CC BY
34
Biotechnologies - for the medicine of the future •
Джаруллаева Алина Шахмировна - научный сотрудник, лаборатории клеточной микробиологии НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18; Тел.: 7(499) 190-76-11; e-mail alina-dzharullaeva@ya.ru);
Ерохова Алина Сергеевна - младший научный сотрудник, лаборатории клеточной микробиологии ФГБУ «НЩЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18; Тел.: 7(499) 190-76-11; e-mail erohova.alina95@gmail.com);
Беседнова Наталия Николаевна - академик РАН, доктор медицинских наук, главный научный сотрудник, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова (690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1; Тел.: 8(423) 244-14-38; e-mail: besednoff_lev@mail.ru);
Звягинцева Татьяна Николаевна - доктор химических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН (690022, г. Владивосток, ул. Пр. 100-лет Владивостоку, 159; Тел.: 8(423) 231-07-05, e-mail: zvyag@piboc.dvo.ru).
© Коллектив авторов, 2018 г DOI: 10.5281/zenodo.1488034
Удк 57.088
РВ. Ромашко12, А.М. Захаренко2, Т.А. Ефимов1, Б.Г. Андрюков3
функционализация поверхности биосенсора на основе кремниевого кантилевера для детектирования концентрации биологических молекул
1 Институт автоматики и процессов управления (ИАПУ) Дальневосточного отделения российской академии наук (ДВО РАН), Владивосток
2 Дальневосточный федеральный университет (ДВФУ), Владивосток
3 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (НИИЭМ) имени Г.П. Сомова, Владивосток
В настоящей работе представлен метод функционализации кремниевого кантилевера, который может быть использован для создания биосенсора для измерения концентрации биологических молекул в жидких средах. Чувствительность биосенсора к биологическим молекулам достигается за счет присоединения к поверхности кантилевера слоя молекул БСА (бычий сывороточный альбумин), для закрепления которых на кантилевер наносится слой золота и активируется раствором NHS-EDC (N-гидроксисукцинимид + 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид). Связывание молекул, с кантилевером приводит к изменению его резонансной частоты. По изменению резонансной часты определяется масса присоединенных молекул и концентрация молекул в исследуемом растворе.
Ключевые слова: биосенсор, кантилевер, адаптивный интерферометр, биомолекулы. Для цитирования: Ромашко Р.В., Захаренко А.М., ЕфимовТ.А., Андрюков Б.Г. Функционализация поверхности биосенсора на основе кремниевого кантилевера для детектирования концентрации биологических молекул // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2018; 3: 33-35. DOI: 10.5281/zenodo.1488034.
Для корреспонденции: Ромашко Р.В., e-mail: romashko@iacp.dvo.ru.
Поступила 05.11.18
R.V. Romashko12, A.M. Zakharenko2, T.A. Efimov1, B.G. Andryukov3 FUNCTIONALIZATION OF THE SURFACE OF A BIOSENSOR BASED ON A SILICON CANTILEVER FOR DETECTING THE CONCENTRATION OF BIOLOGICAL MOLECULES
1 Institute of Automation and Control Processes (IACI) of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences (FEB RAS), Vladivostok, Russia
2 Far Eastern Federal University (FEFU), Vladivostok, Russia
3 Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology (RIEM), Vladivostok, Russia
In this paper, we present a method for the functionalization of a silicon cantilever, which can be used to create a sensor for measuring the concentration of biological molecules in liquid medium. A sensitive layer of the cantilever is BSA molecules (Bovine Serum Albumin), absorbed on gold layer deposited in vacuum. The gold layer was activated with a solution of NHS-EDC (N-hydroxysuccinimide + 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) previously. Binding of molecules with a cantilever leads to a change in its resonance frequency measured by an adaptive interferometer. The mass of the attached molecules and the concentration of the solution are determined by changing the resonance frequency.
Keywords: cantilever, biosensor, adaptive interferometer, biomolecules.
HEALTH. MEDICAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (75) - 2018 33
• Биотехнологии - медицине будущего
For citation: R.V. Romashko, A.M. Zakharenko, T.A. Efimov Health.Functionalization of micromechanical biosensor surface for detecting the concentration of biological molecules// Health. Medical ecology. Science. 2018; 3: 33-35 (in Russia). D01:10.5281/zenodo.1488034.
For correspondence: Romashko R.V., e-mail: romashko@iacp.dvo.ru.
Conflict of interests. The authors are declaring absence of conflict of interests.
Financing. The research is partially supported by Far-Eastern Branch of Russian Academy of Sciences (grant # 18-3-053).
Received 05.11.18 Accepted 25.11.18
Введение
Благодаря функционализации микромеханических осцилляторов - кантилеверов - осуществляется эффективное обнаружении комплементарных молекул материала путем оптимизации взаимодействия между молекулами в исследуемой среде и молекулами на поверхности кантилевера. При функционализации кан-тилевера необходимо учитывать несколько факторов. Прежде всего, присоединенные молекулы должны связываться с микромеханическим осциллятором так, чтобы в процессе колебаний осциллятора (кантилевера) не происходило их отсоединения. Во-вторых, молекулы, прикрепленные в результате функционализации, должны хорошо связываться с исследуемым веществом.
В настоящей работе для создания сенсора биологических молекул выполнена иммобилизация молекул БСА (bovine serum albumine, бычий сывороточный альбумин) на поверхности кремниевого кантилевера размером 225*43*7 мкм прямоугольной формы, с помощью метода ковалентной иммобилизации белков с посредством активации карбоксильных и аминогрупп смесью NHS-EDC [1, 2]. Слой BSA молекул обладает способностью присоединять широкий спектр белковых молекул за счет чего достигается чувствительность биосенсора к исследуемым молекулам. Кроме того, слой BSA молекул может быть использован как буфер (матрица) для других молекул в том числе антител, благодаря которым достигается специфичное детектирование исследуемых молекул [3, 4].
Функционализация кантилевера
Лишь немногие химические группы обеспечивают конъюгирование карбоновых кислот (-СООН) с белками. Наиболее широко используются карбодии-миды (органические соединения с общей формулой RN=C=NR): водорастворимый EDC (1-Этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимидили 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) и нерастворимый в воде DCC (N, N '-Dicyclohexylcarbodiimide).
EDC вступает в реакцию с карбоксильными группами с образованием активной O-ацилизомочевины, которая легко вытесняется нуклеофильной атакой из первичных аминогрупп в реакционной смеси. EDC сшивание наиболее эффективно в кислой среде (рН 4,5) и должно выполняться в средах, лишенных посторонних карбоксилов и аминов. Пара из EDC и
NHS (N-гидроксисукцинимид) карбоксилами, образует сложный эфир, который значительно более стабилен, чем O-ацилизомочевина. Способность сшивать первичные амины с карбоновыми кислотами с использованием EDC является мощным и универсальным инструментом для сшивания пептидов и белков, подготовки биосенсоров и иммобилизации макромолекул для применения во многих методах обнаружения и анализа белковых молекул [3, 5, 6].
Перед химической функционализацией кантилевер был очищен в ацетоне и этаноле после чего помещен в вакуумную камеру. В вакуумной камере с помощью источника ионов Ar+ с поверхности кантилевера был удален слой толщиной около 20 А и нанесена пленка золота толщиной 10 нм (чистота материала 99,99%, давление в камере 4*10-5, скорость осаждения 6 А/с, температура поверхности кантилевера во время осаждения 90°С), как показано на рис. 1. При выборе толщины золотой пленки, осаждаемой на кантилевер, учитывалось несколько факторов: во-первых, при осаждении пленки с толщиной менее 5 нм, на поверхности кантилевера не образуется неразрывного слоя, золото в этом случае золото осаждается «островками», вследствие чего поверхность кантилевера будет активирована не полностью и чувствительность сенсора будет заметно ниже; во-вторых, с увеличением толщины пленки, уменьшается частота колебаний и добротность кантилевера. Уменьшение добротности приводит к уменьшению точности определения частоты собственных колебаний кантилевера, что в свою очередь ухудшает метрологические характеристики сенсора в целом.
Таким образом толщина золотой пленки должна быть такая, чтобы сформировалась непрерывная пленка без разрывов, при этом сама пленка должна оказывать минимальное влияние на механические свойства кантилевера. Экспериментально установлено, что осаждения 7-15 нм золота на поверхность кантилевера достаточно для формирования пленки, удовлетворяющей указанным выше требованиям. После активации катилеверы помещались в проточную кюветус объемом 4 мл, которая заполнялась раствором Na2PO4 с концентрацией 0,013 М/мл и pH=8,6. Сама кювета устанавливалась в объектный пучок адаптивного интерферометра [4]. Пред измерением резонансной частоты в кювету было введено 2,5 мл раствора
34 ЗДОРОВЬЕ. МЕДИЦИНСКАЯ ЭКОЛОГИЯ. НАУКА 3 (75) - 2018
Biotechnologies - for the medicine of the future
BSA с концентрацией 5 мг/мл. Вследствие связывания молекул белка с активированной поверхностью кан-тилевера увеличивалась его масса, и, как следствие, уменьшалась его резонансная частота. В свою очередь,
резонансная частота измеряется с помощью адаптивного интерферометра. По сдвигу резонансной частоты численно рассчитывается изменение массы, присоединенной к кантилеверу [4, 7, 8].
0000000000 BOA ^ 000
Покрытие из золота ' 10 нм
Кантилевер i ¡ i 7 мкм г
Рис. 1. Расположение покрытия из золота и присоединенного слоя БСА (бычий сывороточный альбумин) на кремниевом кантилевере
Суммарное изменение массы кантилевера при времени экспозиции 30 минут составило 2,2±0,3 нг, что указывает на присоединение слоя молекул BSA толщиной ~14 мкм к активированной поверхности.
Заключение
Таким образом в настоящей работе предложен метод функционализации кремниевого кантилевера, который заключается в закреплении слоя молекул БСА на поверхности кремниевого кантилевера, покрытого золотом. Благодаря способности БСА-молекул присоединять широкий спектр белковых молекул, достигается чувствительность биосенсора к изменению концентрации этих молекул. Слой БСА молекул может быть использован используется как буфер для других молекул с целью создание биосенсора обладающего специфичной чувствительностью и исследуемым молекулам.
Конфликт интересов. Авторs заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Дальневосточного отделения Российской академии наук(грант № 18-3-053).
ЛИТЕРАТУРА
1. Lee S. Chemical functionalization ofAFM cantilevers: Diss. - Massachusetts Institute of Technology, 2005.
2. Bergfeld A.K., Pearce O.M., Diaz S.L., Pham T., Varki A. Metabolism of vertebrate amino sugars with
N-glycolyl groups: elucidating the intracellular fate of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid//Journal of Biological Chemistry. 2012. P. jbc. M112. 363549.
3. Olsson N., James P., Borrebaeck C.A., Wingren C. Quantitative proteomics targeting classes of motif-containing peptides using immunoaffinity-based mass spec-trometry//Molecular & Cellular Proteomics. - 2012. - P. mcp. M111. 016238.
4. Romashko R.V., Efimov, T.A., Kulchin,Y.N.Resonance Microweighting Approach with Using Adaptive Interferometer // Pacific Science Review. 2012; 14(3): 334-336.
5. Johnson B.N., Mutharasan R. Biosensing using dynamic-mode cantilever sensors: a review. Biosens Bioelec-tron. 2012;32(1):1-18. doi: 10.1016/j.bios.2011.10.054.
6. McCaig H.C., Myers E., Lewis N.S., Roukes ML. Vapor sensing characteristics of nanoelectromechanical chemical sensors functionalized using surface-initiated polymerization. Nano Lett. 2014;14(7):3728-32. doi: 10.1021/nl500475b.
7. Xu P., Li X., Yu H., Xu T. Advanced nanoporous materials for micro-gravimetric sensing to trace-level bio/ chemicalmolecules. Sensors (Basel). 2014; 14(10):19023-56. doi: 10.3390/s141019023.
8. Bergkvist M., Cady N.C. Chemical functionalization and bioconjugation strategies for atomic force mi-croscopecantilevers. Methods Mol Biol. 2011;751:381-400. doi: 10.1007/978-1-61779-151-2 24.
Сведения об авторах
Ромашко Роман Владимирович - д.ф.-м.н., ведущий научный сотрудник ИАПУ ДВО РАН, e-mail: romashko@ iacp.dvo.ru; (автор-корреспондент);
Захаренко Александр Михайлович - к.х.н., старший научный сотрудник ДВФУе-mail: zakharenko.am@dvfu.ru; Ефимов Тимофей Александрович - младший научный сотрудник ИАПУ ДВО РАН, e-mail: tim2vl@yandex.ru; Андрюков Борис Георгиевич - д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии НИИЭМ имени Г.П. Сомова, e-mail: andrukov_bg@mail.ru.
HEALTH. MEDiCAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (75) - 2018 35
