CC BY
84
моопросника депрессии СБ8-Б и шкалы Спилберге-ра—Ханина, позволяет сделать вывод о выраженной социальной дезадаптации женщин, страдающих бесплодием, проявляющейся высоким уровнем тревоги и депрессией.
5. На основании полученных данных сделан вывод о необходимости комплексного подхода к диагностике и лечению у женщин позднего репродуктивного возраста, страдающих бесплодием, с применением как традиционных подходов, так и психокорректирующих методик.
Сведения об авторах:
ГБОУ ВПО Первый Московский государственный университет им. И.М. Сеченова
Колесников Дмитрий Борисович — канд. мед. наук, вед науч. сотр.; e-mail: DBKolesnikov@rambler.ru. ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов
Кафедра акушерства и гинекологии с курсом перинатологии
Ермоленко Кристина Станиславовна — врач акушер-гинеколог, соискатель кафедры. Соловьева Алина Викторовна — д-р мед. наук, проф. кафедры.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мишиева Н.Г., Назаренко Т. А., Краснопольская К.В., Крстич Е.В. Лечение бесплодия у женщин старшего репродуктивного возраста. Российский вестник акушера-гинеколога. 2008: 5: 51—5.
2. Shahid S. Depression in infertile couples. J. Coll. Phys. Surg. Pak. 2009; 19 (6): 395—6.
3. Gurhan N., Akyuz A., Atici D., Kisa S. Association of depression and anxiety with oocyte and sperm numbers and pregnancy outcomes during in vitro fertilization treatment. Psychol. Rep. 2009; 104 (3): 796—806.
4. Volgsten H., Ekselius L., Poromaa I.S., Svanberg A.S. Personality traits associated with depressive and anxiety disorders in infertile
women and men undergoing in vitro fertilization treatment. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2010; 89 (1): 27—34.
5. Klemetti R., Raitanen J., Sihvo S. et al. Infertility, mental disorders and well-being — a nationwide survey. Acta Obstyet. Gynecol. Scand. 2010; 89 (5): 677—82.
6. Kraaij V., Garnefski N., Schroevers M.J. et al. Cognitive coping, goal adjustment, and depressive and anxiety symptoms in people undergoing infertility treatment: a prospective study. Hlth Psychol. 2010; 15 (6): 876—86. Epub. 2010 May 7.
7. Aarts J.W., van Empel I.W., Boivin J. et al. Relationship between quality of life and distress in infertility: a validation study of the Dutch FertiQoL. Hum. Reprod. 2011; 26 (5): 1112—8. Epub. 2011 March 3.
Поступила 18.12.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.248+616.33-008.17-032:611.329]-092.18-07
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ АЛЬВЕОЛЯРНЫХ МАКРОФАГОВ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ И ГАСТРОЭЗОФАГЕАЛЬНОЙ РЕФЛЮКСНОЙ БОЛЕЗНЬЮ
И.В. Маев1, С.В. Лямина1, С.В. Калиш12, Е.В. Малышева1, Г.Л. Юренев1, И.Ю. Малышев1'3
1ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Минздрава России; 2ГОУ ВПО Владимирский государственный университет им. А.Г. и Н.Г. Столетовых Минздрава России; 3ГБУ Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва
Сегодня сочетание бронхиальной астмы (БА) и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) является достаточно распространенной клинической ситуацией. Доказано взаимное влияние этих патологических состояний друг на друга, связанное с нарушением иммунного ответа. У пациентов с БА, ГЭРБ и их сочетанием изучена фенотипическая принадлежность и фенотипическая пластичность клеток системы врожденного иммунитета — альвеолярных макрофагов. Показано, что при БА альвеолярные макрофаги имеют преимущественно антивоспалительный фенотип М2, при ГЭРБ — преимущественно провоспалительный фенотип М1, а при сочетании ГЭРБ и БА происходит увеличение популяции макрофагов фенотипа М1 по сравнению с показателем при БА. В экспериментах in vitro показано, что кислая среда способствует изменению фенотипа макрофагов в сторону провоспалительного фенотипа М1, т. е. воспроизводит ситуацию, характерную для ГЭРБ. При изучении фе-нотипической пластичности макрофагов установлено, что присоединение ГЭРБ к БА уменьшает диапазон, в пределах которого макрофаги могут менять свой фенотип М1, т. е. становятся более «ригидными», но увеличивает диапазон, в пределах которого макрофаги могут менять свой фенотип М2; ГЭРБ также способствует развитию морфологической «ригидности» макрофагов; у больных БА на фоне стероидной терапии обнаружен фномен инверсии фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов. Полученные данные характеризуют иммунологическую составляющую в патогенезе БА, ГЭРБ и их сочетания, помогают лучше понять механизмы возникновения или усиления бронхолегочной патологии у больных ГЭРБ и могут быть использованы при разработке новых подходов в лечении этих заболеваний.
Кл ючевые слова: бронхиальная астма; гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь; альвеолярные макрофаги; фенотипы макрофагов; фенотипическая пластичность.
FUNCTIONAL ACTIVITY OF ALVEOLAR MACROPHAGES IN PATIENTS WITH BRONCHIAL ASTHMA AND GASTROESOPHAGEAL REFLUX DISEASE
I.V. Maev', S.V. Lyamina1, S.V. Kalish12, E.V. Malysheva', G.L. Yurenev1, I.Yu. Malyshev13
'Moscow State Medical Stomatological University; 2A.G. and N.G. Stoletovs Vladimir State University; 'Institute of General Pathology and Pathophysiology RAMN
Combination of bronchial asthma (BA) and gastroesophageal reflux disease (GERD) is a widespread clinical situation. The two pathologies are known to influence each other leading to disturbances in immune responsiveness. We studied phenotypes and phenotypic plasticity of immune cells (alveolar macrophages) in patients with BA and GERD. It was shown that BA and GERD are largely associated with AM of proinflammatory M2 and anti-inflammatory Ml phenotypes respectively. Population of AM with MIphenotype increases in patients having both BA and GERD compared with that in BA alone. In vitro experiments showed that acidic milieu promotes shifting the phenotype toward the predominance of Ml, i.e. simulates the situation characteristic of GERD. Combination of BA and GERD narrows the interval within which AM can change MI phenotype (i.e. makes them more «rigid») but broadens the range in which they can change M2 phenotype. Also, GERD promotes the development of morphological rigidity of AM. Patients with BA given steroid therapy undergo inversion of phenotypic plasticity of AM. These data characterize the immunological component of BA and/or GERD pathogenesis. They help to better understand mechanisms of development of broncho-pulmonary pathology in GERD patients and can be used to work out new methods for the treatment of these diseases.
Key words: bronchial asthma; gastroesophageal reflux disease; alveolar macrophages; phenotypes of macrophages; phe-notypc plasticity.
В настоящее время сочетание бронхиальной астмы (БА) и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) не является редкой клинической ситуацией [1]. Интерес врачей и исследователей к сочетанию БА и ГЭРБ обусловлен высокой распространенностью симптомов ГЭРБ среди больных БА, взаимным влиянием этих патологических состояний друг на друга [1] и ростом числа тяжелых форм обоих заболеваний. В связи с этим дальнейшее изучение механизмов развития со-четанной патологии бронхолегочной системы и желудочно-кишечного тракта имеет высокую научную и практическую значимость. В развитии ГЭРБ ключевую роль играет гастроэзофагеальный рефлюкс, т. е. заброс кислого содержимого желудка в пищевод со снижением в нем значения рН. ГЭРБ может не только проявляться симптомами поражения пищевода, но также служить причиной различных внепищеводных проявлений [2].
Общим компонентом патогенеза БА и ГЭРБ является развитие воспалительного процесса с нарушением иммунных реакций в форме дисбаланса между клеточным (ТЫ) и гуморальным (!Ъ2) ответами [3]. При этом известно, что интенсивность воспаления и выбор между ТЪ1- и ТЪ2- опосредованными ответами в значительной мере зависят от клеток врожденного иммунитета — макрофагов. Эти клетки в зависимости от микроокружения могут приобретать либо провоспалительный фенотип М1, либо альтеративно антивоспалительный фенотип М2 [4]. Фенотип М1 предопределяет развитие клеточного ТЪ1-ответа, а М2 — гуморального ТЬ2-ответа [5, 6].
Установлено, что при БА альвеолярные макрофаги меняют свой фенотип [7]. Это может быть связано с изменением физико-химических свойств, например рН, или концентрацией цитокинов и сурфактантных белков [6, 8—10]. Не исключено поэтому, что дисбаланс ТЫ/ ТЬ2 в легких может быть связан с изменением фенотипа макрофагов и/или с нарушением их способности менять свой фенотип, т. е. с нарушением их фенотипической пластичности. Эти представления порождают гипотезу об иммунном механизме в развитии сочетанной патологии БА и ГЭРБ. Можно предположить, что у больных ГЭРБ микроаспирация кислого содержимого желудка в легкие может дополнительно сдвигать фенотип и фено-типическую пластичность альвеолярных макрофагов в сторону проастматического паттерна.
Чтобы доказать эту гипотезу, необходимо ответить на 3 важных вопроса. Во-первых, в какую сторону меняется фенотип альвеолярных макрофагов при БА, ГЭРБ и их сочетании? Во-вторых, может ли кислая среда вызвать аналогичные изменения фенотипа макрофагов? И, в третьих, нарушается ли при этих заболеваниях фе-
нотипическая пластичность альвеолярных макрофагов? Цель работы состояла в попытке ответить на указанные вопросы о характере нарушений иммунного ответа при БА, ГЭРБ и их сочетании.
Материал и методы
В исследование были включены 4 группы больных. В 1-й группе [БА (ГКС-)] 8 пациентов с БА (возраст 41,75 ± 3,92 года) не получали глюкокортикостероиды (ГКС); во 2-й группе [БА (ГКС+)] 8 больных БА (возраст 47,25 ± 2,7 года) получали ингаляционные ГКС; в 3-й группе [БА (ГКС+) + ГЭРБ] 8 пациентов с БА и ГЭРБ (возраст 41,25 ± 2,63 года) получали ингаляционные ГКС для лечения БА; 4-ю группу (ГЭРБ) составили 8 больных ГЭРБ (возраст 47,6 ± 3,62 года). В исследование включали пациентов с заболеваниями в стадии ремиссии и не включали больных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, острыми инфекционными заболеваниями, системными заболеваниями соединительной ткани с изменениями функции дыхательной системы, онкологическими заболеваниями, туберкулезом, нарушениями свертывающей системы крови, а также курящие, беременные или кормящие грудью и лиц моложе 18 или старше 70 лет.
Альвеолярные макрофаги выделяли из бронхоальвео-лярной лаважной жидкости (БАЛЖ) [11, 12]. Все пациенты подписывали форму информированного согласия. Сразу после выделения макрофагов определяли их фенотип по CD-маркерам на проточном цитофлюориметре FC500 (Beckman Coulter, США) по инструкциям производителя. Маркерами фенотипа М1 являются CD80 и CD25, а фенотипа М2 — CD163 и CD206 [4].
Для оценки влияния кислой среды на фенотип макрофагов были использованы макрофаги мышей линий С57/ BL6 и BALB/c, имеющие генетически детерминированный фенотипы М1 и М2 соответственно [13]. Макрофаги выделяли и культивировали по общепринятым методикам [14]. Закисления культуральной среды достигали с помощью повышения концентрации СО2 в инкубаторе с 5% до 20% на 12 ч. В этих условиях показатель рН снижался с нейтральных значений до 5,5. После этого макрофаги стимулировали липополисахаридом — ЛПС (500 нг/мл, 24 ч). Фенотип макрофагов определяли по продукции оксида азота (NO) [5, 15], которую оценивали по содержанию в среде конечных метаболитов NO — нитритов. Концентрацию нитритов определяли с помощью реактива Грис-са [16] и измерения оптической плотности при 540 нм на микропланшетном ридере (BioRad, США). О приобретении макрофагами фенотипа М1 свидетельствовало увеличение, а фенотипа М2 — уменьшение продукции NO [6].
Таблица 1. Уровень экспрессии (в %) поверхностно-клеточных маркеров фенотипа на альвеолярных макрофагах пациентов с БА, ГЭРБ и их сочетанием (М ± т)
Группа Число пациентов Маркеры фенотипа М1 Маркеры фенотипа М2
CD80 CD25 CD163 CD206
БА (ГКС+) 8 4,16 ± 0,66** 23,77 ± 1,65 45,93 ± 2,16** 62,85 ± 2,13**
БА (ГКС-) 8 5,03 ± 0,64** 20,68 + 1,59* 50,43 ± 2,93** 65,98 ± 2,77**
БА (ГКС+) + ГЭРБ 8 8,06 ± 0,89**** 25,78 ± 2,92 41,50 ± 4,43 50,64 ± 5,38*
ГЭРБ 8 15,22 ± 1,70** 30,72 ± 3,24 27,57 ± 3,67** 38,85 ± 4,68**
Примечание. Достоверность различий с показателями в группе БА (ГКС+): * — p < 0,05; p < 0,05; ** — p < 0,01.
- p < 0,01; в группе ГЭРБ:
Для оценки фенотипической пластичности нами была разработана методика, которая позволяет количественно оценить способность макрофагов менять свой фенотип при действии факторов репрограммирования в сторону М1 (ФРМ1) и в сторону М2 (ФРМ2). В качестве ФРМ1 использовали пониженные концентрации фетальной сыворотки быка — fetal bovine serum — FBS (0% FBS), а в качестве ФРМ2 — повышенные (40% FBS). Нормальная концентрация FBS (10%) была обозначена как ФРМ0. Взвесь макрофагов размещали в лунки 48-луночных культуральных планшетов по 0,5 млн клеток на лунку в 0,5 мл среды RPMI 1640 с 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина и культивировали или при нормальной концентрации FBS (10%), или при 0% FBS с целью программирования макрофагов на фенотип М1, или при 40% FBS с целью программирования макрофагов на фенотип М2. Через 12 ч для активации макрофагов добавляли ЛПС (500 нг/мл, 24 ч). После завершения стимуляции с ЛПС определяли фенотип макрофагов с помощью CD-маркеров. Дополнительно с помощью световой микроскопии подсчитывали количество макрофагов, имеющих округлую форму, типичную для фенотипа М1, и распластанную фибробластоподоб-ную форму, характерную для фенотипа М2 [4], среди 100 клеток, подсчитанных в 5 полях зрения лунки.
Фенотипическую пластичность макрофагов отражали следующие показатели:
• фенотипическая пластичность в сторону М1 (ФП-М1), т. е. способность макрофагов менять свой фенотип с исходного в сторону М1. ФП-М1 выражали как процент изменения маркеров фенотипа М1 при действии ФРМ1 (0% FBS);
• фенотипическая пластичность в сторону М2 (ФП-М2), т. е. способность макрофагов менять свой фенотип с исходного в сторону М2, как процент изменения маркеров фенотипа М2 при действии ФРМ2 (40% FBS);
• суммарная фенотипическая пластичность М1 (ФП-С-М1), т. е. суммарный диапазон изменений (в процентах) маркеров фенотипа М1 от исходного при действии ФРМ1 и ФРМ2;
• суммарная фенотипическая пластичность М2 (ФП-С-М2), т. е. суммарный диапазон изменений (в процентах) маркеров фенотипа М2 от исходного при действии ФРМ1 и ФРМ2. Значения маркеров, полученные при культивировании с 10% FBS (ФРм0) принимали за 100%.
Статистический анализ проводили с помощью программы Statistica 8.0 (Statsoft). Данные представлены как средние значения полученных показателей (М) и ошибка среднего (± m). Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.
Результаты и обсуждение
При определении исходного фенотипа альвеолярных макрофагов мы обнаружили, что у пациентов с БА, ГЭРБ и их сочетанием присутствуют макрофаги как провоспалительного фенотипа М1, так и противовоспалительного фенотипа М2. При этом у пациентов с БА в стадии ремиссии, как получавших [БА (ГКС+)], так и не получавших стероидную терапию [БА (ГКС-)], большая
часть макрофагов имела преимущественно фенотип М2 (табл. 1). Эти группы по количеству СБ-маркеров фенотипов М1 и М2 практически не различались. У пациентов с ГЭРБ и пациентов с сочетанной патологией [БА (ГКС+) + ГЭРБ] процент макрофагов, имеющих СБ-маркеры фенотипа М2, был ниже, а фенотипа М1 — выше, чем у пациентов с БА (см. табл. 1).
Таким образом, при БА альвеолярные макрофаги имеют преимущественно противовоспалительный фенотип М2, а при ГЭРБ — преимущественно провоспа-лительный фенотип М1 и, что самое важное, при сочетании ГЭРБ и БА по сравнению с БА происходит достоверное увеличение популяции макрофагов фенотипа М1 и уменьшение — фенотипа М2.
В табл. 2 представлены данные о влиянии закисле-ния среды на фенотип макрофагов. Видно, что снижение значения рН микроокружения макрофагов приводит к существенному увеличению продукции N0, функционального маркера фенотипа М1 [5, 15]. Так, в кислой среде по сравнению с нейтральной базальная и ЛПС-стимулированная продукция N0 макрофагами мышей линии С57/ВБ6 была увеличена в 2 и 1,5 раза соответственно. В макрофагах мышей линии ВЛБВ/о также наблюдалось увеличение продукции N0 в кислой среде, но по сравнению с макрофагами мышей линии С57/ВБ6 это увеличение было выражено меньше.
Таким образом, кислая среда способствует изменению фенотипа макрофагов в сторону провоспалительного фенотипа М1.
Перед проведением оценки фенотипической пластичности макрофагов мы определили, какие из СБ-маркеров наиболее длительно фиксируют исходное состояние фенотипа при переносе макрофагов в условия культуры клеток. При сравнении исходного фенотипического профиля альвеолярных макрофагов сразу после их выделения из БАЛЖ и через 36 ч культивирования клеток (рис. 1) можно отметить несколько интересных фактов.
Во-первых, видно, что длительное культивирование приводит к увеличению количества провоспалительных
Таблица 2. Влияние закисления культуральной среды на ЫО-продуцирующую активность макрофагов мышей линий С57/Виб и ВДиВ/с (М ± т)
Группа эксперимента Продукция NO (по нитритам в культуральной среде, мкМ) макрофагами мышей линии
С57/Б1.6 BALB/c
Контроль 6,2 ± 0,1 6,8 ± 0,2
Контроль + ЛПС 20,2 ± 0,1 17,6 ± 0,7
Ацидоз 12,3 ± 0,2** 9,9 ± 0,4*
Ацидоз + ЛПС 30,2 ± 0,7** 24,2 ± 1,2*
Примечание. Достоверность различий: *# — р < 0,01; **## — р < 0,001. * — между показателями в группах «контроль» и «ацидоз»; # — между показателями в группах «контроль + ЛПС» и «ацидоз + ЛПС».
#
**
70 -т
60-
50-
40-
30-
20-
10-
й
т
СР80 СР25 Маркеры М1
I
I
I
С0163 С0206 Маркеры М2
II
I
й
СР80 СЭ25 Маркеры М1
I
С0163 СР206 Маркеры М2
БА(ГКС-)
БА(ГКС+)
П
БА(ГКС+) и ГЭРБ
ГЭРБ
Рис. 1. Сравнение исходного содержания Ой-маркеров фенотипа на альвеолярных макрофагах пациентов сразу после выделения из БАЛЖ (I) и через 36 ч культивирования (II).
Здесь и на рис. 2: БА (ГКС-) — больные с БА, не использующие ГКС; БА (ГКС+) — больные с БА, использующие ГКС; БА (ГКС+) + ГЭРБ — больные с сочетанием БА, использующие ГКС, и ГЭРБ; ГЭРБ — больные с ГЭРБ.
макрофагов фенотипа М1 и уменьшению — противовоспалительных макрофагов фенотипа М2 во всех группах и на примере всех СБ-маркеров.
Во-вторых, после 36-часового культивирования макрофагов в нормальных условиях на преобладание фенотипа М1 этих клеток у больных ГЭРБ по сравнению с пациентами с БА и БА в сочетании с ГЭРБ (как это было сразу после выделения макрофагов) указывал только маркер СБ80 и не указывал СБ25, а на преобладание фенотипа М2 при БА по сравнению с группами с сочетанной патологией и с ГЭРБ (как это было сразу после выделения макрофагов) указывал только маркер СБ206 и не указывал СБ163 (см. рис. 1). Эти данные позволяют рассматривать маркер М1 СБ80 и маркер М2 СБ206 в качестве индикаторов, которые способны дольше фиксировать исходное состояние фенотипа макрофагов при изменении окружающих условий по сравнению с маркером М1 СБ25 и маркером М2 СБ163. В связи с этим для определения фенотипической пластичности макрофагов в условиях культуры клеток мы использовали именно маркеры СБ80 и СБ206.
Фенотипическую принадлежность культивированных макрофагов определяли также и по форме клеток. При анализе изменения содержания макрофагов М1, имеющих округлую форму, установлено, что в нормальных условиях культуры клеток количество макрофагов М1 в группе ГЭРБ составляло 79,0 ± 2,1% и было достоверно больше, чем в группах БА (ГКС+) (67,1 ± 1,4%; р < 0,01) и БА (ГКС+) + ГЭРБ (65,6 ± 2,7%; р < 0,05). Эти данные соответствуют различиям фенотипов макрофагов в группах больных, полученным при исходном определении фенотипа с помощью СБ-маркеров сразу после выделения макрофагов из БАЛЖ (см. табл. 1). Таким образом, морфологический маркер (форма клеток) также может быть использован при оценке фенотипиче-ской пластичности в условиях культуры клеток.
Данные, представленные на рис. 2, позволяют провести сравнительный анализ фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов пациентов групп БА (ГКС-), БА (ГКС+), БА (ГКС+) + ГЭРБ и ГЭРБ и выделить несколько важных закономерностей.
♦ При использовании маркера фенотипа М1 СБ80 и соответственно оценке суммарной фенотипической пла-
стичности фенотипа М1 (ФП-С-М1) обнаружилось, что максимальную ФП-С-М1 имеют макрофаги при ГЭРБ — 53%, минимальную — при БА (ГКС+) + ГЭРБ — 31%, а при БА (ГКС-) и при БА (ГКС+) — примерно одинаковую — 41 и 45% соответственно (см. рис. 2, а).
♦ При использовании маркера фенотипа М2 СБ206 и соответственно оценке суммарной фенотипической пластичности фенотипа М2 (ФП-С-М2) оказалось, что максимальную ФП-С-М2 имеют макрофаги при ГЭРБ — 88%, минимальную — при БА (ГКС+) — 32%, а при БА (ГКС-) и БА (ГКС+) + ГЭРБ — 78 и 55% соответственно (см. рис. 2, б).
♦ При использовании формы клеток в качестве маркера фенотипа и соответственно оценке морфологической суммарной фенотипической пластичности (ФП-С-Мрф) выяснилось, что максимальную ФП-С-Мрф имеют макрофаги при БА (ГКС+) — 42%, минимальную — при БА (ГКС+) + ГЭРБ — 18%, а при БА (ГКС-) и ГЭРБ — 34 и 21% соответственно (см. рис. 2, в).
♦ При сравнении способности макрофагов менять свой фенотип в сторону М1 (ФП-М1) при действии ФРМ1 (0% ББ80) при разных заболеваниях мы использовали в качестве основного устойчивый маркер фенотипа М1 СБ80, а маркер фенотипа М2 СБ206 и форму клеток — в качестве дополнительных маркеров. Выяснилось, что при оценке с помощью СБ80 макрофаги пациентов из групп БА (ГКС-) и ГЭРБ имели примерно одинаковую ФП-М1 — 24 и 20% соответственно. У больных из групп БА (ГКС+) и БА (ГКС+) + ГЭРБ макрофаги также имели примерно одинаковую, но отрицательно инвертированную ФП-М1: -34 и -31% соответственно (см. рис. 2, а). Иными словами, макрофаги при БА (ГКС+) и БА (ГКС+) + ГЭРБ у пациентов в ответ на действие факторов, которые обычно программируют макрофаги на провоспалительный фенотип М1, программировались на противовоспалительный фенотип М2. При оценке с помощью маркера фенотипа М2 СБ206 и морфологического маркера фенотипа М1 (круглые клетки) феномен инверсии ФП-М1 в макрофагах больных при БА (ГКС+) и БА (ГКС+) + ГЭРБ полностью подтвердился (см. рис. 2, б, в).
♦ При сравнении способности макрофагов менять свой фенотип в сторону М2 (ФП-М2) при действии ФРМ2 (40% ББ8) при разных заболеваниях мы использовали в качестве основного устойчивый маркер фенотипа М2 СБ206, а маркер фенотипа М1 СБ80 и форму клеток — в качестве дополнительных. При использовании СБ206 оказалось, что максимальной ФП-М2 обладали макрофаги больных ГЭРБ — 63%; существенно ниже ФП-М2 была у пациентов при БА (ГКС-) и БА (ГКС+) + ГЭРБ — 41 и 30% соответственно, а при БА (ГКС+) ФП-М2 была отрицательно инвертированной: -12% (см. рис. 2, б). Иными словами, у больных из группы БА (ГКС+) макрофаги в ответ на действие ФРМ2 приобретали фенотип М1, а не М2, как макрофаги пациентов из других групп. При использовании маркера фенотипа М1 СБ80 и морфологического маркера фенотипа М1 (круглые клетки) феномен инверсии ФП-М2 в макрофагах больных при БА (ГКС+) подтвердился (см. рис. 2, б, в).
Данные, представленные на рис. 2, позволяют выделить признаки, характерные для сочетанной патологии. Во-первых, наличие у пациента с ГЭРБ и БА приводит к уменьшению суммарной пластичности фенотипа М1
(ФП-С-М1) с 45 до 31% (см. рис. 2, а), уменьшению ФП-С-Мрф с 42 до 18% (см. рис. 2, в) и ФП-С-М2 с 32 до 55% (см. рис. 2, б). Во-вторых, присоединение ГЭРБ практически не влияло на инвертированную в группе БА (ГКС+) ФП-М1 (см. рис. 2, а), но существенно увеличивало ФП-М2 (см. рис. 2, б).
Данные, представленные на рис. 2, позволяют обнаружить еще один очень интересный факт. Несмотря на то что ГКС не влияли на фенотип альвеолярных макрофагов при БА (см. табл. 1), они вызывали инверсию всех видов пластичности: фенотипической М1 (см. рис. 2, а), фенотипической М2 (см. рис. 2, б) и морфологической (см. рис. 2, в). При этом стероиды практически не влияли на ФП-С-М1 (см. рис. 2, а, в), но более чем в 2 раза уменьшали ФП-М2 (см. рис. 2, б).
По данным литературы, у здоровых лиц экспрессия маркера фенотипа М1 CD80 составляет от 1,4 ± 1,2% [17] до 3,5 ± 0,9% [18], а маркеров фенотипа М2 CD163 и CD206 — 21,1 ± 4,1 и 43,5 ± 9,8% соответственно [19]. При сравнении этих данных с нашими результатами (см. табл. 1) становится очевидным, что в группах БА (ГКС+) и БА (ГКС-) количество макрофагов фенотипа М1 достоверно не отличается от показателей в контроле, тогда как в группах ГЭРБ и БА (ГКС+) + ГЭРБ количество макрофагов фенотипа М1 значительно превышает таковое в контроле. При этом видно, что присоединение ГЭРБ достоверно смещает фенотип макрофагов у пациентов с БА в сторону провоспалительного фенотипа М1 (см. табл. 1). Дальнейшее сопоставление с показателями в контроле показывает, что при БА (ГКС+) и БА (ГКС-) количество альвеолярных макрофагов фенотипа М2 достоверно увеличено, при наличии одной только ГЭРБ не отличается, а при сочетанной патологии — БА (ГКС+) + ГЭРБ — увеличено по маркеру CD163 и не отличается по CD206. Анализ фенотипа альвеолярных макрофагов больных БА показал также (см. табл. 1), что стероидная терапия не оказывает существенного влияния на противовоспалительны фенотип М2 макрофагов у этой категории пациентов.
В совокупности эти данные соответствуют представлениям о том, что при ГЭРБ иммунный ответ развивается по TM-типу [20], при БА — по ^2-типу [21], а присоединение ГЭРБ к БА смещает иммунный ответ в сторону Th1 [22]. Наши данные указывают на причину развития TM-ответа при ГЭРБ. Очевидно, это обусловлено тем, что при этом заболевании макрофаги имеют преимущественно фенотип М1, который запускает Th1-ответ [4, 5, 20]. При БА макрофаги в основном имеют фенотип М2, который запускает ^2-ответ [4, 5, 21]. Мы также можем предположить, что более тяжелый характер течения БА при ее сочетании с ГЭРБ обусловлен сдвигом фенотипа макрофагов в сторону провоспали-тельного фенотипа М1 и соответственно усилением воспаления. Усиление воспалительного процесса в легких действительно характерно для обострения БА [22].
В связи с этим возникает еще один резонный вопрос: почему при БА макрофаги приобретают противовоспалительный фенотип М2, а при ГЭРБ и сочетании БА с ГЭРБ увеличивается количество провоспалительных макрофагов фенотипа М1?
Есть основания думать, что при развитии БА формированию фенотипа М2 альвеолярных макрофагов могут способствовать разнообразные аллергены [21], цитоки-ны — интерлейкины (IL) 4 и 13, иммунокомплексы с IL-1ß, IL-10, трансформирующий фактор роста ß, внутриклеточные патогены (Coxiella burnetii, Leishmania) и глюкокортикоиды [4]. При развитии ГЭРБ и особенно в случае сочетания ГЭРБ и БА, по нашему мнению, есть фактор, который играет особенно важную роль в репро-граммировании альвеолярных макрофагов на воспалительный фенотип М1, — это снижение значения рН в микроокружении макрофагов, которое возникает при
60
40-
20
-20-40-
БА(ГКС-) БА(ГКС+) БА(ГКС+) и ГЭРБ ГЭРБ И ФП-М1 Ш ФП-М2 [==| ФП-С-М1
88
63
32
20
-12
БА(ГКС-) БА(ГКС+) БА(ГКС+) и ГЭРБ ГЭРБ И ФП-М1 ЕШ ФП-М2 |=Э ФП-С-М2
40 -
20-
-15
-1
-20J "14
БА(ГКС-) БА(ГКС+) БА(ГКС+) и ГЭРБ ГЭРБ
Щ ФП-М1
ФП-М2
ФП-С-мрф
Рис. 2. Сравнительный анализ фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов больных с БА, больных с ГЭРБ и больных с сочетанием этих двух заболеваний.
а — содержание, маркера фенотипа М1 CD80; б — содержание, маркера фенотипа М2 CD206; в — содержание макрофагов округлой формы, маркера фенотипа М1. Объяснения в тексте.
микроаспирации кислого содержимого из желудка [2]. Экспериментальные данные о возможной репрограмми-рующей роли снижения значения рН в микроокружении макрофагов были получены M. Crowther и соавт. [8], A. Thomas и соавт. [22] и C. Cheng и соавт. [23]. В настоящей работе мы впервые показали, что закисление среды само по себе, без влияния на какие-либо компо-
ненты бронхоальвеолярной жидкости — БАЛЖ (в куль-туральной среде их нет), смещает фенотип макрофагов в сторону провоспалительного М1, т. е. воспроизводит ситуацию, характерную для ГЭРБ.
Это позволяет сделать вывод, что микроаспирация кислого желудочного содержимого в легкие и соответственно снижение значения рН являются реальными патогенетическими факторами провоспалительного трансформирования фенотипа макрофагов.
При проведении фенотипирования макрофагов возникает еще один интересный вопрос: почему популяция макрофагов, полученная от одного больного, из одной порции БАЛЖ, является гетерогенной, т. е. содержит фенотипы как М1, так и М2, а не является монофено-типической? Отвечая на этот вопрос, можно предположить следующие причины.
Во-первых, микроокружение альвеолярных макрофагов, которое определяет фенотип этих клеток, в разных участках бронхоальвеолярного дерева все же различается, и этому действительно есть подтверждение [24]. Во-вторых, в процессе выполнения своих функций макрофаг постоянно меняет свой фенотип (фенотипи-ческий континуум) [25]. С учетом этого становится понятно, что, смывая БАЛЖ, мы получаем разные группы макрофагов на разных стадиях фенотипической диффе-ренцировки. И наконец, в-третьих, мы обратили внимание на то, что в условиях культуры клеток те макрофаги, которые находятся в кластерах, имеют округлую форму, т. е. имеют фенотип М1, тогда как изолированно сидящие на пластике макрофаги имеют расплющенную форму, т. е. имеют фенотип М2 (рис. 3, см. вклейку). Не исключено, что межклеточные контакты могут играть роль в приобретении макрофагом того или иного фенотипа. Можно предположить, что в легких макрофаги также имеют разный характер расселения: одиночный или групповой, и тогда гетерогенность фенотипа макрофагов может быть обусловлена и этим фактором.
Не исключено, что разный характер морфологических изменений в легких при развитии БА и ГЭРБ может определять специфические особенности расселения макрофагов, что также способно вносить вклад в вариантность трансформации фенотипа макрофагов при этих заболеваниях. Действительно, анализ работ P. Bitterman и соавт. [26], D. Campbell и соавт. [27], F. Krombach и соавт. [28], A. Pforte и соавт. показывает, что при различных видах патологии легких происходит существенное изменение расселения альвеолярных макрофагов.
При анализе фенотипической пластичности макрофагов мы обнаружили, что разные маркеры фенотипа дают неодинаковую картину сопоставления этого процесса при БА, ГЭРБ и при сочетании этих заболеваний. Это означает, что фенотипическую пластичность необходимо рассматривать специфически по отношению к конкретному показателю: например, по СD оценивать рецепторную пластичность, по форме клеток — морфологическую, а по продукции NO — функциональную. В настоящей работе мы установили несколько интересных фактов об изменении фенотипической пластичности макрофагов при БА, ГЭРБ и их сочетании.
♦ Максимальной суммарной способностью менять свой фенотип М1 (ФП-С-М1) обладают макрофаги при ГЭРБ, а минимальной — при сочетанной патологии БА (ГКС+) + ГЭРБ. Это означает, что присоединение ГЭРБ к БА (ГКС+) уменьшает диапазон, в пределах которого макрофаги могут менять свой фенотип М1 (см. рис. 2, а), т. е. они становятся более «ригидными».
♦ Максимальной суммарной способностью менять свой фенотип М2 (ФП-С-М2) обладают макрофаги при ГЭРБ, а минимальной — при БА (ГКС+). Присоединение ГЭРБ к БА увеличивает диапазон, в пределах которого макрофаги могут менять свой фенотип М2 (см. рис. 2, б).
♦ Суммарная морфологическая пластичность макрофагов (ФП-С-Мрф) была максимальной в группе БА (ГКС+), а минимальной — в группе ГЭРБ. Присоединение ГЭРБ к БА существенно снижает этот показатель (см. рис. 2, в). Таким образом, ГЭРБ способствует развитию морфологической «ригидности» макрофагов. Морфологическую пластичность клеток определяет активность специфических протеинкиназ, которые контролируют скорость синтеза и распада миофиламентов и микротрубочек цитоскелета [29]. Можно предположить, что ГЭРБ формирует в легких условия, которые каким-то образом ограничивают эти процессы.
♦ Способность макрофагов менять свой фенотип с исходного в сторону М1 (ФП-М1) при действии ФРМ1 (0% БВ8) оказалась прямо противоположной у больных БА (ГКС+) и ГЭРБ: макрофаги больных в группе БА (ГКС+) реагировали на действие ФРМ1 существенным уменьшением маркера фенотипа М1, а макрофаги больных ГЭРБ — его увеличением. В группе ГЭРБ с БА (ГКС+) инвертированная реакция ФП-М1, характерная для макрофагов пациентов с БА (ГКС+), практически оставалась без изменений (см. рис. 2, а).
♦ Способность макрофагов менять свой фенотип с исходного в сторону М2 (ФП-М2) при действии ФРМ2 (40% БВ8) также оказалась прямо противоположной у пациентов из групп БА (ГКС+) и ГЭРБ: макрофаги больных БА (ГКС+) в ответ на действие ФРМ2 реагировали уменьшением маркера фенотипа М2, а макрофаги лиц из группы ГЭРБ — его увеличением. У пациентов из групп ГЭРБ и БА (ГКС+) происходило обратное инвертирование и существенное увеличение способности макрофагов менять свой фенотип с исходного в сторону М2 (ФП-М2) при действии ФРМ2.
Обнаруженные нами существенные изменения фе-нотипической пластичности альвеолярных макрофагов при БА, ГЭРБ и их сочетании, очевидно, характеризуют иммунологическую составляющую в патогенезе этих заболеваний и их осложнений. Уже сейчас становится ясно, что оценка фенотипа и фенотипической пластичности иммунных клеток в клинике может иметь большое значение. Способность иммунных клеток быстро менять свой фенотип играет ключевую роль в адекватном «терапевтическом» развитии иммунного ответа. Не исключено, что патологическое уменьшение пластичности, когда макрофаги теряют способность изменять свой фенотип на противовоспалительный М2, вносит определенный вклад в развитие воспалительных заболеваний. Таким образом, оценка фенотипа макрофагов и их пластичности может иметь диагностическое и прогностическое значение.
Кроме того, определение фенотипической пластичности может показать, каковы резервы для коррекции патологического фенотипа иммунных клеток. Например, уже много лет при лечении легочных заболеваний используют ГКС (преднизолон). Показано, что предни-золон способен репрограммировать макрофаги в сторону противовоспалительного фенотипа М2 [30] и этим может быть обусловлен его терапевтический эффект. Вместе с тем известно также, что у некоторых больных терапия ГКС бывает неэффективной. Нельзя исключить, что это связано с тем, что макрофаги таких пациентов теряют способность изменять свой фенотип в сторону М2, т. е. у них нарушена фенотипическая пластичность. В этом случае предварительное определение фенотипической пластичности макрофагов способно помочь в выборе адекватной терапии. В наших исследованиях стероидная терапия не оказывала заметного влияния на фенотип макрофагов больных БА (см. табл. 1). Мы предполагаем, что это связано с тем, что макрофаги этих пациентов уже исходно имели выраженный фенотип М2
и на этом фоне М2-трансформирующий эффект ГКС не проявился.
Особого внимания заслуживает обнаруженный нами феномен инверсии фенотипической пластичности макрофагов у больных БА на фоне стероидной терапии (см. рис. 2), однако мы пока не готовы его обсуждать в рамках настоящей публикации. Очевидно, что прежде необходимо хорошо изучить, какие репрограммирующие факторы могут взаимодействовать с ГКС-зависимыми внутриклеточными сигнальными путями, которые контролируют активность генов, определяющих фенотипы М1 и М2 макрофагов.
В целом полученные нами результаты позволяют понять патогенетические иммунные механизмы возникновения или усиления бронхолегочной патологии у больных ГЭРБ. Наши данные показывают, что определение фенотипа макрофагов и их фенотипической пластичности может иметь диагностическое значение, а также быть основой для выбора лекарственной терапии и оценки ее эффективности.
Работа поддержана грантами ФЦП «Научные кадры инновационной России»ГК№П811 иГК 16.740.11.0007
Сведения об авторах:
ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздрава России
Маев Игорь Вениаминович — д-р мед. наук, проф., чл.-кор. РАМН, зав каф. пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии. Лямина Светлана Владимировна — канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. клеточных биотехнологий.
Калиш Сергей Валерьевич — лаборант каф. патологической физиологии леч. фак-та; аспирант ГОУ ВПО «Владимирский государственный университет им. А. Г. и Н Г. Столетовых».
Малышева Елена Васильевна — д-р мед. наук, проф. каф. патологической физиологии леч. фак-та. Юренев Георгий Леонидович — д-р мед. наук, проф. каф. пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии. Малышев Игорь Юрьевич — д-р мед- наук, проф., зав. каф. патологической физиологии леч. фак-та; зав. лаб. клеточных биотехнологий НИМСИ; зав. лаб. стресса и адаптации ГБУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН; e-mail: iymalyshev1@gmail.com
ЛИТЕРАТУРА
1. Корабельников Д.И., Чучалин А.Г. Бронхиальная астма и сопутствующие заболевания органов пищеварения. Пульмонология. 2002; 5: 87—92.
2. Маев И.В., Юренев Г.Л., Бурков С.Г., Сергеева Т.А. Бронхо-легочные и орофарингеальные проявления гастроэзофагеальной рефлюксной болезни. Consilium Medicum. 2006; 2: 22—7.
3. Barbas A.S., Downing T.E., Balsara K.R. et al. Chronic aspiration in a murine model of asthma. Chronic aspiration shifts the immune response from Th1 to Th2 in a murine model of asthma. Eur. J. Clin. Invest. 2008; 38: 596—602.
4. Martinez F.O., Sica A., Mantovani A., Locati M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 2008; 1 (13): 453—61.
5. Mantovani A., Sica A., Sozzani S. et al. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends in Immunol. 2004; 25 (12): 677—86.
6. Mantovani A., Sica A., Locatti A. New vistas on macrophage differentiation and activation. Eur. J. Immunol. 2006; 37 (1): 14—6.
7. Lensmar C., Katchar K., Eklund A. et al. Phenotypic analysis of alveolar macrophages and lymphocytes following allergen inhalation by atopic subjects with mild asthma. Respir. Med. 2006; 100 (5): 918—25.
8. Crowther M., Brown N,J., Bishop E.T., Lewis C.E. Microenviron-mental influence on macrophage regulation of angiogenesis in wounds and malignant tumors. J. Leukoc. Biol. 2001; 70 (4): 478—90.
9. Gow A.J., Guo C. Surfactant protein-D regulates alveolar macrophage phenotype. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2011; 183: A1085.
10. Лямина С. В., Круглов С. В., Веденикин Т.Ю., Малыхшев И.Ю. Новая стратегия управления иммунным ответом при заболеваниях легких — роль сурфактантного белка D как бивалентного фактора репрограммирования макрофагов. Фундаментальные исследования. 2011; 1: 90—8.
11. Thum T., Erpenbeck V.J., Moeller J. et al. Expression of xenobiot-ic metabolizing enzymes in different lung compartments of smokers and non-smokers. Environ. Hlth Perspect. 2006; 114 (11): 1655—61.
12. Orosi Р., Nugent К. Studies of phagocytic and killing activities of alveolar macrophages in patients with sarcoidosis. Lung. 1993; 171 (4): 225—33.
13. Mills C.D., Kincaid К., Alt J.M. et al. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J. Immunol. 2000; 164: 6166—73.
14. Клаус Дж., ред. Лимфоциты: методы. М.: Мир; 1990.
15. Gordon S. Alternative activation of macrophages. Nature Rev. Immunol. 2003; 3: 23—35.
16. Griess P. Bemerkungen zu der Abhandlung der HH. Weselky und Benedikt Ueber einige Azoverbindungen. Ber. Dtsch. chem. Ges. 1879; 12 (1): 426—8.
17. Burastero S.E., Magnani Z., Confetti C. et al. Increased expression of the CD80 accessory molecule by alveolar macrophages in asthmatic subjects and its functional involvement in allergen presentation to autologous TH2 lymphocytes. J. Allergy Clin. Immunol. 1999; 103 (6): 1136—42.
18. Nicod L.P., Isler P. Alveolar macrophages in sarcoidosis coexpress high levels of CD86 (B7.2), CD40, and CD30L. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1997; 17 (1): 91—6.
19. Taylor A.E., Finney-Hayward T.K., Quint J.K. et al. Defective macrophage phagocytosis of bacteria in COPD. Eur. Respir. J. 2010; 35 (5): 1039—47.
20. Козлова И.В., Липатова Т.Е., Шуман Мохамад Али Трад. Нарушения иммунного гомеостаза при гастроэзофагеальной рефлюксной болезни и пищеводе Баррета. Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. 2006; 2: 27—31.
21. Barnes P.J. Th2 cytokines and asthma: an introduction. Respir. Res. 2001; 2 (2): 64—5.
22. Thomas A.D., Su K.-Y., Chang J.-C. et al. Gastroesophageal reflux-associated aspiration alters the immune response in asthma. Surg. Endoscopy. 2010; 24 (5): 1066—70.
23. Cheng C.M., Hsieh C.C., Lin C.S. et al. Macrophage activation by gastric fluid suggests MMP involvement in aspiration-induced lung disease. Immunobiology. 2009; 215 (3): 173—81.
24. Drent M., Mulder P.G.H., Wagenaar Sj.Sc. et al. Differences in BAL fluid variables in interstitial lung diseases evaluated by discriminant analysis. Eur. Respir. J. 1993; 6: 803—10.
25. Грачев А.Н. Гетерогенность и функциональная пластичность макрофагов второго типа активации: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М; 2008.
26. Bitterman P.B., Saltzman L.E., Adelberg S. et al. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononu-clear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J. Clin. Invest. 1984; 74 (2): 460—9.
27. Campbell D.A., Poulter L.W., Du Bois R.M. Phenotypic analysis of alveolar macrophages in normal subjects and in patients with interstitial lung disease. Thorax. 1986; 41 (6): 429—34.
28. Krombach F., Gerlach J.T., Padovan C. et al. Characterization and quantification of alveolar monocyte-like cells in human chronic inflammatory lung disease. Eur. Respir. J. 1996; 9 (5): 984—91.
29. Pollard T.D., Earnshaw W.C. Cell biology. 2-nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2008.
30. Ikezumi Y., Suzuki T., Karasawa T. et al. Contrasting effects of steroids and mizoribine on macrophage activation and glomerular lesions in rat Thy-1 mesangial proliferative glomerulonephritis. Am. J. Nephrol. 2010; 31: 273—82.
Поступила 23.05.12
К ст. Е. Л. Танащук исоавт.
Рис. 1. ПЭТ-сканограммы больнойШ.
Стрелками указаны области накопления 18Г-ФДГ (вос- ► паление стенки аорты и ее ветвей).
Рис. 2. ПЭТ-сканограммы больной Ш. после отмены иммуно-супрессивной терапии ПЗ и через 33 мес противовирусной терапии энтекавиром. ▼
Г *э
\ 5г
' ш
К ст. И. А. Шамова
Подкожное образование у нижнего угла лопатки, ближе к подмышечной области у больного П.
К ст. И. В. Маева и соавт.
Рис. 3. Репрезентативные фотографии культивируемых макрофагов.
а — округлая форма, характерная для фенотипа М1; б — расплющенная форма, характерная, для фенотипа М2.
