Функциональная характеристика донорских тромбоцитов после замораживания до низких и ультранизких температур Текст научной статьи по специальности «Прочие сельскохозяйственные науки»

К.А. Ветошкин, С.В. Утемов, М.Г. Князев, Ф.С. Шерстнев, А.А. Костяев ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДОНОРСКИХ ТРОМБОЦИТОВ ПОСЛЕ ЗАМОРАЖИВАНИЯ ДО НИЗКИХ И УЛЬТРАНИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР

ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России»

Трансфузии тромбоцитных концентратов (ТК) - эффективный метод профилактики и лечения тромбоцитопенического геморрагического синдрома, обусловленного применением современных протоколов высокодозной химиотерапии у больных с гематологическими и онкологическими заболеваниями, радиационным облучением, воздействием миелотоксических средств, повышенным разрушением кровяных пластинок. Ежегодно в мире наблюдается рост на 5 - 7% числа переливаний ТК [6]. Увеличение числа трансфузий кровяных пластинок диктует необходимость создания постоянных запасов функционально полноценных клеток. Однако создание резерва полноценных донорских ТК лимитировано короткими сроками их годности при положительных температурах. Регламентированные в настоящее время методы позволяют консервировать кровяные пластинки при +20° ^ +24°С лишь в течение 5 дней.

Более длительное хранение тромбоцитов возможно при их замораживании до низких и ультранизких температур, при этом обеспечение адекватного количества функционально активных клеток с помощью замораживания достигается применением растворов криопротекторов.

Анализ научных публикаций по вопросам криоконсервирования тромбоцитов [1, 3, 5] показал, что разработка криоконсервантов с использованием комбинаций хладоограждающих агентов позволяет увеличить количественную сохранность клеток при замораживании. Нами разработан новый комбинированный криоконсервант для замораживания донорских ТК на основе гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (ГМБТОЭМ) и диметилацетамида (ДМАЦ).

Тромбоциты - чрезвычайно чувствительные клетки, которые реагируют на любые внешние воздействия, в том числе низкие температуры, но при специальных режимах охлаждения, хранения и деконсервирования сохраняют высокую функциональную активность.

С целью определения функций тромбоцитов и их устойчивости к замораживанию под защитой протекторов изучают адгезию, агрегацию, реакцию на гипотонический шок (РГШ) кровяных пластинок. Указанные показатели считаются информативными и адекватными критериями, косвенно характеризующими сохранность гемостатической функции тромбоцитов (адгезия и агрегация) и их способность циркулировать в кровяном русле после переливания (РГШ).

В связи с этим проведены исследования функциональных свойств тромбоцитов после их замораживания с новым криофилактиком и хранения в условиях низких (-80°С) и ультранизких (-196°С) температур.

Материалы и методы. Донорские ТК получали аппаратным методом, смешивали с раствором криоконсерванта в объемном соотношении 1:1, экспозиция составляла до 15 минут. Замораживание концентратов клеток до -80°С выполняли по экспоненциальной программе [4], а до -196°С - по линейному режиму со скоростью 3°С/мин до -90°С с последующим переносом образцов в биохранилище [2]. Срок хранения ТК составил 1 год. Размораживание производили в водяной бане при +37 ^ +38°С.

Количество тромбоцитов подсчитывали в камере Г оряева.

Функциональную активность кровяных пластинок исследовали

непосредственно после получения ТК и сразу же после размораживания образцов. Оценивали адгезию тромбоцитов к стеклу, агрегацию, индуцированную АДФ (концентрация индуктора 2,5 мкг/мл) и адреналином (2,5 мкг/мл) с помощью лазерного агрегометра «Биола» (модель LA - 230). Учитывали максимальную степень агрегации и средний радиус агрегатов. РГШ измеряли с использованием спектрофотометра СФ-46 при длине волны 610 нм в течение 10 минут.

Результаты. Изучили функциональные свойства донорских

тромбоцитов до замораживания и после 1 года хранения при низкой (-80°С) и ультранизкой (-196°С) температурах. Результаты представлены в таблице.

Хранение ТК в течение 1 года при -80°С сопровождалось снижением количества кровяных пластинок на 9,7% от уровня до замораживания клеточной суспензии. Понижались агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ, на 5,3%, и на 1,9% степень агрегации, индуцированной адреналином. При этом выявлено достоверное уменьшение среднего размера агрегатов до 59,1 - 67,3% (от исходных значений). Достоверно снизилась адгезия размороженных тромбоцитов к стеклу (на 13,2%) и способность их к РГШ (на 10,9%).

Анализ результатов хранения ТК в среде жидкого азота показал высокую количественную сохранность ТК (88,1±5,6%). При этом агрегационная активность кровяных пластинок после добавления АДФ значимо снизилась на 2,7%, адреналина - на 2,9%, функции адгезии к стеклу - на 10,2%. Выявлено уменьшение размера агрегатов с 4,5 до 2,5 (в случае индукции АДФ) и с 4,3 до 2,6 условных единиц (при индукции адреналином). Отмечено понижение РГШ на 13%.

Таблица - Функциональные свойства тромбоцитов донорской крови до замораживания и после 1 года хранения при различных температурных режимах_________________________________________________________

Параметры Хранение при -80°С (n = 20) Хранение при -196°С (n = 15)

нативный ТК после разморажи- вания сохранность, % нативный ТК после разморажи- вания сохранность, %

Количество тромбоцитов 100 90,3±4,2* 90,3±4,2 100 88,1±5,6* 88,1±5,6

Агрегация с АДФ степень, % 17,8±8,4 12,6 ±4,6* 65,9±15,1 10,7±2,9 8,0±1,5* 74,8±11,2

размер агрегатов 5,2±1,95 2,4±0,9* 67,3±9,5 4,5±1,3 2,5±0,4* 62,9±18,3

усл. ед.

Агрегация с адреналином степень, % 15,1±3,7 13,2± 4,1 75,3±16,6 15,7±5,4 12,8± 4,3* 71,5±14,8

размер агрегатов усл. ед. 5,2±2,1 2,6±0,9* 59,1±18,8 4,3±1,3 2,6±0,6* 69,3±10,1

Адгезия к стеклу, % 45,7±12,4 31,9 ±9,7* 63,5±6,1 31,0±3,2 20,8±4,5* 67,1±4,0

РГШ, % 98,1±1,6 87,2±3,1* 88,8±3,1 98,3±1,7 85,3±3,1* 85,7±1,6

p<0,05 при сравнении с показателями нативных

К.

*

Сравнение показателей ТК, хранившихся при низких (-80°С) и ультранизких (-196°С) температурах в течение 1 года, приведено на рисунке.

Температура хранения

ТК □ -

80°С

Рисунок - Сохранность ТК после 1 года хранения при -80°С и -196°С.

Не выявлено достоверных различий между количественными и функциональными характеристиками ТК, замороженных до температур -80°С и -196°С (p>0,05). Таким образом, тромбоциты, замороженные с комбинированным криоконсервантом и хранившиеся 1 год как при низких, так и ультранизких температурах, после размораживания демонстрировали достаточно высокие функциональные свойства. На основании проведенных комплексных лабораторных исследований установлено, что новый хладоограждающий раствор может быть рекомендован для апробации с целью криоконсервирования донорских ТК и последующего создания их запасов.

Список литературы

1. Богданчикова, О.А. Замораживание тромбоцитов в криозащитных средах, содержащих различные комбинации криопротекторов / О.А. Богданчикова, Т.М. Гурина, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т. 18, №

1. - С. 109 - 113.

2. Инструкция по криоконсервированию клеток крови. - М., 1995. - 21 с.

3. Криоконсервирование тромбоцитов. Эффективность криоконсервантов на основе комбинаций криопротекторов при различных режимах

замораживания / О.А. Богданчикова, В.А. Киреев, А.Т. Ходько, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии. - 2010. - Т.20, №4. - С. 443 - 452.

4. Кузнецов, К.В. Консервирование тромбоцитов замораживанием при -80°С по экспоненциальной программе (экспериментальное исследование): автореф. дис.... канд. мед. наук / Кузнецов Константин Васильевич. - СПб. -2006. - 23 с.

5. Дослщження морфофункщонально! збереженност тромбоцилв на етапах крюконсервування / А.М. Компашець, О.В. Книш, Т.М. Гурша [та ш.] // Проблемы криобиологии. - 2006. - Т. 16, №2. - С. 182 - 191.

6. Slichter, S. New thoughts on the correct dosing of prophylactic platelet transfusions to prevent bleeding / S. Slichter // Curr. Opin. Hematol. — 2011. — 18 (6) — P. 427 - 435.