CC BY
46
Ю.А. Погудин, В.Б. Студницкий, М.А. Медведев
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО рН В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ГЛАДКИХ МЫШЦ НАЧАЛЬНОЙ ЧАСТИ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА
Изучено влияние изменения рН на ГМК циркулярного слоя начальной части толстого кишечника методом двойного «сахарозного мостика»; показано, что внутриклеточное закисление приводит к активации, а внутриклеточное защелачивание характеризуется подавлением электрофизиологических параметров ГМК, изменяет ответ к АцХ и HNa.
Хорошо известно, что гладкие мышцы желудочнокишечного тракта (ЖКТ) характеризуются многообразием электрических и сократительных свойств, которые находятся под сложным контролем нервной и гуморальной систем регуляции организма. В этом плане особого внимания заслуживают не только сфинктерные образования ЖКТ, но и прилегающие к ним гладкомышечные структуры, которые имеют ряд особенностей функционирования миогенной природы, а также регуляции со стороны клеточно-межклеточных информационных посредников [1-3].
Наряду с классическими внутриклеточными информационными посредниками ионы водорода, создающие определённое значение внутриклеточного рН (рН;), существенным образом могут изменять функциональный ответ гладкомышечных клеток (ГМК) к воздействию факторов регуляции [4, 5].
Являясь одной из основных констант внутриклеточного гомеостаза, ионы водорода могут определять особенности электро- и фармакомеханического сопряжения ГМК ЖКТ и приводить к модулирующему или корригирующему влиянию конечного функционального ответа гладкомышечной ткани [4, 5].
Среди основных ионтранспортирующих систем регуляции рН; в гладких мышцах висцеральных органов наиболее важная роль принадлежит катионному -Na+/H+ обменнику и анионному - натрийзависимому -или натрийнезависимому Cl/HCO3 обменнику [6].
Разрозненность экспериментальных данных в имеющихся источниках литературы о роли и значении рН; в регуляции функции ГМК начальной части толстого кишечника, прилегающего к Баугиниевой заслонке [3], определили необходимость проведения анализа влияний изменения рН; в реакциях гладких мышц на электромеханическое сопряжение и действие биологически активных веществ.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования являлись гладкомышечные полоски циркулярного слоя начальной части толстого кишечника котов, на расстоянии до 1,5 см от илеоцекального сфинктера. Исследование электрофизиологических свойств гладких мышц проводилось методом двойного «сахарозного мостика» с одновременной регистрацией электрической и сократительной активности [7].
Нормальный раствор Кребса, использовавшийся в опытах, имел следующий состав (мМ): NaCl - 120,4; KCl - 5,9; NaHCO3 - 15,5; NaH2PO4 - 1,2; MgCl2 - 1,2; CaCl2 - 2,5; глюкоза - 11,5.
«Трис»-содержащий раствор был приготовлен из нормального раствора Кребса путем эквимолярной замены NaHCO3 на Трис-аминометан.
Гиперкалиевый раствор содержал (мМ): NaCl - 4,7; NaHCO3 - 3,6; KCl - 120; MgCl2 - 1,2; CaCl2 - 0,4; глюкоза - 11,5 [8].
Полученные результаты обсчитывали и выражали как в абсолютных единицах, так и в процентных отношениях к исходным показателям. Для статистической обработки использовали методы вариационной статистики.
Результаты исследований
Электрическая и сократительная активность ГМК начальной части толстого кишечника в нормальном растворе Кребса характеризовалась стабильным мембранным потенциалом покоя (МП) со средним значением 32,6±3,2 мВ (n=22).
Действие поляризующих прямоугольных импульсов электрического тока различной полярности сопровождалось развитием электротонических потенциалов, амплитуда которых зависела от силы тока.
Изучение действия гиперполяризующего тока на ГМК показало, что амплитуда анэлектротонического потенциала имела практически линейный характер от силы приложенного тока в диапазоне от 0,01 до 0,5 мкА. Дальнейшее увеличение силы гиперполяризующего тока сопровождалось развитием на нисходящей части АЭП заметного взлёта, который наиболее отчетливо проявлялся при силе раздражающего тока 1мкА и выше.
Деполяризующие импульсы тока силой 0,2 мкА и выше являлись для большинства гладкомышечных полосок пороговыми и вызывали генерацию потенциала действия (ПД), амплитуда которых составляла 3-5 мВ. Генерация ПД сопровождалась развитием сокращения препаратов, в которых фаза расслабления была более продолжительной, чем фаза сокращения.
Действие гиперкалиевого раствора [8] сопровождалось деполяризацией мембраны ГМК до постоянного стабильного уровня с генерацией на восходящей части деполяризации нескольких ПД. При этом развивалось сокращение, имеющее фазную и тоническую компоненты. Величина тонической компоненты от фазной составляла 42,6±2,21% (р<0,05; n=8) и сохранялась в течение всего времени действия деполяризующего раствора. Основной измеряемой характеристикой в этих экспериментах служили величина и продолжительность сократительного размыкательного ответа (РО) на окончание действия гиперполяризующих импульсов тока длительностью 11 с и силой 10 мкА. Величина РО не превышала величины силы фазной компоненты и составляла в среднем 32,3±2,04% (р>0,05; n=8). РО длились не менее 3 мин и использовались в дальнейшем для оценки вклада роли кальциевой компоненты в регуляции сокращений ГМК.
Для изучения роли калиевой проводимости мембраны в генерации ПД ГМК было изучено влияние блокатора калиевых каналов мембраны - тетраэтил-аммония (ТЭА) в концентрации 10 мМ. Применение ТЭА приводило к стойкой деполяризации мембраны на 0,92±0,03 мВ (п=14). Одновременно с этим происходил рост сопротивления мембраны ГМК, которое составляло 107,6±5,1% (р<0,05; п=14) от исходных значений. При этом на 4-5-й мин действия ТЭА появлялись ано-доразмыкательные ответы. В отдельных случаях на плато КЭП могли возникать несколько потенциалов действия. Происходило увеличение мышечного тонуса препаратов, которое достигало наибольших значений к
3-4-й мин действия ТЭА. Сила вызванных сокращений при этом увеличивалась на 265±10,6% (р<0,05; п=14). У части ГМ препаратов возникала спонтанная электрическая и сократительная активность.
Для выяснения роли внеклеточных ионов Са2+ в электрогенезе ГМК было изучено влияние блокатора кальциевых каналов - никардипина.
Применение никардипина в концентрациях от 100 нМ до 100 мкМ приводило к дозозависимому ингибированию вызванной электрической и сократительной активности гладких мышц. В концентрации 100 мкМ никардипин вызывал полное подавление вызванной электрической и сократительной активности и приводил к подавлению РО.
Таким образом, опыты с подавлением калиевой и кальциевой проводимости мембраны гладких мышц показывают, что в генерации ПД основная роль принадлежит кальциевым каналам, а калиевая проводимость вносит существенный модулирующий вклад в электровозбудимость.
Для изучения роли биологических активных веществ в регуляции функции гладких мышц были использованы ацетилхолин (АцХ) как медиатор парасимпатической нервной системы и нитропруссид натрия (НЫа) как донор активной формы оксида азота (N0 ), который является одним из важнейших регуляторов функции ГМ висцеральных органов [4].
АцХ в концентрации от 10 нМ до 1 мкМ оказывал дозозависимое активирующее влияние на параметры электрической и сократительной активности ГМК, вызывая начальную деполяризацию мембраны, которая сопровождалась генерацией нескольких ПД и развитием сокращения. Наиболее выраженный эффект АцХ наблюдался в концентрации 1 мкМ, а величина сократительного ответа при этом составляла 563,6±23,7 мН (п=12).
Действие НЫа в концентрациях от 100 нМ до 10 мкМ оказывало дозозависимое ингибирующее влияние на электрофизиологические параметры ГМК, вызывая снижение сопротивления, подавление вызванной электрической и сократительной активности. Действие нитропруссида натрия в этих концентрациях не приводило к развитию начальной гиперполяризации мембраны ГМК. В концентрации 100 мкМ НЫа приводил к гиперполяризации мембраны на 1,4±0,2 мВ (п=8). Со-
противление мембраны ГМК снижалось на 31,1±1,8% (р>0,01; п=8) по сравнению с контрольными значениями. Наблюдалось снижение амплитуды ПД, сократительные ответы полностью исчезали. Эти эффекты сохранялись в течение всего времени действия НЫа.
На фоне ТЭА воздействие НЫа (100 мкМ) приводило к снижению величины сопротивления мембраны ГМК на 11,5±0,8% (р>0,05; п=14). Величина гиперполяризации в первую минуту действия препарата составляла 0,4±0,05 мВ (п=14) и восстанавливалась на 3-
4-й мин его действия, при этом анодоразмыкательные ответы восстанавливались на 4-5-й мин действия НЫа. Амплитуда ПД снижалась до 57,3±2,63% (р<0,05; п=14), а сократительные ответы составляли 18,5±1,08% (р>0,05) от исходной величины. В этих условиях у части препаратов происходило восстановление спонтанной электрической и сократительной активности.
На фоне действия гиперкалиевого раствора применение НЫа (100 мкМ) не приводило к изменению уровня тонического напряжения, а сила РО уменьшалась на 87,4±3,7% (р<0,05; п=6) от исходных значений. Длительность тонической компоненты увеличивалась в 34 раза по сравнению с контрольными значениями.
Метиленовый синий (100 мкМ) как блокатор растворимой фракции гуанилатциклазы приводил к начальной деполяризации мембраны ГМК величиной 0,4±0,03 мВ (п=6) и снижению сопротивления мембраны на 9,2±0,4% (р<0,05; п=6). Сила вызванных сокращений составляла 176,8±8,3% (р<0,05; п=6) без изменения исходного тонуса.
В этих условиях НЫа (100 мкМ) вызывал начальную гиперполяризацию мембраны величиной 1,1±0,06 мВ (п=8), которая исчезала на 4-5-й мин, при этом регистрировалось снижение тонуса мышечных полосок на 54,9±5,2 мН (п=8) в течение всего времени действия препарата. Сопротивление мембраны уменьшалось до 82,4±3,93 % (р<0,05; п=8), а вызванные сократительные ответы снижались на 74,6±2,86 % (р<0,05;п=8) от исходных значений.
Таким образом, АцХ оказывал дозозависимое активирующее влияние на ГМК, а НЫа оказывал дозозависимое ингибирующее действие, которое сопровождалось гиперполяризацией, снижением величины сопротивления мембраны и подавлением вызванных показателей электрической и сократительной активности. Эффекты НЫа не подавляются метиленовым синим.
Одним из методических приёмов для изменения внутриклеточного рН клеток является применение раствора хлорида аммония (N^01). Показано, что при инкубации клеток в растворе, содержащем хлорид аммония, свободное основание NHз легко проникает через плазматическую мембрану и, протонируясь до КН+ , вызывает заще-лачивание цитоплазмы. Удаление хлорида аммония из омывающего раствора приводит к тому, что молекулы КН3 выходят из клеток с большей скоростью, чем протоны, а это приводит к внутриклеточному закислению ниже исходного уровня состояния рН1 в покое [2, 4].
А
(20 мМ) (20 мМ)
5 мВ~£_________100 нМ
5 сек
Рис. 1. Действие хлорида аммония (20 мМ) на электрические и сократительные свойства циркулярного слоя гладких мышц начальной части толстого кишечника:
А1-А3 - анэлектротонические потенциалы; К1-К3 - катэлектротонические потенциалы; С1-С3 - сокращение. А - регистрация записи проводилась на самопишущем потенциометре КСП-4; В - микрофотографии регистрировались ФОР 2 с экрана осциллографа С1-18.
Здесь и далее нижняя кривая - электрическая, верхняя - сократительная активность
МИ4С1 (20 мМ) в первые 2-3 мин вызывал снижение тонуса гладкомышечных полосок на 19,8 ± 0,87 мН (п=7), уменьшение сопротивления мембраны (84,25±3,84% (р<0,05; п=7)), уменьшение амплитуды ПД (96,0±4,78% (р>0,05; п=7)) и силы вызванных сокращений до 36,4 ± 2,33 % (р<0,05; п=7) от контрольных значений. В дальнейшем происходило постепенное восстановление электрофизиологических параметров (рис. 1). Окончание действия МИ4С1 сопровождалось повышением тонуса ГМ полосок на 64,3±3,95 мН, увеличивалась амплитуда вызванных ПД до 107,0±4,1% (р>0,05), а величина сопротивления мембраны составляла 90±3,95% (р>0,05; п=7). Сила вызванных сокращений увеличивалась (122,3±5,2% (р<0,05; п=7)) от контрольных значений в нормальном растворе Кребса (см. рис. 1).
На фоне действия ТЭА хлорид аммония (20 мМ) вызывал частичное подавление вызванных ПД (43,5± ±1,83% (р<0,05; п = 8)), снижение сопротивления мембраны (89,5 ± 3,56% (р<0,05; п = 8)) и силы вызванных сокращений (61,4±2,6% ( р<0,05; п = 8)) от контрольных значений. При этом происходило полное подавление как электрических, так и сократительных анодо-размыкательных ответов (рис. 2).
Окончание действия МИ4С1 сопровождалось повышением тонуса гладкомышечных препаратов (73,2±3,78 мН (п = 8)), величины сопротивления мембраны (96,8 ± 4,2% (р>0,05; п = 8)) от контрольных
значений. Восстанавливались электрические и сократительные анодоразмыкательные ответы, а вызванная сократительная активность достигала исходного уровня (см. рис. 2).
На фоне гиперкалиевой деполяризации действие МИ4С1 (20 мМ) вызвало снижение РО до 67,4±3,3% (р<0,05) от исходных значений. При этом наблюдалось снижение не только фазной компоненты, но и тонической. Внутриклеточное закисление, вызванное удалением МИ4С1, сопровождалось увеличением РО, которое составило 127,4±8,3% (р<0,05; п=8).
Для выяснения роли изменения рН; в эффектах ИКа была проведена серия экспериментов с добавлением и отменой МИ4С1 (20 мМ).
На 2-й мин воздействия МИ4С1 ИКа (100 мкМ) приводил к развитию гиперполяризации мембраны на 1,5±0,08 мВ (п=11), которая к 5-6-й мин частично нивелировалась. При этом величина сопротивления мембраны составляла 42,4±2,03% (р<0,05; п=11) по сравнению с контрольными значениями. Вызванные импульсами сократительные ответы полностью подавлялись (рис. 3).
Окончание действия МИ4С1 сопровождалось постепенным восстановлением величины МП до исходного уровня, сопротивления мембраны до 72,4±3,6% (р<0,05; п=11) и величины вызванных сократительных ответов до 12,5±0,04% (р<0,05; п=11) по сравнению с контрольными значениями (см. рис. 3).
Рис. 2. Действие хлорида аммония (20 мМ) на электрические и сократительные свойства циркулярного слоя гладких мышц начальной части толстого кишечника на фоне тетраэтиламмония (10 мМ). Обозначения аналогичны рис. 1
Рис. 3. Влияние нитропруссида натрия (100 мкМ) на электрические и сократительные свойства циркулярного слоя гладких мышц начальной части толстого кишечника на фоне действия и отмены хлорида аммония (20 мМ). Обозначения аналогичны рис. 1
На фоне действия ТЭА (10 мМ) и МИ4С1 (20 мМ) нитропруссид натрия (100 мкМ) вызывал начальную гиперполяризацию величиной 0,3±0,02 мВ (п=7), снижение величины сопротивления мембраны на 9,4±0,71% (р>0,05; п=7) и силы вызванных сократительных ответов до 42,4±2,14% (р<0,05; п=7) от контрольных значений. При этом сохранялись анодораз-мыкательные электрические ответы, а сила возникающих при этом сокращений составляла 9,5±0,05% (р>0,05; п=7) от исходных значений.
Окончание воздействия МИ4С1 сопровождалось повышением тонуса ГМ препаратов 21,2±3,78 мН (п=7), частичным восстановлением сопротивления мембраны (94,9±4,45% (р<0,05; п=7)), величины вызванного сократительного (66,4±2,68% (р<0,05)) и анодоразмыка-тельного ответа (75,6±3,26 % (р<0,05; п=7)).
На фоне действия МИ4С1 (20 мМ) влияние ацетил-холина (1 мкМ) сопровождалось снижением величины вызванного сократительного ответа на 54,2±2,4%
(р<0,05). На фоне внутриклеточного закисления, связанного с окончанием действия МИ4С1, величина АцХ вызванных сокращений составляла 118,6±7,3% (р<0,05; п=6) от контрольных значений в нормальном растворе Кребса.
Таким образом, изменение рН; ГМК начальной части толстого кишечника сопровождалось ярко выраженными изменениями электрической и сократительной активности. При этом внутриклеточное защелачивание приводило к подавлению параметров электрической и сократительной активности, а внутриклеточное закис-ление повышало уровень этих показателей. Подавление калиевой проводимости мембраны существенным образом меняло характер воздействия этих изменений.
В следующих сериях экспериментов была предпринята попытка оценки роли катионного - Ка+/Н+ и анионного - СГ/ИСОз обменников в регуляции электрической и сократительной активности гладких мышц толстого кишечника.
Амилорид как один из блокаторов Ка+/Н+ обмена в концентрации 100 мкМ вызывал повышение тонуса препаратов на 17,4±0,4 мН (п=8) вызванных сократительных ответов (123±5,14% (р<0,05; п=8)) и снижение сопротивления мембраны на 8,5±0,65% (р>0,05; п=8) по сравнению с контрольными значениями. На этом фоне ацетилхолин (1 мкМ) приводил к увеличению сократительного ответа до 104±8% (р>0,05; п=12).
Известно, что функционирование хлор-бикарбонат-ного обменника зависит от концентрации ионов хлора и гидрокарбонат анионов в омывающем растворе [6].
Применение «Трис»-аминометанового раствора приводило к незначительному изменению величины МП и сопротивления мембраны (95,6±4,5% (р>0,05; п=12)). На 57-й мин действия данного раствора наблюдалось повышение тонуса ГМ препаратов (75,8±6,3 мН (п=12)), а величина вызванных сократительных ответов снижалась и составляла 72,5±3,24% (р<0,05; п=12) от контрольных значений.
На фоне действия данного раствора применение КИ4С1 (20 мМ) вызывало увеличение тонуса ГМ препаратов на 77,5±3,9 мН (п=6), уменьшение сопротивления мембраны до 98,7±4,75% (р>0,05; п=6), а сила вызванных сокращений полностью подавлялась. В дальнейшем регистрировалось постепенное восстановление величины вызванных электрических и сократительных ответов до 16,7±0,83% (р>0,05; п=6) от исходных значений.
Внутриклеточное закисление, связанное с отменой хлорида аммония в этих условиях, не изменяло тонус мышечных полосок, но приводило к восстановлению величины сопротивления мембран и увеличению силы вызванных сокращений до 189,6±9,4% (р<0,05; п=6) по сравнению с контрольными значениями.
В этих условиях на фоне действия ТЭА (10 мМ) применение МИ4С1 (20 мМ ) сопровождалось снижением сопротивления мембраны до 89,5±3,56% (р<0,05; п=8), уменьшением амплитуды ПД до 81,4±3,56% (р<0,05; п=8) и практически полным подавлением вызванных сократительных ответов (6,8±2,47% (р>0,05; п=8)) по сравнению с контрольными значениями.
При удалении МН4С1 из этого раствора наблюдалось увеличение тонуса ГМ препаратов в среднем на 73,2±3,78 мН (п=8). Величина сопротивления мембраны составляла 96,8±4,2% (р>0,05; п=8) от контрольных значений, при этом восстанавливались анодоразмыкатель-ные ответы, а сила вызванных сокращений составляла 124,7±9,4% (р<0,05; п=8) от контрольных значений.
Таким образом, применение «Трис»-содержащего раствора приводит к частичному подавлению вызванной электрической и сократительной активности, которые нивелируются ТЭА. В этих условиях внутриклеточное защелачивание приводит к усилению подавляющего эффекта, а внутриклеточное закисление характеризуется восстановлением параметров электрической и сократительной активности.
Сопоставляя результаты полученных экспериментальных данных по влиянию изменения рН; на параметры электрической и сократительной активности ГМК начальной части толстого кишечника котов, можно сделать заключение:
- внутриклеточное закисление приводит к активации показателей вызванной электрической и сократительной активности ГМК, которые усиливаются на фоне подавления калиевой проводимости мембраны;
- внутриклеточное защелачивание характеризуется подавлением параметров вызванной электрической и сократительной активности ГМК за счет активации калиевой проводимости мембраны и подавления кальциевой компоненты;
- при внутриклеточном закислении отмечается увеличение сократительного ответа на ацетилхолин, а внутриклеточное защелачивание приводит к подавлению его действия;
- нитропруссид натрия вызывает дозозависимые ингибирующие эффекты на параметры вызванной электрической и сократительной активности. Внутриклеточное закисление при этом снижает угнетающие эффекты нитропруссида натрия преимущественно за счёт подавления калиевой проводимости мембраны.
Обобщая вышеизложенный материал, можно заключить, что в ГМК начальной части толстого кишечника активно функционирует не только натрий-протонный обменник, но и хлор-бикарбонатный, изменение активности которых вносит существенный вклад в регуляцию электрофизиологических свойств данного отдела кишечника и определяет его моторную активность. При этом внутриклеточное закисление оказывает активирующее действие на параметры электрической и сократительной активности, а внутриклеточное защелачивание приводит к повышению угнетающего влияния нитропруссида натрия, который может оказывать как прямое цГМФ-зависимое, так и цГМФ-независимое действие на параметры электромеханического сопряжения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Berk B.C. Vascular Smooth Muscle Growth: Autocrine Growth Mechanisms // Physiol. Rev. 2001. Vol. 81. P. 999-1030.
2. Bolton T.B. Excitation-contraction coupling in gastrointestinal and other smooth muscles / T.B. Bolton, S.A. Prestwich, A.V. Zholos, D.V. Gordienko
// Annu. Rev. Vol. Physiol. 1999. Vol. 61. P. 85-115.
3. Ignarro L. Nitric oxide as a signaling molecule in the vascular system: an overview / L. Ignarro, G .Cirino, A. Casini, C. Napoli // J. Cardiovasc. Phar-
macol. 1999. Vol. 34, № 6. P. 879-886.
4. Boron W.F. Regulation of intracellular pH // Advan. Physiol. Edu. 2004. N° 28. P. 160-179.
5. Roos A. Intracellular pH // Physiol. Rev. 1981. Vol. 61. P. 296-434.
6. Simchowitz L. Intracellular pH recovery from alkalinization: Characterization of choloride and bicarbonate transport by the anion exchange system of
human neutrofile // J. Gen. Physiol. 1990. Vol. 96, № 5. G. 1037-1059.
7. Артеменко Д.П. Методика дослвджения електричних властивостей нервових та м'язових волокон за допомогою поверхневих позаклггинних
електродiв // Физиол. ж. АН УССР. 1964. Т. 10, № 3. С. 403-407.
8. Ходоров Б.И. Роль хемовозбудимых кальциевых каналов в механизмах действия ацетилхолина, гистамина и брадикинина на деполяризован-
ную гладкую мышцу // Физиология и биохимия медиаторных процессов: Тез. докл. Всесоюз. конф. М., 1976. С. 133-134.
Статья поступила в редакцию журнала 5 декабря 2006 г., принята к печати 25 декабря 2006 г.
