CC BY
27
УДК 616.155.34:616.717/.718-018.46-002.2
ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ СТАТУС НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ФАГОЦИТОВ У ПАЦИЕНТОВ С ОСТЕОМИЕЛИТОМ ДЛИННЫХ ТРУБЧАТЫХ КОСТЕЙ
Елена Ивановна КУЗНЕЦОВА, Марина Владимировна ЧЕПЕЛЕВА, Николай Михайлович КЛЮШИН, Сергей Иванович БУРНАШОВ
ФГБУ «Российский научный центр» «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6
Проведена оценка состояния фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови у 50 больных с хроническим посттравматическим остеомиелитом длинных трубчатых костей. При хроническом остеомиелите, независимо от активности воспалительного процесса, отмечено усиление функционально-метаболической активности нейтрофилов, что связано с общей направленностью действий иммунных клеток - попыткой инактивации и элиминации патогена путем фагоцитоза. В период обострения хронического остеомиелита дополнительно включается альтернативный путь борьбы с инфекционными патогенами - образование нейтрофильных ловушек.
Ключевые слова: остеомиелит, фагоцитарная активность нейтрофилов, нейтрофильные ловушки.
ВВЕДЕНИЕ
Проблема лечения больных с гнойными осложнениями травм костей, в том числе хронического остеомиелита, несмотря на современные достижения медицины, остается актуальной до настоящего времени [1]. Остеомиелит - инфекционный процесс, протекающий со значительной перестройкой иммунной системы, при которой особенности взаимоотношений между микро- и макроорганизмом в силу экзогенных и эндогенных факторов складываются зачастую неблагоприятно для последнего [3]. Развитие гнойно-воспалительных осложнений травмы во многом определяется функциональным состоянием иммунной системы, в частности, уровнем фагоцитарной активности нейтрофилов крови. Нейтрофилы, благодаря наличию рецепторов к значительному числу эндогенных медиаторов, реагируют на малейшие изменения постоянства внутренней среды. Нейтрофилы традиционно относятся к иммунным клеткам «быстрого реагирования» [4]. Учитывая важную роль ней-
трофилоцитов в противоинфекционной защите, безусловно, возникает вопрос о необходимости исследования данного звена иммунитета у больных с последствиями травм, осложненных остеомиелитом.
Цель настоящей работы - оценка состояния фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови (ФАН) у больных с посттравматическим остеомиелитом (ОМ) длинных трубчатых костей.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В дооперационном периоде обследовано 50 пациентов, находившихся на хирургическом лечении в клинике РНЦ «ВТО» им акад. Г.А. Илизарова в период с 2009 по 2013 г. Из них 30 больных (I группа) - со свищевой формой хронического посттравматического остеомиелита бедра (п = 12), голени (п = 13), плеча (п = 5); 20 пациентов (II группа) - с хроническим посттравматическим остеомиелитом бедра (п = 10), голени (п = 10) в период стойкой ремиссии (не
Кузнецова Е.И. - младший научный сотрудник научно-клинической лаборатории микробиологии и иммунологии, e-mail: [email protected]
Чепелева М.В. - к.м.н., старший научный сотрудник научно-клинической лаборатории микробиологии и иммунологии, e-mail: [email protected]
Клюшин Н.М. - д.м.н., зав. лабораторией гнойной остеологии, e-mail: [email protected] Бурнашов С.И. - врач-травматолог-ортопед, зав. отделением гнойной ортопедии № 2, e-mail: [email protected]
менее двух лет). Возраст обследованных больных находился в пределах от 35 до 55 лет, длительность заболевания варьировала от 5 до 15 лет. В качестве контрольных использовались иммунологические показатели 21 добровольца аналогичного возраста. Все лица, участвовавшие в исследовании, дали информированное согласие на публикацию данных, полученных в результате исследования, без идентификации личности. Забор крови осуществлялся из локтевой вены натощак.
Применялась стандартная методика изучения фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) [5], основанная на количественном определении поглотительной и переваривающей способности нейтрофилов по отношению к микробной тест-культуре (Staphylococcus epidermidis штамм № 9198 «НИИЭМ» СЗО РАМН). Рассчитывались следующие показатели ФАН:
1. Фагоцитарный показатель (ФП, %) - процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе от общего их количества (из 100 подсчитанных клеток).
2. Фагоцитарное число (ФЧ, у. е.) - среднее число микробов, поглощенных одним нейтрофи-лом (частное от деления общего числа поглощенных бактерий (Чп) на число клеток, вступивших в фагоцитоз (ФП)). Характеризует поглотительную способность нейтрофилов.
3. Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - отношение количества переваренных микробов (Чу) к общему числу поглощенных микробов (Чп), выраженное в процентах (используется для оценки переваривающей функции фагоцитов):
ПЗФ = — х 100 %.
Чп
4. Количество активных фагоцитов (КАФ, 109/л) - абсолютное число фагоцитирующих нейтрофилов. КАФ вычисляют исходя из абсолютного содержания лейкоцитов, процента ней-трофилов (Нф) в общем мазке крови и процента фагоцитоза (ФП)):
ФП
КАФ =— х Нф (109/л).
5. Абсолютный фагоцитарный показатель
(АФП, 109/л) (фагоцитарная емкость крови) - количество микробов, которое могут поглотить фагоциты 1 литра крови:
АФП = ФЧ 30 х Нф (109/л).
Для морфологического исследования использовали мазки крови, окраску препаратов осуществляли по Романовскому - Гимзе.
Метаболическую активность нейтрофилов оценивали в реакции восстановления нитроси-
него тетразолия (НСТ-тест) методом световой микроскопии по методу Park [5] в двух вариантах: спонтанном и стимулированном. В качестве стимулятора использовали микробную тест-культуру Staphylococcus epidermidis штамм № 9198 «НИИЭМ» СЗО РАМН. Лизосомальную активность нейтрофилов определяли, используя цитохимическое исследование клеток. Активность миелопероксидазы (МП) определялась по Грехему-Кнолю. Уровень лизосомальных кати-онных белков (КБ) цитоплазмы устанавливали в реакции с бромфеноловым синим по М.Г. Шуби-чу. Уровень МП и КБ выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК) [5].
Для подсчета нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ, %) использовали мазки крови, окрашенные по Романовскому - Гимзе. Определение количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, содержащихся в цельной крови, проводили следующим образом. На сухое обезжиренное предметное стекло наносили каплю цельной гепаринизированной венозной крови, затем с помощью чистого шлифовального стекла распределяли кровь по поверхности предметного стекла. Мазки высушивали на воздухе, фиксировали 96%-м этиловым спиртом и окрашивали по Романовскому- Гимзе. Результаты оценивали при помощи световой микроскопии, в мазках подсчитывали процентное содержание внеклеточных ловушек от общего числа зрелых нейтрофильных гранулоцитов, исходя из 100 подсчитанных нейтрофилов [7].
Количественное определение IL-8 осуществлялось методом ИФА на иммуноферментном анализаторе BIO-TEK Instruments Inc, ELx808 (США) (рег. ФС № 2006/2919 от. 26.12.2006) с использованием набора реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). На проведение клинических исследований получено разрешение комитета по этике ФГБУ «РНЦ» «ВТО им. акад. ГА. Илизаро-ва» Минздрава России.
Полученные данные обрабатывались с помощью методов непараметрической статистики с использованием U-критерия Вилкоксона и были представлены в виде медиан и интерквартельных размахов. Факторный анализ проводили с помощью программного обеспечения AtteStat. Нормальность выборок определяли с помощью критерия Шапиро- Уилка. Для построения исходной корреляционной матрицы использовали коэффициент Пирсона.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ полученных данных показал следующее: у пациентов со свищевой формой остеоми-
Таблица 1
Показатели неспецифической резистентности у больных с остеомиелитом
Показатель I группа II группа Контрольная группа
НВЛ, % 5,0++* 2,0 0,75
4,0-7,0 1,0-2,1 0-1,5
ФП, % 93,0+ 89,0+ 71,5
88,5-94,0 84,5-91,5 68,5-78,0
ФЧ, у.е. 9,0+ 8,0 7,3
7,5-10,3 7,0-9,0 6,8-8,0
КАФ, 109/л 3,8+ 2,7 2,3
2,9-4,7 2,1-4,6 1,8-2,8
АФП, 109/л 45,0+ * 24,2 24,0
32,8-48,0 21,3-42,5 20,0-29,5
ПЗФ, % 88,0+ 86,0+ 73,2
85,0-90,5 85,0-88,0 69,8-84,3
НСТ-тест (спонт.), % 7,5 7,0 5,5
5,5-11,0 4,3-15,3 4,3-6,0
НСТ-тест (стим.), % 78,0+ * 71,0+ 57,0
70,0-86,0 57,0-79,5 48,0-62,3
НСТ-тест, ИС 10,5 9,8 11,5
7,2-13,3 5,3-12,5 10,1-12,0
КБ (СЦК) 2,3+ 2,3+ 2,0
2,1-2,4 2,2-2,4 1,9-2,2
МП (СЦК) 2,2 2,1 2,0
1,8-2,5 1,9-2,3 1,9-2,3
IL-8, пг/мл 20,6+ * 11,5+ 3,02
11,8-40,0 5,7-33,6 0,53-9,68
Примечание. + -р < 0,05; ++ -р < 0,01 - относительно показателей контрольной группы; * -р < 0,05 - относительно показателей I группы.
елита количество нейтрофильных внеклеточных ловушек было достоверно выше, чем в контрольной группе и в группе пациентов с остеомиелитом в период ремиссии (табл. 1). Значения данного показателя в контроле и у больных II группы статистически значимых отличий не имели.
ФП, ПЗФ, КБ у пациентов с остеомиелитом в обеих группах превышали контрольные значения. Более высокими, чем в контроле, были ФЧ, КАФ, АФП, показатели НСТ-теста у пациентов со свищевой формой остеомиелита. Стимулированный НСТ-тест у пациентов I группы, как и во II группе, превышал значения контроля. При этом у пациентов I группы данный показатель был достоверно выше, чем во II группе. Повышенные концентрации ^-8 отмечались у пациентов в обеих исследованных группах, но наиболее высокие значения показателя были выявлены в группе со свищевой формой остеомиелита.
Итогом анализа стали матрицы факторных нагрузок (табл. 2, 3).
Все показатели группировались в ряд факторов, расположенных в порядке уменьшения их
вкладов в общую дисперсию. На основании вари-максного нормализованного вращения во II группе были выделены 4 фактора, имеющие наибольшую значимость и определяющие вариации исследуемых показателей на 76,0 %. В I группе больных иммунологические показатели группировались в 9 основных факторов, 5 из которых имели значимые для рассмотрения результаты и определяли вариации неспецифического звена иммунной системы на 86 %.
ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно мнению А.Г. Овдеенко с соавт. (2010), нейтрофилы теряют свои эффекторные функции в острой фазе огнестрельного остеомиелита и не восстанавливают их в хронической фазе. В основе этих нарушений лежит снижение энергетического обеспечения нейтрофилов [6]. О снижении показателей НСТ - теста и других показателей ФАН у пациентов с хроническим остеомиелитом свидетельствуют исследования О.В. Бердюгиной (2009) [2].
Примечание. Здесь и в табл. 3 в пустых графах коэффициенты корреляции менее 0,4.
Таблица 3
Матрица факторных нагрузок показателей неспецифической резистентности у больных
со свищевой формой остеомиелита
Таблица 2
Матрица факторных нагрузок показателей неспецифической резистентности у больных
с остеомиелитом в период ремиссии
Показатель Фактор I Фактор II Фактор III Фактор IV
ФЧ, у.е. 0,4
КАФ, 109/л 0,95
АФП, 109/л 0,91
ПЗФ, % 0,41
НСТ-тест (спонт.), % -0,91
НСТ-тест, ИС 0,97
МП (СЦК) 0,8
ГЬ-8, пг/мл 0,94
% 27,1 24,3 13 11,5
Показатель Фактор I Фактор II Фактор III Фактор IV Фактор V
НВЛ, % 0,54 0,45 0,72
ФП, % 0,77
ФЧ, у.е. 0,83
КАФ, 109/л 0,95
АФП, 109/л 0,93
ПЗФ, % 0,81
НСТ-тест (спонт.), % 0,93
МП (СЦК) 0,96
% 30,8 22,0 14,3 12,30 6,7
Сведения о фагоцитарной активности нейтро-филов у пациентов с хроническим остеомиелитом длинных трубчатых костей в период ремиссии малочисленны. Согласно полученным нами данным, состояние неспецифического звена иммунитета у этой категории пациентов характеризовалось более высокими, чем в контроле, значениями ФП, ПЗФ, НСТ-стим, КБ, ^-8, что в целом свидетельствовало о напряженности иммунного ответа, увеличении количества активных фагоцитов, активации как кислородзависимых (НСТ-тест), так и кислороднезависимых (КБ) механизмов киллинга нейтрофилов. Для пациентов со свищевой формой хронического остеомиелита было характерно повышение КАФ и АФП, обусловленное сопутствующим лейкоцитозом. Значения НСТ-стимулированного, позволяющего оценить функциональный резерв кислородзави-симого механизма бактерицидности фагоцитов, были достаточно высокими. В группе больных со свищевой формой остеомиелита было выявлено достоверное повышение количества нейтрофиль-
ных ловушек. Новая функция нейтрофильных гранулоцитов - внеклеточный захват патогенов путем формирования ими внеклеточных ловушек, представляющих собой нити ДНК с адсорбированными на них антимикробными факторами гранул нейтрофилов, была открыта сравнительно недавно - в 2004 г. Процесс формирования нейтрофилами внеклеточных ловушек является функцией, альтернативной фагоцитозу, а возможно, и более эффективной, так как количество микроорганизмов, поглощенных нейтрофилом при фагоцитозе значительно уступает числу бактерий, задерживаемых в ловушках [10]. Процесс образования нейтрофильных внеклеточных ловушек могут вызывать различные стимулы, включая ^-8, уровень которого достоверно выше, чем в контроле и в группе больных с остеомиелитом в период ремиссии.
Одним из наиболее эффективных способов изучения сложноорганизованных систем, включая систему иммунитета, является использование факторного анализа [9]. В отношении иммунной
системы главные компоненты (факторы) представляют собой совокупность патогенетических влияний, оказывающих наиболее сильное воздействие на элементы системы иммунитета. Патогенетические процессы проявляются на системном уровне как клинические состояния, поэтому одним из вариантов качественных оценок факторов могут служить связи факторов с клинико-нозо-логическими характеристиками пациентов [8]. С позиций факторного анализа мы попытались рассмотреть хронический посттравматический остеомиелит в период ремиссии и свищевой формы.
Фактор I, определяющий 27,1 % всех возможных состояний неспецифической резистентности у пациентов с остеомиелитом в период ремиссии, включал КАФ (активация нейтрофилов) и АФП (поглотительная функция нейтрофилов), т.е. был связан с эффекторными функциями фагоцитирующих клеток. Фактор II (24,3 % от суммы всех дисперсий) был связан с показателями, характеризующими функционально-метаболическую активность нейтрофилов и демонстрировал отрицательную корреляционную связь между HCT-тестом и ИС - HCT, свидетельствующую о сохранении компенсаторных механизмов кисло-родзависимого киллинга нейтрофилов у пациентов с остеомиелитом в период ремиссии. Фактор III оказывал влияние на МП и ПЗФ, которые находились в линейной корреляции. ПЗФ характеризует переваривающую способность нейтрофи-лов, которая осуществляется при помощи МП, являющейся ключевым ферментом при образовании ряда активных форм кислорода, необходимого для осуществления кислородзависимого кил-линга нейтрофилов. Фактор IV показал прямую линейную зависимость между ФЧ и IL-8. Как известно, IL-8 помимо основного биологического действия, как хемоаттрактанта, способен усиливать адгезивные свойства нейтрофилов, участвуя, таким образом, в процессах поглощения микробных клеток.
У пациентов со свищевой формой остеомиелита фактор I (30,8 % от общей дисперсиии) коррелировал с количеством нейтрофильных ловушек и спонтанным НСТ-тестом. Для логического пути формирования HBJI необходимы активные формы кислорода, которые запускают потерю сегментации ядер нейтрофилов, сопровождающуюся однородным распределением хроматина [11]. Фактор II (общий вклад в общую дисперсию 22 %) объединял КАФ и АФП, фактор III (14,3 % от общей дисперсии) влиял на ФП и ПЗФ. Оба фактора были связаны с эфекторными функциями фагоцитирующих клеток. Фактор IV, охватывающий 12,3 % вклада в общую дисперсию,
влиял на количество нейтрофильных ловушек и МП. МП-фермент, хранящийся в азурофильных гранулах нейтрофила, а также в составе декон-денсированного хроматина нейтрофильных ловушек [12]. Фактор V (6,68 % от общей дисперсии) демонстрировал прямую линейную зависимость между нейтрофильными ловушками и ФЧ, в связи с тем, что микробная стимуляция дает толчок к образованию нейтрофильных ловушек.
Проведение факторного анализа позволило выявить иммунологические особенности, связанные с клиническими аспектами хронического остеомиелита длинных трубчатых костей. В частности, у пациентов с остеомиелитом в стадии обострения через нейтрофильные ловушки оказались связаны I, IV и V факторы (вклад в общую дисперсию 49,75 %), что подтвердило их патогенетическую значимость в элиминации патогенных микроорганизмов при данной патологии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При хроническом посттравматическом остеомиелите длинных трубчатых костей, независимо от наличия свища или стойкой ремиссии гнойного процесса, наблюдается усиление функционально-метаболической активности нейтрофилов, что связано с общей направленностью действий иммунных клеток - попыткой инактивации и элиминации патогена путем фагоцитоза. При свищевой форме хронического остеомиелита дополнительно включается альтернативный путь борьбы с инфекционными агентами - образование нейтро-фильных ловушек.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Амирасланов Ю.А. Современные принципы хирургического лечения хронического остеомиелита // Инфекции в хирургии. 2004. 2. (1). 8-13.
2. Бердюгина О.В. Иммунологическое прогнозирование в травматологии и ортопедии. Екатеринбург, 2009. 252 с.
3. Никитин Г.Д., Рак А.В., Линник С.А. и др. Хирургическое лечение остеомиелита. СПб., 2000. 288 с.
4. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о ней-трофиле и макрофаге. Новосибирск, 1989. 344 с.
5. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. М., 1987. 365 с.
6. Овденко А.Г. Огнестрельные ранения и огнестрельный остеомиелит конечностей. СПб., 2010. 240 с.
7. Савочкина А.Ю. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: механизмы образования, методы обнаружения, биологическая роль: дис. ... д-ра мед. наук. Челябинск, 2012.
8. Сарап П.В., Винник Ю.С., Останин А.А. Клинические аспекты патогенетических влияний, определяющих состояние иммунной системы у пациентов с ургентной хирургической патологией // Бюл. сиб. медицины. 2011. (1). 162-167.
9. Чепелева М.В. Факторный анализ в оценке состояния клеточного иммунитета у пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями длинных трубчатых костей и крупных суставов // Клин. лаб. диагностика. 2013. (11). 41-45.
10. Brinkmann V., Laube Br., Abed U. et al. Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them // J. Visualized Experim. 2010. 36. 1724-1727.
11. Ermert D., Urban C.F., Laube B. et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections // J. Innate Immun. 2009. 1. 181-193.
12. Metzler K., Hakkim A., Zychlinsky A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps // J. Cell Biol. 2010. 191. (3). 677-691.
FUNCTIONAL METABOLIC STATE OF NEUTROPHILE PHAGOCYTES IN PATIENTS WITH LONG TUBULAR BONE OSTEOMYELITIS
Elena Ivanovna KUZNETSOVA, Marina Vladimirovna CHEPELEVA, Nikolay Mikhaylovich KLYUSHIN, Sergey Ivanovich BURNASHOV
Scientific Center of Restorative Traumatology and Orthopedics n.a. acad.G.I. Ilizarov
of Minzdrav of Russia
640014 Kurgan, M. Ulyanov str., 6
The state of phagocytic activity of peripheral blood neutrophils was assessed in 50 patients with chronic posttraumatic osteomyelitis of long tubular bones. The increase of neutrophils functional metabolic activity was observed in chronic osteomyelitis regardless of the activity of the inflammation process that was associated with the overall direction effect of the immune cells - an effort of pathogen inactivation and elimination by phagocytosis. During chronic osteomyelitis exacerbation an alternative extra way of controlling infection pathogens is initiated that consists in the formation of neutrophilic traps.
Key words: osteomyelitis, neutrophile phagocytic activity, neutrophilic traps.
Kuznetsova E.I. - junior researcher of clinical laboratory of microbiology and immunology, e-mail: [email protected] Chepeleva M.V. - candidate of medical sciences, senior researcher of clinical laboratory of microbiology and immunology, e-mail: [email protected]
Klyushin N.M. - doctor of medical sciences, head of the laboratory ofpyogenic osteology and limb defect filling, e-mail: [email protected]
Burnashov S.I. - orthopaedic surgeon, head of bone infection department 2, e-mail: [email protected]
