ткань тимуса, были разделены на 3 группы, в каждой группе по 6 крыс (п=6): 1-я группа здоровые животные породы <^1§1аг» (КГ); 2-ю группу составили, животные этой же породы, с моделью адьювантного артрита, не получавшие лечения. в 3-ю группу вошли животные с адьювантным артритом, которым проводилось физиолечение БРВС (аппарат «БРС-2М»), на область проекции тимуса насадкой В (№№3), режим интенсивности I, продолжительность процедуры 3 минуты, курсом лечения 8-10 процедур, проводимые через день (3 раза в неделю).

Через 10 дней по окончанию эксперимента животных выводили под эфирным наркозом [17]. Забор материала проводился, в течение

15 минут, отпрепарированный тимус фиксировали в 2,5% растворе буферного глютаральдегида, для электронной микроскопии. Полутонкие срезы органов (1мкм) изготавливали на ультратоме УМПТ-7 (Украина). Ультратонкие срезы просматривали и фотографировали на электронных микроскопах ПЭМ-100 (Украина). Увеличение подбиралось адекватно целям исследования.

Клиническая часть

Нами обследовано 136 детей с диагнозом ЮРА в возрасте от 7 до

16 лет, находившихся на оздоровлении в ГУДССКС «Здравница» МОЗУ, г. Евпатории. Пациенты были разделены на группы в зависимости от возраста, пола, формы, степени активности и длительности заболевания. Среди обследованных детей, преобладали девочки - 70 (51,1%), мальчиков было 66 (48,18%). В зависимости от возраста преобладали дети 11-13 лет преимущественно девочки, 14-16 лет -мальчики. Средний возраст составил 12,3±0,22лет. На момент осмотра в соответствии с классификацией ЮРА СФ заболевания отмечалась у 120 (87,6%), СВФ 16 (11,68%). Чаще встречалась группа детей с 0-ой степенью активности ревмопроцесса - 44,53%, 1-я степень активности была у 40,15%, 2-я у 9,49% и ремиссия у 5,11% обследованных детей. Среди обследуемых, преобладали больные с длительностью заболевания с 3х до 7 лет (38,69%) детей, более 7 лет (32,12%), до 3х лет (28,47%). Средняя продолжительность заболевания составила 5,14±0,28 лет.

Всем детям проводились общеклинические и лабораторные исследования. Забор крови проводился утром натощак, образцы сыворотки хранились в замороженном состоянии при -20° С. Методом твердофазного ИФА определяли количественную концентрацию уровня гормона - а1-тимозина в сыворотке крови. Дети наблюдались в динамике, уровень гормона исследовался до и после лечения. Группой контроля явились 36 практически здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту. Все дети получали стандартный комплекс санаторно-курортного лечения. 32 пациентам с ЮРА была проведена компьютерная томография тимуса. 30 детей получали физиолечение БРВС (аппарат «БРС-2М»), на этапе СКЛ, на область проекции тимуса насадкой В (№№3), режим интенсивности I, продолжительность процедуры 3 минуты, курсом лечения 8-10 процедур, проводимые через день (3 раза в неделю). Обработку данных проводили с помощью статистического пакета анализа данных программы «81аЙ81ка V 6».

Результаты и их обсуждение

Экспериментальная часть

У всех экспериментальных животных в месте иньекции появилось изъязвление и гиперемия кожных покровов. К 6-7 неделе заболевания разви-

вался полиартрит, с преимущественной локализацией в коленных, тазобедренных и плечевых суставах, отмечалась болезненность суставов при пальпации, ограничение движения в них; снижение мышечного тонуса и дряблость мышц; снижение аппетита и потеря веса.

В исследуемой первой КГ здоровых экспериментальных животных ткань тимуса была не измененная, имела физиологическое строение. Основу дольки тимуса составляла рыхлая, губкопо-добная сеть из звездчатых эпителиоцитов (тимо-цитов), петли которой были инфильтрированы лимфоцитами.

Изменения в клетках тимуса животных 2-ой группы, при моделированном адьювантном артрите, носили определенные изменения, не имеющие характерной локализации и стереотипные как в корковом, так и в мозговом веществе.

Прежде всего, обращало на себя внимание раз-рыхленность соединительнотканного каркаса тимуса, что могло быть расценено, как проявления экстрацеллюлярного отека и сопровождалось снижением плотности лимфоцитарного инфильтрата в петлях звездчатых эпителиоцитов. В самих эпите-лиоцитах имели место как явления, свидетельствующие о гидропической дистрофии, так и изменения, трактуемые как признаки апоптоза.. Причем число клеток с такими изменениями по сравнению со здоровыми животными значительно возрастало. (Рис.1).

Рис.1.

Электронная микрофотография (увеличение 3200).

Разрыхленность соединительнотканного каркаса тимуса (Ст) со снижением плотности лимфо-цитарного(Лф) инфильтрата. Явления цитопик-ноза (стрелки). Лф-лимфоциты.

Вместе с тем, во многих эпителиоцитах отмечалось разрыхление цитозоля с уменьшением оптической плотности цитоплазмы, снижение плотности матрикса митохондрий с просветлением орга-нелл и нарушением упорядоченного расположения в них крист, расширение профилей канальцев ци-топлазматической сети, а также снижением уровня содержания хроматина в ядрах. Описанные ультраструктурные изменения расценивались нами, как проявления гидропической дистрофии, имеющей, однако, обратимый характер. Такие же изменения наблюдались и в лимфоцитах тимуса (Рис.2).

Рис.2.

Электронная микрофотография (увеличение 4800).

Ультраструктурные изменения обратимой гид-ропической дистрофии в звездчатых эпителиоци-тах (Эп) и лимфоцитах (Лф) тимуса.

Так, в частности, в ядрах клеток отмечалось резкое снижение содержания хроматина, что приводило к просветлению центральной части ядер и конденсации небольших количеств гетерохрома-тина вблизи ядерной мембраны (Рис.3).

Рис.3.

Электронная микрофотография (увеличение 9000).

Снижение содержания хроматина в ядрах (Я) лимфоцитов (Лф) с просветлением центральной части и конденсацией глыбок гетерохроматина (стрелки) вблизи ядерной мембраны.

Изменения отечного характера, описанные в отношении внутриклеточных органелл звездчатых эпителиоцитов, имели место и в лимфоцитах (Рис.4).

Рис.4.

Электронная микрофотография (увеличение 4800).

Появление гидропической дистрофии в лимфоцитах (Лф) тимуса при адьювантном артрите. Я-ядро. М-митохондрии. Р-рибосомы.

Эффективными по данным электронной микроскопии оказалось применение в 3-ей группе животных физиотерапевтического метода лечения -БРВС на область проекции тимуса. Прежде всего, в этой группе обращало на себя внимание нормализация общего строения долек железы с уменьшением межклеточных промежутков и восстановлением плотности лимфоцитарного инфильтрата (Рис.5) за счет исчезновения экстрацеллюлярного отека рыхловолокнистой соединительной ткани.

Рис.5.

Электронная микрофотография (увеличение 3200).

Нормализация плотности лимфоцитарного инфильтрата (Лф) за счет снижения экстрацеллюлярного отека рыхловолокнистой соединительной ткани тимуса. Эп-звездчатый эпителиоцит.

Ультраструктурная организация звездчатых эпи-телиоцитов приближалась к нормальной. В клетках нормализовывалось строение ядер. Межклеточные контакты вновь становились плотными, из-за чего сетчатое строение долек тимуса восстанавливалось.

В большинстве же звездчатых эпителиоцитов восстанавливалась умеренная плотность цитозоля, митохондрии и другие органеллы имели характерное для них строение, а в ядрах количество хроматина достигало нормального уровня (Рис.6).

Рис.6.

Электронная микрофотография (увеличение 3200).

Нормализация ультраструктурной организации эпителиальных клеток (Эп) и лимфоцитов (Лф). Я-ядро. М-митохондрии.

Наиболее важным признаком, демонстрирующим эффективность применяемого лечения, являлось значительное усиление митотической активности лимфоцитов, о чем свидетельствовали многочисленные фигуры митозов в этих клетках (Рис.7).

Рис.7.

Электронная микрофотография (увеличение 4800).

Митоз (стрелки) в лимфоцитах (Лф) тимуса.

Кроме того, позитивные изменения фиксировались и со стороны сосудов тимуса. Так, большинство сосудов содержали в своем просвете эритроциты, их эндотелий выглядел нормальным, а в околососудистой зоне часто обнаруживались активно функционирующие фибробласты, синтезирующие вновь формирующуюся соединительную ткань (Рис.8).

Рис.8.

Электронная микрофотография (увеличение 3200).

и СВФ на СКТ визуализировался тимус правильной формы, с ровными контурами и однородной структурой, с несколько уменьшенными размерами, плотностью 50 Ед.Н, при норме 35-40, что свидетельствовало об инволютивных изменениях ткани органа при более тяжелом течении заболевания и увеличении длительности патологического процесса.

Рис.4.1.

Компьютерная томография тимуса. Стрелками указан тимус.

Ультраструктурные признаки повышения функциональной активности эндотелия сосудов тимуса. Пс-просвет сосуда. ПВ - пиноцитозные везикулы. Я-ядро. Выпячивание эндотелия в просвет сосуда (стрелка).

Более того, со стороны ряда сосудов отмечались признаки повышения функциональной активности эндотелия, что, по-видимому, сопровождалось усилением транскапиллярного газообмена.

Полученные результаты морфологического исследования свидетельствовали о том, что в ходе эксперимента удалось смоделировать хроническое системное воспаление характерное для ревматоидного артрита, а также выявить изменения в ткани тимуса у экспериментальных животных.

Клиническая часть

Для оценки размеров и структурного состояния тимуса, 32 пациентам с ЮРА, в возрасте от 7 до 16 лет, была проведена СКТ грудной клетки с в/в контрастированием (ультравист). У 6 (18,75%) пациентов с длительностью заболевания более 3-х лет

Таким образом, у больных ЮРА размеры тимуса и его структура не претерпевали существенных изменений и только у 18% больных с СВФ и длительностью заболевания более 3 лет, отмечалось уменьшение размеров тимуса и достоверное увеличение плотности его ткани.

Нами был определен уровень основного гормона тимуса а1-тимозина у 40 пациентов с ЮРА в возрасте 7-16 лет и 20 здоровых сверстников КГ.

При исследовании гормонального статуса тимуса, во всей группе больных ЮРА нами было выявлено достоверное повышение уровня а1-тимозина после проведенного лечения с включением БРВС в стандартный комплекс СКЛ, но данные показатели не достигали уровня а1-тимозина, выявленного в КГ детей.

До лечения у больных ЮРА отмечалось достоверное снижение уровня а1-тимозина, по сравнению с КГ, который составил 86,13±8,99 нг/мл (КГ -234,45±43,81 нг/мл, (р<0,05)). После лечения у всех детей было выявлено достоверное повышение уровня а1-тимозина до172,63±18,13нг/мл (р<0,05), но данные показатели не достигали уровня а1-тимозина, выявленного в КГ.

Нами не было выявлено гендерного различия в уровнях а1-тимозина у больных ЮРА до лечения, составившего у мальчиков - 84,19±9,73 нг/мл, у девочек - 89,11±17,75 нг/мл, которые были достоверно (р<0,05) ниже показателей здоровых сверстников (рис.4.2). Более эффективным применение БРВС оказалось у мальчиков, уровень а1-тимозина составил 192,22±23,50 нг/мл, у девочек -144,64±27,76 нг/мл, данные показатели были достоверно различимы между собой и с данными КГ.

Также до лечения нами не было выявлено достоверного различия данного показателя у детей с СФ и СВФ ЮРА. В группе детей с СФ заболевания уровень а1-тимозина составил 82,97±9,31 нг/мл, с СВФ - 117,70±33,03 нг/мл, оставаясь при этом достоверно (р<0,05) ниже, чем в КГ. После прове-

денного лечения, отмечено повышение уровня а1-тимозина до 171,86±19,75 нг/мл в группе детей с суставной формой (СФ), и до 180,60±31,18 нг/мл -

В зависимости от активности воспалительного процесса отмечалась аналогичная тенденция к снижению исследуемого показателя. Так в фазе ремиссии ЮРА он составил 86,30±25,59 нг/мл, при 0-й степени - 74,16±11,37 нг/мл, при 1-й -102,92±17,55 нг/мл, при 2-й - 74,80±32,80, однако данные изменения не носили достоверного различия при сравнении друг с другом (р>0,05), оставаясь при этом достоверно ниже, чем у детей КГ (рис.4.3). В зависимости от активности воспалительного процесса, показатели были одинаково снижены, а после СКЛ с включением БРВС, отмечалось статистически значимое увеличение концентрации а1-тимозина до 232,02±60,53 нг/мл в период ремиссии, до 129,41±23,53 нг/мл при 0-ой степени активности, до 199,34±30,68 при 1-ой, до

с суставно-висцеральной формой (СВФ) (р<0,05), что заметно отличалось от показателей детей до лечения и было ниже данных КГ.

Рисунок 4.2.

239,30±55,90 нг/мл при 2-ой, и эти показатели были достоверно выше (р<0,05 ), чем до лечения, но ниже показателей КГ.

По мере увеличения длительности заболевания также отмечалось достоверное снижение уровня а1-тимозина. В группе больных с длительностью заболевания до 3 лет средний уровень исследуемого показателя составил 94,11±19,86 нг/мл, при длительности заболевания 3-7 лет - 83,80±14,32 нг /мл, более 7 лет - 80,51±10,16 нг/мл, что достоверно (р<0,05) отличалось от показателей КГ. После лечения БРВС на санаторно-курортном этапе реабилитации, у детей до 3х лет заболевания уровень гормона составил 214,85±39,39 нг/мл, с 3-7лет -172,07±28,22 нг/мл, свыше 7 лет - 126,65 ±18,66 нг/мл (р<0,05).

Рисунок 4.3.

Уровень а1-тимозина у больных ЮРА, в зависимости от пола и формы заболевания.

/VI

250 200 150 100 50 0

девочки

Примечание: достоверность отличий *р<0,05 ,по сравнению с данными КГ

ЮРА

Уровень а1-тимозина у больных ЮРА, в зависимости от степени активности и длительности заболевания.

Таким образом, у больных ЮРА, находящихся на санаторно-курортном этапе реабилитации с включением физиотерапии БРВС, отмечалось достоверное повышение уровня а1-тимозина, что возможно благоприятно отразилось на иммунно-гормональном состоянии организма при данной патологии.

Выводы

1. Экспериментальные данные, полученные на модели адъвантного артрита, свидетельствуют о нарушении морфологической структуры тимуса, проявляющейся обратимыми изменениями по типу гидропической дистрофии с одной стороны, и усилению процессов апоптоза - с другой, являющимися следствием аутоиммунной перестройки. Дистрофические изменения наиболее успешно корригировались БРВС.

Лите

1. Коваленко В.Н. Ревматоидный артрит: этиопатогенез, клиника, диагностика, лечение // Лжи Украши. -2005.-№1.- С.24-26.

2. Клинические рекомендации. Ревматология / Под ред. Е.Л.Насонова.- М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005.- 288с.

3. О чувствительности лимфоцитов к гормонам тимуса у детей с патологией ЦНС различного генеза /А.И. Аутеншлюс, О.В.Иванова,В.Г.Дягтерева, А.А.Косачева // Иммунол. и клин.иммунол. - 2002. - №3.- С.181-185.

4. Кемилева З. Вилочковая железа: Пер. с болг. - М.: Медици-на,1984, 256с.

5. Белецкая Д.В., Гнездицкая Э.В. и др. «Структурно-функциональная организация тимуса» / Успехи современной биологии. - 1986. - т.102. - вып.1(4).

6. Ревматоидный артрит у детей /Под ред. Е.М. Лукъяновой, Л.И.Омельченко.- К.: «Книга плюс», -2002.-176с.

7. Анисимова В.П. ,,Роль морфофункциональных перестроек тимуса в обменно-эндокринных нарушениях организма,, / Рос. вестник перинатологии и педиатрии. - 1994. - Т.39, №1. - C.35.

8. Клинические рекомендации.Педиатрия / под ред. А.А.Баранова. - М.:ГЭОТАР- Медиа, 2006г.- С.211-212.

9. Стрэнг Д.Г., Догра В. Секреты компьютерной томографии. Грудная клетка, живот, таз /Пер.с англ. - М.; СПб.: «Издательство БИНОМ»-«Издательство Диалект», М. - 2009. - 448с., ил.

© КАЛАДЗЕ Н.Н., ЗАГОРУЛЬКО А.К., МЕМЕТОВА Э.Я., 2014

2. У больных ЮРА, с длительностью заболевания более 3х лет, выявлена инволюция вилочковой железы.

3. Снижение уровня а1-тимозина было выявлено у всех больных с ЮРА в большей степени при сус-тавно-висцеральной форме и длительности заболевания более 7 лет.

4. Проведенное санаторно-курортное лечение оказывало нормализующий эффект на динамику исследуемых показателей и было более выраженным в случае дополнения стандартного комплекса СКЛ сеансами БРВС

Таким образом, у больных ЮРА, находящихся на санаторно-курортном этапе реабилитации с длительностью заболевания более 3х лет, выявлена инволюция вилочковой железы, снижение уровня а1-тимозина и всех субпопуляций лимфоцитов, следствием чего являются стойкие изменения клеточного иммунитета при данной патологии.

тура

10. Низовцова Л.А., Власова И.С., Буланова Т.В., Киселева Е.С. Компьютерная томография: подготовка к исследованию и основные укладки. Методические рекомендации. М.-2002.-17с.

11. Крадинов А.И., Шалабасов Б.А., Прокопенко О.П., Гусаров В.Г. Современные средства и способы лучевой диагностики. Учебно-методическое пособие для студентов и врачей. Симферополь, -1995.- 52с.

12. Ундрицов М.Н., Розен В.Б., Чернин. Л. С. Вопросы ревматологии, 1964, №1, с.7.

13. Кейтель В., Лопатенок А. Вопросы ревматологии, 1970, №3, с.24.

14. Руководство по иммунофармакологии. Перевод с англ./ Под ред. М.М.Дейла, Дж.К.Формена.-М.:. «Медицина»,1998. С.83-86,233,288.

15. Науково-практичш рекомендащ! з утримання лабораторних тварин та роботи з ними / Ю.М.Кожемяюн, О.С.Хромов, М.А. Филоненко, Г.А. Сайфетдшова.-Ктв. «Авщена», 2002.-156с.

16. Науково-практичш рекомендащ! з утримання лабораторних тварин та роботи з ними / Ю.М. Кожемяюн, О.С.Хромов, М.А. Фшоненко, Г.А. Сайфетдщова.- К.: «Авщена», 2002.-156с.

17. Эвтаназия животных. Методические рекомендации по выведению животных из эксперимента. - М.,1985.-18с.

Поступила 10.11.2013