CC BY
0DOI: 10.24412/1999-6780-2024-3-64-71 УДК: 579.61.58.009. 547.62
Для цитирования: Иванова Е.В., Чайникова И.Н., Михайлова И.В., Бекпергенова А.В., Бондаренко Т.А., Филиппова Ю.В. Фунгицидная и биопленкоингибирующая активность водных экстрактов лекарственных растений, содержащих танины. Проблемы медицинской микологии. 2024; 26 (3): 64-71. DOI: 10.24412/1999-6780-2024-3-64-71
For citation: Ivanova E.V., Chainikova I.N., Mikhailova I.V., Bekpergenova A.V., Bondarenko T.A., Filippova Yu.V. Fungicidal and biofilm-inhibiting activity of aqueous extracts of medicinal plants containing tannins. Problems in Medical Mycology. 2024; 26 (3): 64-71. (In Russ). DOI: 10.24412/1999-6780-2024-3-64-71
ФУНГИЦИДНАЯ И БИОПЛЕНКОИНГИБИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ВОДНЫХ ЭКСТРАКТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ТАНИНЫ
^Иванова Е.В. (зав. лаб.; доцент)*, 2Чайникова И.Н. (профессор кафедры), 2Михайлова И.В. (зав. кафедрой), 1 Бекпергенова А.В. (с.н.с.); бондаренко Т.А. (н.с.), 2Филиппова Ю.В. (доцент)
'Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза; Оренбургский государственный медицинский университет (кафедра фармацевтической химии; кафедра нормальной физиологии), Оренбург, Россия
Дубильные вещества отвечают за ряд биологических эффектов лекарственных растений, включая антимикробную и фунгицидную активность. Вместе с тем, исследования биопленкоингибирующей активности лекарственных растений в отношении патогенных микроорганизмов единичны. Целью работы было изучение уровня танинов и наличия фунгицидной и биопленкоингибирую-щей активности у лекарственных растений Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare L., Crataégus sanguínea L., Equisetum arvense L. и Achillea millefolium L. Анализ содержания дубильных веществ в водных экстрактах лекарственных растений проводили титриметрическим методом. Для определения фунгицидной активности экстрактов использовали метод микроразведений, биопленкоингибирующей активности - фотометрическим метод. Установлено, что протестированные водные экстракты Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare L., Crataégus sanguínea L. обладают значительным содержанием дубильных веществ и противогрибковой активностью (фунгицидной и биопленкоингибирующей) в отношении C. albicans по сравнению с экстрактами Equisetum arvense L. и Achillea millefolium L. Водные экстракты Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare L. и Crataégus sanguínea L. могут быть перспективны для разработки новых противогрибковых средств природного происхождения, обладающих биопленкоингибирующей активностью.
Ключевые слова: биопленка, Candida albicans, лекарственные растения, биопленкоингибирующая активность, танины
* Контактное лицо: Иванова Елена Валерьевна, e-mail: walerewna13@gmail.com
FUNGICIDAL AND BIOFILM-INHIBITING ACTIVITY OF AQUEOUS EXTRACTS OF MEDICINAL PLANTS CONTAINING TANNINS
1/2lvanova E.V. (head of the laboratory; associate professor), 2Chainikova I.N. (professor of the department), 2Mikhailova I.V. (head of the department), 1 Bekpergenova A.V. (senior scientific researcher), 1 Bondarenko T.A. (scientific researcher), 2FilippovaYu.V. (associate professor)
'Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis; 2Orenburg State Medical University (Department of Pharmaceutical Chemistry; Department of Normal Physiology), Orenburg, Russia
Tannins are responsible for some of the biological effects of medicinal plants, including antimicrobial and fungicidal activity. At the same time, studies of the biofilm-inhibiting activity of medicinal plants against pathogenic microorganisms are rare. The aim of the work was to study the level of tannins and the presence of fungicidal and biofilm-inhibiting activity in medicinal plants Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare L., Crataegus sanguinea L., Equisetum arvense L. and Achillea millefolium L. The analysis of the content of tannins in aqueous extracts of medicinal plants was carried out by the titrimetric method. The fungicidal activity of the extracts was determined using the micro-dilution method, the biofilm inhibitory activity was determined by photometric method. It was found that the tested aqueous extracts of Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare L., Crataegus sanguinea L. have a significant content of tanning agents and antifungal activity (fungi-cidal and biofilm-inhibiting) against C. albicans compared to extracts of Equisetum arvense L. and Achillea millefolium L. Aqueous extracts of Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare L. and Crataegus sanguinea L. may be promising for the development of new antifungal agents of natural origin with bio-filminhibiting activity.
Key words: biofilm, Candida albicans, medicinal plants, biofilminhibiting activity, tannins
ВВЕДЕНИЕ
Проблема поиска новых препаратов, способных обладать не только антибактериальной и противогрибковой активностью, но и антибиопленочным действием, в значительной степени определяет интерес к изучению лекарственных растений, являющихся источником широкого спектра биологически активных метаболитов [1]. Фармацевтический потенциал растений, начиная от антиоксидантных, антимикробных и антихолинэстеразных до нейропротек-торных и антипролиферативных, широк и многообразен. Кроме того, растения служат источниками метаболитов, которые могут ингибировать или разрушать биопленки и подавлять системы чувства кворума (QS) [2]. Их эффективность обусловлена разным химическим составом и в первую очередь вторичными метаболитами, различающимися по типу и количеству у разных растений и проявляющими разнообразную биологическую активность [3].
Танины - это производные полифенолов с высокой молекулярной массой (МВТ) (500-30 000 Да), распространенные по всему растительному миру. Обнаружено, что танины подавляют рост бактерий, используя различные механизмы, включая хелатиро-вание железа, ингибирование синтеза клеточной стенки, разрушение клеточной мембраны и ингиби-рование путей биосинтеза жирных кислот [4]. Танины могут действовать как ингибиторы чувства кворума и ослаблять экспрессию генов факторов вирулентности, таких как биопленкообразование, ферменты, адгезины, подвижность и токсинообразова-ние [5].
Способности грибов Candida albicans образовывать биопленки, проникать через естественные барьеры организма, попадать в кровоток и поражать различные органы вносят вклад в патогенез внутри-больничных инфекций, инвазивного кандидоза (инфекция кровотока/кандидемия) и с учетом факторов хозяина угрожают жизни пациентов [6-8]. Персисти-рующие (длительно протекающие, хронические) инфекции, связанные с биопленкой, являются высоко распространенными (80%) и трудно поддаются лечению из-за множественной лекарственной устойчивости патогенов бактериальной и грибковой природы [9]. Низкая эффективность различных методов лечения и токсичность доступных антибиотиков и противогрибковых препаратов in vivo обуславливают необходимость поиска и разработки эффективных природных средств с антибиопленочными свойствами, в том числе из растений [10]. Показано, что экстракты и средства против биопленок на основе натуральных продуктов более эффективны, чем химически синтезированные аналоги, из-за их относительно нетоксичной природы, биосовместимости и доступности [11, 12].
Разработка новых веществ, обладающих активностью против биопленок C. albicans, имеет первостепенное значение для расширения существующих в настоящее время ограниченных возможностей эффективного лечения кандидозных инфекций, сопровождающихся образованием биопленок. C. albicans по-прежнему считается одним из наиболее значимых видов микробиоты человека [13-15] и является частью микобиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), влагалища и полости рта большинства здоровых людей. Вместе с тем, неопровержимые данные свидетельствуют о том, что основным источником диссеминированных инфекций, вызванных C. albicans, является ЖКТ [16]. C. albicans - условно-патогенный микроорганизм, вызывающий инфекции, начиная от поверхностных и заканчивая более опасными для жизни диссеминированными инфекциями, возникающими у пациентов с нарушениями иммунной системы и/или микробиоты слизистых оболочек.
Лекарственные растения, используемые в нашей работе, широко применяются в медицинской практике, имеют коммерческое значение, особенно для фармацевтической, пищевой, санитарно-
косметической и парфюмерной промышленности, во многом благодаря наличию широкого спектра биологически-активных соединений. Антисептическими, смягчающими и дерматологическими защитными свойствами обладает земляника лесная (Fragaria vesca), противовоспалительным, антиоксидантным, антибактериальным и цитотоксическим действием -эфирное масло Tanacetum vulgare. Боярышник (Crataegus L.) наиболее часто применяют для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, у хвоща полевого (Equisetum arvense L.) антибактериальное действие выявлено только в отношении патогенных грамположительных кокков. Тысячелистник (Achillea millefolium L. s.l.) традиционно используют при лечении воспалительных и спазматических желудочно-кишечных расстройств, гепато-билиарных заболеваний и воспалительных процессов различной локализации.
Цель работы: изучить уровень танинов и наличие фунгицидной и биопленкоингибирующей активности у лекарственных растений Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare L., Crataégus sanguínea L., Equisetum arvense L. и Achillea millefolium L.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение экстрактов лекарственных трав.
Объектами исследования служили водные извлечения (1:10) промышленных образцов 5 видов сырья: травы тысячелистника обыкновенного (Achillea millefolium L.), листьев земляники лесной (Fragaria vesca L.), хвоща полевого (Equisetum arvense L. ), плодов боярышника кроваво-красного (Crataégus sanguínea L.) и цветков пижмы обыкно-
венной (Tanacetum vulgare L.), поступающих в аптечную сеть г. Оренбурга. Водные извлечения из лекарственного растительного сырья готовили в соответствии с методикой Государственной фармакопеи XI (вып. 1, стр, 147). Каждый образец экстрагировали нагреванием в воде в количестве 8-10-кратной массы травы в течение 3 часов при температуре 115 °C (термобаня «ЛОИП ЛБ-2**», Россия). После кипячения экстракт фильтровали с помощью стандартных тестовых сит (150,0 мкм) («Retsch», Германия) и лиофилизировали до порошка. Образец каждого порошкообразного растительного лекарственного средства массой 50,0 мг растворяли в 1,0 мл дистиллированной воды и перед использованием хранили при -20 °C.
Определение содержания танинов в водных экстрактах растений.
Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье проводили тит-риметрическим методом в пересчете на танин согласно общим фармакопейным статьям (0ФС.1.5.3.0008.15). 25,0 мл настоя отмеряли в коническую колбу объемом 1,0 л и добавляли 25,0 мл раствора индиго и 750,0 мл дистиллированной де-ионизированной воды. Для титрования использовали 0,1% водный раствор KMnO4, добавляли каплями до появления у раствора золотисто-желтого цвета. Стандартный раствор индигокармина готовили следующим образом: 6,0 г индигокармина растворяли в 500,0 мл дистиллированной деионизированной воды при нагревании, после охлаждения добавляли 50,0 мл 95,0-97,0% H2SO4, раствор разбавляли до 1,0 л и фильтровали. Проводили холостые испытания титрованием смеси 25,0 мл раствора индигокармина и 750,0 мл дистиллированной деионизированной H2O. Все образцы были проанализированы в 20 дублях.
Определение фунгицидной активности водных экстрактов лекарственных трав в отношении C. albicans.
С помощью метода микроразведения проведена оценка фунгицидной активности лекарственных растений на основании определения минимальной ин-гибирующей концентрации (MIC) и минимальной фунгицидной концентрации (MFC) пяти водных экстрактов на 30 штаммах C. albicans. Инокуляты дрожжевых грибов готовили из 12-часовых бульонных культур, суспензии доводили до мутности 0,5 McF. Экстракты лекарственных трав сначала разводили до концентрации 100,0 мг/мл, подлежащей тестированию, а затем осуществляли серийные двукратные разведения в 5,0 мл питательного бульона с концентрациями в диапазоне 0,8-100,0 мг/мл. 96-луночные планшеты готовили путем внесения в каждую лунку 95,0 мкл питательного бульона и 5,0 мкл инокулята. В первую лунку добавляли аликвоту
по 100,0 мкл исходных растворов каждого экстракта растительного лекарственного средства, затем по 100,0 мкл серийных разведений переносили в 8 последовательных лунок. Последнюю лунку использовали в качестве отрицательного контроля, содержащего 195,0 мкл питательного бульона без экстрактов лекарственных трав и 5,0 мкл инокулята. Конечный объем в каждой лунке составлял 200,0 мкл. Планшеты инкубировали при 37 °C в течение 24 часов. MIC определяли как самую низкую концентрацию соединений, подавляющую рост микроорганизмов. Значения MFC устанавливали путем культивирования 20,0 мкл из лунок планшета на среде «Bi.G.G.Y. Agar». Значения MFC определялись как самая низкая концентрация образца, которая приводила к гибели >99,9% исходного инокулята. Исследование выполняли в трех параллелях.
Определение биопленкоингибирующей активности водных экстрактов лекарственных трав в отношении C. albicans.
Для определения биопленкоингибирующей активности лекарственных растений концентрацию экстракта разводили в два раза от MIC (это минимальная субингибиторная концентрация (SIC), мг/мл) и использовали инокулят 1*104 КОЕ/мл. Образование биопленок изучали фотометрическим методом по определению способности грибов прикрепляться к поверхности 96-луночного полистиролового планшета («Thermo Scientific», США) с последующим окрашиванием кристаллическим фиолетовым. Измерение оптической плотности проводили с помощью фотометра «ELx808» («BioTek», США) на длине волны 570 нм. Степень образования биопленок штаммами выражали в условных единицах (OD570), которые представляли собой оптическую плотность бульона после роста штамма относительно оптической плотности питательного бульона.
Процент индекса ингибирования биопленки (ИИБ) в присутствии водных экстрактов лекарственных растений рассчитывали следующим образом [17]:
ИИБ(%) = 100 - ( ОП °"ыт X 100), где
\ОП контроль /
ОП опыт - оптическая плотность дрожжевых грибов в лунках с лекарственными растениями; ОП контроль - оптическая плотность дрожжевых грибов в лунках без лекарственных растений (контроль).
Статистический анализ.
Результаты проведенных исследований обрабатывали методами вариационной статистики с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Excel» и «STATISTICA 10.0». Результаты исследований представлены в виде M±m, где М - средняя арифметическая, m - стандартная ошибка средней, а также в виде Me (Q25;Q75), где Me - медиана, нижний (Q25)
и верхний (Q75) квартили. Критерий Стьюдента использовали для оценки статистической значимости разницы между контролем и образцами, обработанными каждым экстрактом. Статистически значимым считали значение р <0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ содержания танинов в водных экстрактах растений позволил установить их наибольшее содержание у Fragaria vesca L. и Tanacetum vulgare L. (табл. 1).
Таблица 1
Анализ лекарственных растений на содержание танинов (%)
Уровни дубильных веществ в водных экстрактах Crataégus sanguínea L., Equisetum arvense L. и Achillea millefolium L. были статистически ниже, чем у двух предыдущих лекарственных растений (р<0,05). Дубильные вещества представляют собой важную группу вторичных растительных метаболитов. Считается, что дубильные соединения отвечают за значительную часть биологических эффектов лекарственных растений, включая антимикробную и фунгицидную активность. В связи с этим на следующем этапе исследований была оценена эффективность водных экстрактов изученных лекарственных растений против C. albicans по показателям MIC и MFC с использованием методики микроразведения в бульоне.
Анализ противогрибковой активности экстрактов лекарственных растений представлен в таблице 2.
Таблица 2
MIC, SIC и MFC водных экстрактов лекарственных растений в отношении штаммов C. albicans
Название лекарственных растений C. albicans (n=30)
MIC (mg/mL) SIC (mg/mL) MFC (mg/mL)
Fragaria vesca L. 6,25-12,5 3,12-6,25 25,0-50,0
Tanacetum vulgare L. 6,25-12,5 3,12-6,25 25,0-50,0
Crataégus sanguínea L. 12,5-25,0 6,25-12,5 50,0-100,0
Equisetum arvense L. 50,0-100,0 25,0-50,0 -
Achillea millefolium L. 50,0-100,0 25,0-50,0 -
Водные экстракты Fragaria vesca L. и Tanacetum vulgare L. показали выраженную противогрибковую активность. Как видно из таблицы 2, наибольшее значения MIC отмечали у Fragaria vesca L. и Tanacetum vulgare L. Наименьшие уровень MIC, по сравнению с другими экстрактами, наблюдали у Equisetum arvense L. и Achillea millefolium L. Значения MFC для водных экстрактов Fragaria vesca L. и Tanacetum vulgare L. составили 25,0-50,0 мг/мл, что свидетельствовало об их выраженном антифунги-цидном влиянии на дрожжевые грибы. Напротив, для Equisetum arvense L. и Achillea millefolium L. уровень MFC не определялся, поскольку дрожжевые грибы в присутствии экстрактов сохраняли способность к росту и размножению.
Для выявления биопленкоингибирующей активности водных экстрактов лекарственных растений предварительно была проведена оценка способности исследуемых штаммов C. albicans к биоплен-кообразованию. Установлено, что 80,0±1,0% изоля-тов были способны образовывать биопленку со значениями оптической плотности в диапазоне от 0,328±0,04 OD570 до 0,957±0,09 OD570, тогда как у 20,0±1,0% штаммов образования биопленки не отмечали (значения менее 0,100 OD570).
Биопленкоингибирующая активность водных экстрактов лекарственных трав представлена в таблице 3.
Штаммы C. albicans, использованные на этом этапе исследования, были выбраны из изолятов, способных формировать биопленки на полистироловых планшетах (24 штамма). Водные экстракты Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare L., Crataégus sanguínea L. и Achillea millefolium L. оказывали ингибирующее влияние на процесс биопленкообразования (БПО) в отношении всех 24 изученных штаммов грибов (р<0,05).
Номер Название лекарственных растений
проб Fragaria Tanacetum Crataégus Equisetum Achillea
vesca L. vulgare L. anguínea L arvense L. millefolium L
1. 5,081 2,628 1,155 0,239 0,693
2. 5,081 5,734 1,386 0,956 0,693
3. 4,619 3,106 1,155 0,000 0,693
4. 5,312 2,389 1,155 0,717 0,923
5. 4,850 6,451 0,924 0,000 0,928
6. 4,619 2,389 1,386 0,717 0,693
7. 4,850 2,867 1,155 0,239 0,693
8. 5,081 2,628 1,617 0,717 0,922
9. 5,312 2,628 1,155 0,000 0,900
10. 5,543 2,389 0,693 0,478 0,923
11. 4,619 2,628 0,693 0,956 0,693
12. 5,312 2,867 1,155 0,478 0,923
13. 5,081 2,628 0,924 0,717 0,923
14. 4,850 2,628 0,924 1,195 0,923
15. 4,850 2,389 1,155 0,239 0,923
16. 4,850 3,106 0,924 0,478 0,693
17. 5,081 3,345 0,924 0,239 0,693
18. 5,081 2,389 0,924 0,478 0,923
19. 5,543 2,389 0,924 0,478 0,693
20. 5,312 2,867 1,386 0,239 0,923
Me 5,04 2,628 1,155 0,478 0,924
[Q25; 4,85; 2,389; 0,924; 0,239; 0,693;
Q75] 5,312 3,046 1,155 0,717 0,924
Таблица 3
Биопленкоингибирующая активность водных экстрактов лекарственных растений в отношении штаммов C. albicans
№ БПО штам- Fragaria Tanacetum Crataégus Equisetum Achillea
мов vesca L. ИИБ vulgare L. ИИБ sanguínea L. ИИБ arvense L. ИИБ millefolium L. ИИБ
OD67Û ± SD OD67Û ± SD (%) OD57G ± SD (%) ODб70 ± SD (%) OD57G ± SD (%) OD57G ± SD (%)
контроль опыт опыт опыт опыт опыт
1 G,955 ± 0,086 G,GB5 ± 0,0G3 91,1 0,044 ± 0,001 95,4 G,267 ± 0,019 72,G G,9G1 ± 0,092 5,7G G,6G5 ± 0,018 3б,б
2 G,601± 0,101 G,121± 0,GG5 79,9 G,G21± 0,GG2 9б,5 G,195± 0,GG3 б7,б G,597± 0,G44 G,GG G,421± 0,G47 3G,G
3 G,B67 ± 0,008 G,G4B ± 0,007 94,5 G,G16 ± 0,001 98,1 G,3G9 ± 0,022 б4,4 G,615 ± 0,025 29,G G,589 ± 0,124 32,G
4 0,553 ± 0,015 G,G61 ± 0,0G3 B9,G G,G35 ± 0,0G1 93,7 G,244 ± 0,0G7 55,8 G,389 ± 0,05б 29,7 G,218 ± 0,0G4 6G,6
б G,718 ± 0,015 G,137 ± 0,0G4 BG,9 G,G82 ± 0,0G3 88,б G,2GG ± 0,031 72,1 G,622 ± 0,1GG 13,4 G,5G8 ± 0,121 29,2
б 0,486 ± 0,080 G,G3B ± 0,0G1 92,1 G,G46 ± 0,0G1 9G,5 G,178 ± 0,0G5 б3,4 G,4G9 ± 0,075 15,8 G,221 ± 0,051 54,5
Z 0,619 ± 0,061 G,129 ± 0,0G1 79,2 G,G22 ± 0,0G1 9б,4 G,168 ± 0,GG7 72,9 G,532 ± 0,041 14,G G,452 ± 0,1G2 27,G
В 0,577 ± 0,055 G,1B9 ± 0,0G5 б7,2 G,141 ± 0,0G2 75,б G,331 ± 0,041 42,б G,451 ± 0,0б1 21,8 G,2G9 ± 0,184 б3,8
9 0,708 ± 0,105 G,135 ± 0,GG1 BG,9 G,171 ± 0,GG1 75,8 G,334 ± 0,G22 52,8 0,691 ± 0,G98 2,4G G,478 ± 0,121 32,5
1G G,624 ± 0,015 G,111 ± 0,003 82,2 G,G81 ± 0,003 87,G G,244 ± 0,045 6G,9 G,5G8 ± 0,034 18,б G,488± 0,087 22,G
11 0,881 ± 0,110 G,GB9 ± 0,GG1 89,9 G,G94 ± 0,GG1 89,3 G,328 ± 0,G5G б2,8 G,695 ± 0,12G 21,1 G,644 ± 0,13б 2б,9
12 G,425 ± 0,031 G,G56 ± 0,0G3 Вб,В G,G47 ± 0,0G1 88,9 G,164± 0,011 б1,4 G,275 ± 0,0б1 35,3 G,3G2 ± 0,018 28,9
13 0,328 ± 0,040 G,G1B ± 0,0G1 94,5 G,G33 ± 0,0G1 89,9 G,G57 ± 0,015 82,б G,161 ± 0,057 5G,9 G,1G8 ± 0,032 67,G
14 0,724 ± 0,100 G,169 ± 0,GG3 7б,7 G,125 ± 0,GG2 82,7 G,437 ± 0,G5G 39,б G,691 ± 0,11G 4,55 G,412 ± 0,121 43,1
15 0,621 ± 0,084 G,G4B ± 0,0GB 92,3 G,113 ± 0,0G1 81,8 G,211 ± 0,018 66,G G,544 ± 0,031 12,4 G,521 ± 0,033 1б,1
1б 0,581 ± 0,104 G,191 ± 0,GG2 б7,1 G,G38 ± 0,GG1 93,5 G,3G2 ± 0,G24 48,G G,467 ± 0,G88 19,б G,24G ± 0,115 58,7
1Z 0,367 ± 0,074 G,G69 ± 0,0GB 81,2 G,G45 ± 0,0G1 87,7 G,191 ± 0,011 48,G G,241 ± 0,043 34,3 G,281 ± 0,0б2 23,4
18 G,B84 ± 0,016 G,GB7 ± 0,0G4 9G,2 G,117 ± 0,0G5 8б,8 G,271 ± 0,022 б9,3 G,5G2 ± 0,0бб 43,2 G,583 ± 0,044 34,G
19 0,924 ± 0,121 G,116 ± 0,GG5 87,4 G,124 ± 0,G13 8б,б G,391 ± 0,G8G 57,7 G,881 ± 0,134 4,б5 G,745 ± 0,113 19,4
2G G,957 ± 0,031 G,221 ± 0,011 7б,9 G,137 ± 0,011 85,7 G,448 ± 0,081 53,2 G,94G ± 0,125 1,77 G,8G6 ± 0,121 15,8
21 0,739 ± 0,082 G,G43 ± 0,0G1 94,1 G,G61± 0,0G1 91,7 G,257 ± 0,0б2 б5,2 G,653 ± 0,028 11,б G,5G8 ± 0,088 31,3
22 0,622 ± 0,041 G,11B ± 0,0G3 81,G G,G42 ± 0,0G1 93,2 G,191 ± 0,05б б9,3 G,6G5 ± 0,014 2,7 G,385 ± 0,051 38,1
23 0,825 ± 0,144 G,1G9 ± 0,GG7 8б,8 G,G55 ± 0,GG3 93,3 G,4G1 ± 0,G34 51,4 G,5G1 ± 0,171 39,3 G,7G8 ± 0,1 G6 14,2
24 0,938 ± 0,132 G,331 ± 0,G15 б4,7 G,4G9 ± 0,GG1 5б,4 G,581 ± 0,15G 38,1 G,793 ± 0,159 15,5 0,704± 0,141 24,9
ИИБ(%) Me[Q25; 75] 84,5 [7б,7; 94,5] 87,7 [81,8; 98,1] 59,9 [51,4; 72,G] 15,75 [11,б; 19,б] 3G,7 [22,G; 43,1]
Так, добавление водных экстрактов Fragaria vesca L. и Tanacetum vulgare приводило к снижению уровня БПО, соответственно, у 11 штаммов (45,8%) и 16 штаммов (66,7%) до значений менее 0,100 ед., что можно интерпретировать как отсутствие признака. В среднем значения индекса ингибирования биопленок (ИИБ) штаммов C. albicans для водного экстракта Fragaria vesca L. составляли 84,5% [76,7; 94,5], а для Tanacetum vulgare L. - 87,7% [81,8; 98,1]. Для Crataegus sanguinea L. наблюдали биопленкоин-гибирующую активность в диапазоне от 38,1% до 82,6% (59,9 % [51,4; 72,0]). Водные экстракты хвоща полевого оказывали антибиопленочное влияние в отношении 70,8% изолятов (17 штаммов). Процент ингибирования регистрировали в диапазоне от 12,4% до 50,9% (15,75% [11,6; 19,6]). Для водных экстрактов Achillea millefolium L. процент ингибирования составлял 14,2-67,0% для биопленок C. albicans -30,7% [22,0; 43,1]).
Выявленные эффекты противогрибкового влияния исследуемых водных экстрактов в отношении роста, размножения и биопленкообразующей способности штаммов C. albicans свидетельствуют, что данные лекарственные растения/фитопрепараты, имеющие широкий спектр применения в традиционной медицине, могут быть перспективны при разработке новых лекарственных препаратов и биологи-
чески активных соединений в борьбе с кандидозной инфекцией.
Результаты работы позволили установить, что уровень танинов в изученных водных экстрактах соотносится с их выраженными фунгицидными и биопленкоингибирующими свойствами в отношении штаммов C. albicans. Наиболее выраженные противогрибковые эффекты отмечали у трех лекарственных растений - Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare L. и Crataégus sanguínea L., что открывает перспективу их использования для разработки новых противогрибковых средств природного происхождения с биопленкоингибирующей активностью.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Интерес к поиску препаратов с фунгицидной и антибиопленочной активностью из группы растительных препаратов определяется тем, что растения тесно связаны симбиозом с различными микроорганизмами и поэтому имеют эволюционно выработанную специфическую регуляцию, позволяющую элиминировать фитопатогенные виды микробов. Как правило, антибактериальной активностью обладают вторичные метаболиты растений — флавоноиды, алкалоиды, терпены и танины. Вместе с тем, при исследовании тотальных растительных экстрактов нельзя не учитывать влияние таких соединений, как
сахара и аминокислоты, которые также способны влиять на жизнедеятельность микроорганизмов [18].
В настоящей работе изучено 30 кишечных изо-лятов C. albicans, в отношении которых тестировали антибиопленочную активность с оценкой MIC и MFC пяти водных экстрактов лекарственных растений, в которых предварительно определяли уровень танинов. При исследовании уровня танинов и наличия фунгицидной и биопленкоингибирующей активности у лекарственных растений Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare L., Crataégus sanguínea L., Equisetum arvense L. и Achillea millefolium L. активность MFC в отношении изолятов C. albicans наблюдали только в случае Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare L. и Crataégus sanguínea L., тогда как экстракты Equisetum arvense L. и Achillea millefolium L. не оказывали фунгицидного влияния. Показатель MIC водных экстрактов в отношении изолятов C. albicans также был более выражен у Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare и Crataégus sanguínea L. В то же время при оценке антибиопленочной активности водных экстрактов выявили, что Fragaria vesca L. и Tanacetum vulgare L. обладают самой высокой способностью ингибирования биопленок в отношении C. albicans, далее следует Crataégus sanguínea L. Судя по химической специфичности, наибольшая противогрибковая активность Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare L. и Crataégus sanguínea L., возможно, обусловлена высоким уровнем дубильных веществ, в частности танинов (1,155-5,04%), содержащихся в водных экстрактах этих растений.
Обсуждая возможные механизмы, лежащие в основе полученных результатов, следует отметить, что виды Candida обладают несколькими факторами вирулентности, такими как: образование гиф и биопленок, продукция липаз, протеаз и фосфолипаз. Морфогенетическая конверсия (способность обратимо переключаться между дрожжевой, мицелиаль-ной и псевдомицелиальной формами) играет ключевую роль в развитии биопленки и патогенности C. albicans, поскольку гифы и псевдогифы могут проникать в эпителиальные клетки, вызывать повреждение тканей и являются необходимым условием для проявления патогенности и образования биопленки [19]. Описаны регуляторные гены, которые контролируют морфологию клеток, образование нитевидных форм и биопленки [20]. Развитие биопленки включает взаимосвязанную транскрипционную ре-гуляторную сеть (TRN), состоящую из девяти транскрипционных факторов (TFS). Поэтому ингибиро-вание образования биопленки и вирулентных характеристик грибов рода Candida является одним из средств борьбы с длительными персистирующими инфекциями [21]. В настоящее время обсуждаются различные стратегии для подавления филаментации, предотвращения образования биопленки и снижения вирулентности. Эти стратегии включают ингибиро-вание формирования грибами рода Candida фила-
ментов с использованием природных или синтетических соединений и их комбинации с другими агентами или наноформулами [22-25].
Разнообразие химической структуры и стабильность, проявляющиеся в группе танинов, позволяют их классифицировать как гидролизуемые, сложные и проантоцианидины [26]. Танины различных групп могут влиять на рост бактерий посредством нескольких механизмов. Прямые пути реализуются путем воздействия на микробный метаболизм через инги-бирование окислительного фосфорилирования [26]. Косвенные пути осуществляются путем ингибирова-ния внеклеточных микробных ферментов, а также лишением субстратов, необходимых для роста микроорганизмов. Установлено, что проантоцианидино-вые полимерные танины, присутствующие в водной фракции F2 и полуочищенной субфракции F2.4 из коры стебля S. adstringens (вид бобовых растений из рода Stryphnodendron), обладали противогрибковой активностью in vitro в отношении планктонных клеток C. albicans и нарушали формирование этими грибами биопленки [27]. Кроме того, показано, что тоннингианин А (THA) - флавоноид эллагового танина, широко встречающийся в природных растениях, не только подавляет образование биопленок грибов C. albicans, но способен разрушать и зрелые биопленки [28]. Отметим, что растения могут взаимодействовать с кворум-сенсорной системой бактерий, манипулируя тем самым их способностью образовывать биопленки, синтезировать факторы вирулентности или другие соединения, контролируемые этой системой [11]. Вместе с тем, природа и структура многих растительных молекул, препятствующих образованию биопленок бактерий и грибов, до сих пор остается неизвестной.
Все изложенное свидетельствует, что изучение биологически активных соединений, синтезируемых растениями, может привести к разработке новых способов управления жизнедеятельностью грибов. Поэтому растения изучают как источники безопасных агентов, которые могут способствовать повышению активности и снижению токсичности противогрибковой терапии.
Таким образом, растительные экстракты лекарственных растений могут стать обоснованной альтернативой традиционным противомикробным препаратам при лечении грибковых инфекций, поскольку обладают низким уровнем цитотоксичности и не вызывают резистентности у микроорганизмов. Установленная в данном исследовании высокая способность ингибирования биопленок в отношении C. albicans водных экстрактов Fragaria vesca L., Tanacetum vulgare L. и Crataégus sanguínea L. обосновывает возможность быть перспективными для разработки новых противогрибковых средств природного происхождения с биопленкоингибирующей активностью.
ЛИТЕРАТУРА
1. Guimaraes R., Milho C., Liberal A., et al. Antibiofilm potential of medicinal plants against Candida spp. Oral Biofilms: A Review. Antibiotics (Basel). 2021; 10 (9): 1142. doi:10.3390/antibiotics10091142
2. Carradori S., Di Giacomo N., Lobefalo M., et al. Biofilm and quorum sensing inhibitors: the road so far. Expert Opin. Ther. Pat. 2020; 30: 917-930. doi: 10.1080/13543776.2020.1830059
3. Melander R.J., Basak A.K., Melander C. Natural products as inspiration for the development of bacterial antibiofilm agents. Nat. Prod. Rep. 2020; 37:1454-1477. doi: 10.1039/D0NP00022A
4. Farha A.K., Yang Q.Q, Kim G., et al. Tannins as an alternative to antibiotics. Food Bioscience. 2020; 38: 100751. doi :10.1016/j .fbio.2020.100751
5. Ruiz-Duran J., Torres R., Stashenko E.E., Ortiz C. Antifungal and antibiofilm activity of colombian essential oils against different Candida strains. Antibiotics (Basel). 2023; 12 (4): 668. doi:10.3390/antibiotics12040668
6. Pappas P.G., Lionakis M.S., Arendrup M.C., et al. Invasive candidiasis. Nat. Rev. Disю Prim. 2018; 4:1-20. doi: 10.1038/nrdp.2018.26
7. Gonzalez-Lara M.F., Ostrosky-Zeichner L. Invasive candidiasis. semin. respir. Crit. Care Med. 2020; 41: 3-12. doi: 10.1055/s-0040-1701215
8. Desrini S., GirardotM., Imbert C., et al. Screening antibiofilm activity of invasive plants growing at the Slope Merapi Mountain, Central Java, against Candida albicans. BMC Complement Med. Ther. 2023; 23 (1): 232. doi:10.1186/s12906-023-04044-2
9. Damyanova T., Dimitrova P.D., Borisova D., et al. An overview of biofilm-associated infections and the role of phy-tochemicals and nanomaterials in their control and prevention. Pharmaceutics. 2024; 16 (2): 162. doi :10.3390/pharmaceutics 16020162
10. Mishra R., Panda A.K., De Mandal S., et al. Natural anti-biofilm agents: strategies to control biofilm-forming pathogens. Front. Microbiol. 2020; 11: 566325. doi:10.3389/fmicb.2020.566325
11. Ghosh S., Lahiri D., Nag M, et al. Phytocompound mediated blockage of quorum sensing cascade in ESKAPE pathogens. Antibiotics. 2022; 11: 61. doi: 10.3390/antibiotics11010061
12. PattnaikS., MishraM., Singh H., NaikP.K. Novel perspectives on phytochemicals-based approaches for mitigation of biofilms in ESKAPE pathogens: recent trends and future avenues. 2023; 25: 433-454. doi: 10.1016/B978-0-443-19143-5.00005-0
13. Prigitano A., Cavanna C., Passera M., et al. Evolution of fungemia in an Italian region. J. Mycol. Med. 2020; 30 (1): 100906. doi: 10.1016/j.mycmed.2019.100906
14. Siopi M., Tarpatzi A., Kalogeropoulou E., et al. Epidemiological trends of fungemia in Greece with a focus on can-didemia during the recent financial crisis: a 10-year survey in a tertiary care academic hospital and review of literature. Antimicrob. Agents Chemother. 2020; 21; 64 (3): e01516-e01519. doi:10.1128/AAC.01516-19
15. Villanueva F., Veliz J., Canasa K., et al. Characteristics of fungemias in a Peruvian referral center: 5-year retrospective analysis. Ver. Peru Med. Exp. Salud. Publica. 2020; 37 (2): 276-281. doi: 0.17843/RPMESP.2020.372.5026
16. Basmaciyan L., Bon F., Paradis T., et al. Candida albicans interactions with the host: crossing the intestinal epithelial barrier. Tissue Barriers. 2019; 7 (2): 1612661. doi: 10.1080/21688370.2019.1612661
17. Romero C.M., Vivacqua C.G., AbdulhamidM.B., et al. Biofilm inhibition activity of traditional medicinal plants from Northwestern Argentina against native pathogen and environmental microorganisms. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 2016; 49 (6): 703-712. doi: 10.1590/0037-8682-0452-2016
18. Zhang N., Wang D., Liu Y., et al. Effects of different plant root exudates and their organic acid components on chemo-taxis, biofilm formation and colonization by beneficial rhizosphereassociated bacterial strains. Plant and Soil. 2014; 374 (1-2): 689-700. doi:10.1007/s11104-013-1915-6
19. Rai L.S., WijlickL.V., BougnouxM.E., et al. Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans. Yeast. 2021; 38 (4): 243-250. doi: 10.1002/yea.3550
20. Ganser C., Staples M.I., DowellM., et al. Filamentation and biofilm formation are regulated by the phase-separation capacity of network transcription factors in Candida albicans. PLoS Pathog. 2023; 19 (12): e1011833. doi:10.1371/journal.ppat.1011833
21. Janeczko M., Kochanowicz E., Biochanin A. Inhibits the growth and biofilm of Candida species. Pharmaceuticals (Basel). 2024; 17 (1): 89. doi:10.3390/ph17010089
22. Khan F., Bamunuarachchi N.I., Tabassum N., et al. Suppression of hyphal formation and virulence of Candida albicans by natural and synthetic compounds. Biofouling. 2021; 37 (6): 626-655. doi:10.1080/08927014.2021.1948538
23. Kim Y.G., Lee J.H., Park S., et al. Hydroquinones including tetrachlorohydroquinone inhibit Candida albicans biofilm formation by repressing hyphae-related genes. Microbiol. Spectr. 2022; 10 (5): e0253622. doi:10.1128/spectrum.02536-22
24. Kumpakha R., Gordon D.M. Occidiofungin inhibition of Candida biofilm formation on silicone elastomer surface. Microbiol. Spectr. 2023; 11 (6): e0246023. doi:10.1128/spectrum.02460-23
25. Lee J.H., Kim Y.G., Kim Y., Lee J. Antifungal and antibiofilm activities of chromones against nine Candida species. Microbiol Spectr. 2023; 11 (6): e0173723. doi:10.1128/spectrum.01737-23
26. Sieniawska T. Baj, Chapter 10 - Tannins, Editor (s): Simone Badal, Rupika Delgoda. Pharmacognosy, Academic Press. 2017; 199-232. doi.org/10.1016/B978-0-12-802104-0.00010-X
27. Luiz R.L.F., Vila T.V.M., Mello de J.C.P., et al. Proanthocyanidins polymeric tannin from Stryphnodendron adstringens are active against Candida albicans biofilms. BMC Complement. Altern. Med. 2015; 15: 68. doi: 10.1186/s12906-015-0597-4
28. Wang H, Li H, Liu Z, et al. Activity of thonningianin A against Candida albicans in vitro and in vivo. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2024; 108 (1): 96. doi:10.1007/s00253-023-12996-1
Поступила в редакцию журнала 27.05.24 Принята к печати 02.10.24
