CC BY
102
Наука и медицина
Вестник ДВО РАН. 2004. № 3
В.А.СТОНИК
Фундаментальные исследования в интересах медицины в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН и их прикладные результаты
Природные соединения являются основой для создания новых лекарственных препаратов. Химические исследования морских организмов в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН привели к открытию разнообразных природных соединений, демонстрирующих антиоксидантные, ге-патопротекторные, противоопухолевые и другие свойства. На основе этих веществ удалось создать ряд новых лекарственных препаратов и пищевых композиций. Обсуждаются также некоторые результаты, полученные в ТИБОХ при изучении молекулярных основ некоторых заболеваний, прежде всего бактериальных инфекций.
The basic research for medicine at the Pacific Institute of Bioorganic Chemistry of FEB RAS and their applied results. V.A.STONIK (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).
The natural compounds serve as a basis for development of new drugs. The chemical studies of the marine organisms carried out at the Pacific Institute of Bioorganic Chemistry of FEB RAS have been resulted in revealing the various natural compounds with antioxidant, hepatoprotective, antitumor, and other properties. A series of new medicinal preparations and food compositions has been developed at the Institute on the basis of these natural products. Some results of studying the molecular mechanisms of different patologies, especially the microbial infections, have been also discussed.
В Тихоокеанском институте биоорганической химии (ТИБОХ) ДВО РАН на протяжении сорока лет ведутся фундаментальные исследования природных соединений, тесно связанные с экспериментальной и клинической медициной. Изучение природных соединений имеет важное значение для укрепления здоровья и увеличения продолжительности жизни людей. Хорошо известно, что природные соединения, химические структуры и биологические функции которых изучает биоорганическая химия, широко используются в качестве лекарств и ценных пищевых компонентов. Более 60 % всех новых лекарственных препаратов, разрешенных за последние 22 года для клинического использования в странах Европы и в США, были созданы с применением знаний, полученных при изучении природных соединений. Так, из 868 новых субстанций лекарств (активные компоненты лекарственных форм) 130 веществ были природными соединениями, еще 210 являлись полусинтетическими производными природных соединений и, наконец, 227 субстанций
СТОНИК Валентин Аронович — академик, директор Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (Владивосток).
были получены полным синтезом с использованием информации о природных фармакофорах или на основе общего сходства с биомолекулами. Около 90 лекарственных субстанций, в основном пептидной и белковой природы, было создано биотехнологическими методами [16].
Многие десятки лет основными источниками новых природных соединений были высшие наземные растения, а с момента открытия пенициллинов — еще и почвенные микроорганизмы. И в настоящее время исследование растительных и микроорганизменных метаболитов имеет определяющее значение для создания новых лекарств. Однако в последние 30—40 лет появился новый источник природных соединений — морские организмы. Морские природные соединения изучает морская биоорганическая химия — быстро развивающийся раздел биоорганической химии, на который возлагаются большие надежды при создании новых лекарств. ТИБОХ ДВО РАН — это основной в стране научный центр, работающий в области морской биоорганической химии. Кроме низкомолекулярных биорегуляторов здесь изучаются полисахариды, липиды, пептиды, белки, гликопротеины и другие группы метаболитов морских организмов. В Институте также продолжаются многолетние исследования природных соединений из наземных растений Дальнего Востока России, и быстро развиваются микробиологические работы, связанные с поиском новых продуцентов ферментов, антибиотиков, других физиологически активных веществ и изучением структуры и функций различных метаболитов микробиального и грибкового происхождения.
Другим направлением научных исследований Института, открывающим перспективы медицинского использования полученных результатов, является молекулярная иммунология, в особенности изучение антигенов бактерий, вызывающих распространенные в нашем регионе инфекционные заболевания, и молекулярных маркеров различных опухолей.
Наконец, исследования в области геномики и протеомики морских организмов, а также биотехнологические изыскания, выполняемые в Институте, также могут иметь существенное значение для медицины.
Химики-биоорганики, химики-синтетики, физики, использующие ЯМР спектрометры, масс-спектрометры, счетчики радиоактивности и другие сложнейшие приборы, самым тесным образом взаимодействуют в Институте с микробиологами, ботаниками, биоиспытателями, решая общую задачу поиска и изучения новых природных соединений или выясняя роль и значение тех или иных биомолекул, возможности их использования в медицине и в других областях (например, для решения таксономических задач, в качестве биохимических инструментов и т. д.).
Создание новых лекарственных препаратов на основе фундаментальных исследований в области биоорганической химии
К настоящему времени уже выделены и структурно изучены более 100 тысяч природных соединений, из них из морских организмов — около 13 тысяч. Большое число найденных новых соединений свидетельствует о своеобразии процессов вторичного обмена в морских животных и растениях. Это своеобразие, очевидно, связано с таксономическими особенностями морской биоты [3].
Многие морские природные соединения привлекли значительное внимание своей высокой физиологической активностью. Среди них — самые мощные небелковые токсины, суперактивные антиопухолевые и антивирусные соединения.
В результате исследований морских природных соединений между 1969 и 1999 гг. в странах Европы, США и Японии было подготовлено и получено свыше 300 патентов, касающихся их биомедицинских свойств [14, 17]. Интенсивно такие работы проводились и в СССР, а затем в России Тихоокеанским институтом биоорганической химии ДВО РАН [3]. Так, в Институте были выделены сотни новых морских физиологически активных природных соединений различной химической природы: стероиды [11], терпеноиды [4], алкалоиды [8], гликозиды [3, 18], новые липиды [3, 5], хиноидные соединения [2, 7, 8], полисахариды [3], ферменты [10] и др. Было установлено химическое строение всех этих веществ, включая в ряде случаев и абсолютную стереохимию. Десятки патентов, полученных в Институте, используются при производстве лекарственных субстанций и пищевых композиций.
Показано, что на биохимические реакции, ведущие к так называемым природным соединениям, большое влияние оказали своеобразные условия обитания морских организмов. Морские животные, растения и микроорганизмы живут в водной среде, часто при полном отсутствии солнечного света, при давлениях, достигающих тысячи атмосфер, в условиях сравнительно узкого градиента температур. Биосинтез морских природных соединений иногда сопровождается включением компонент морской среды: галогенид-ионов, сульфат-иона, цианид-иона и др. — из морской воды. Особенно широко распространены бромированные вторичные метаболиты, включая фреоноподобные соединения, синтезируемые некоторыми гид-робионтами в огромных количествах. Ферменты галопероксидазы, осуществляющие галогенирование по реакции:
О^И + Н202 + Х- + И+ ^ Х-О^ + 2Н20,
способны реагировать с самыми различными по химической природе субстратами от пептидов до липидов, что и приводит к значительному разнообразию галогени-рованных морских природных соединений.
В качестве примеров морских галогенированных метаболитов можно привести некоторые соединения, открытые в ТИБОХ: алкалоиды дибромизофакелин и диб-ромагелоспонгин из губок, пибоцины А и В из асцидии Еи^йша Бр., производные дифениловых эфиров и новые дибензодиоксины из ряда губок рода Dysidea и др. [3, 20].
Сера — один из самых распространенных элементов в морской воде после хлора, натрия и магния — также часто включается в морские метаболиты. Так, биохимические системы, сульфатирующие различные субстраты, функционируют в морских микроорганизмах, водорослях, многих типах морских беспозвоночных, полухордовых и рыбах. В настоящее время описано более пятисот различных морских низкомолекулярных природных соединений, несущих от одной до трех сульфатных групп. Значительное число морских вторичных метаболитов содержит полисульфидный фрагмент.
Сотрудники Института выделяли содержащие серу морские метаболиты многократно. Например, ими найдены, изучены и в ряде случаев синтезированы новые полисульфидные алкалоиды поликарпин и варацины из асцидий, несколько групп сульфатированных стероидов и тритерпеноидов из губок и иглокожих.
Среди морских природных соединений больше высокополярных и водорастворимых компонентов по сравнению со вторичными метаболитами наземного происхождения. Так называемые экзометаболиты, выделяемые в среду, в том числе защитные, сигнальные и другие вещества, играют для морских животных значительную
роль, поскольку другие способы коммуникации (зрение, звуковые сигналы) для обитателей морских глубин менее значимы, чем для наземных организмов, из-за недостатка света и высокой плотности среды. Морские экзометаболиты должны быть водорастворимыми, чтобы диффундировать в морской воде от донора к реципиенту химического сигнала. Поэтому в морских организмах часто обнаруживают полярные гликозиды, алкалоиды, различные полигидроксилированные производные, часть из которых выполняет защитную функцию. Некоторые морские метаболиты насыщены атомами кислорода. Такие вещества найдены сотрудниками Института в морских ежах, морских звездах, некоторых других морских беспозвоночных.
Принципиально новые группы морских метаболитов, такие как биполярные сфинголипиды губок, необычные полисахариды морских бактерий, некоторые дополнительно алкилированные стерины, были открыты сотрудниками Института [3]. Их обнаружение свидетельствовало о существовании в морских организмах ранее неизвестных биохимических процессов.
Природные соединения из высших наземных растений изучаются в Институте с момента его основания. Например, широко известны исследования активных субстанций из женьшеня и других представителей семейства аралиевых, тритер-пеновых производных из коры и листьев берез [9], антиоксидантов хиноидной и фенольной природы из различных дальневосточных растений, производных стильбена из маакии амурской [6] и др. Эти работы тесно связаны с развитием направленного органического синтеза [8]. В частности, удалось синтезировать целый ряд физиологически активных гликозидов женьшеня. Исследования в области хе-мотаксономии высших растений под руководством акад. П.Г.Горового позволили уточнить таксономический статус некоторых известных растений. В сотрудничестве с Биолого-почвенным институтом ДВО РАН изучены клеточные культуры лекарственных растений Дальнего Востока России, созданные современными биотехнологическими методами.
Фундаментальные исследования в области биоорганической химии послужили основой для разработки в Институте ряда лекарственных препаратов. Известно, что создание нового лекарства в США и Европе требует огромных финансовых средств: от 50 до 250 млн долл. на один препарат. Наш Институт никогда не имел такого финансирования, но в его стенах созданы 5 лекарственных препаратов, для которых были выполнены все этапы доклинического и клинического исследования. Три из них выпускаются фармацевтической промышленностью страны, два проходят государственную регистрацию. Несколько новых препаратов находятся на тех или иных стадиях доклинического изучения.
Препараты с антиоксидантным действием, рассасывающие кровоизлияния
Активные формы кислорода и окислительный стресс играют важную роль в этиологии и развитии многих заболеваний. Природные антиоксиданты, прежде всего токоферолы (витамин Е), находят широкое применение в медицине для профилактики и в качестве вспомогательного средства при лечении различных патологий [19]. Морские организмы богаты разнообразными антиоксидантами и про-антиоксидантами (проантиоксиданты — вещества, требующие метаболической активации для проявления антиоксидантного действия) [19].
На основе пигментов морских ежей, обладающих антиоксидантными, противо-микробными и противовоспалительными свойствами [2], в нашем Институте были созданы и позднее разрешены к применению в России два новых лекарственных препарата: «Гистохром для офтальмологии» и «Гистохром для кардиологии».
Первый из них показал высокую эффективность лечения гемофтальмов, ожогов и ряда других заболеваний глаз, а второй является кардиопротектором, уменьшающим зону некроза при остром инфаркте миокарда [7]. Способы изготовления и применения этих лекарств были защищены многочисленными патентами, в том числе зарубежными.
Основной компонентой активной субстанции обоих препаратов является известный пигмент эхинохром. Был найден доступный природный источник эхинохро-ма, разработаны препаративные способы синтеза этого пигмента с высоким выходом.
Оба препарата были клинически испытаны в крупнейших медицинских центрах России. К настоящему времени выпущены две промышленные партии этих лекарственных веществ, готовится выпуск третьей.
Двухлетний опыт клинического использования препаратов серии «Гистохром» показал их преимущества по сравнению с применяемыми ранее лекарствами аналогичного назначения. Особенно интересная информация накоплена для офтальмологического средства. Так, показано, что «Гистохром для офтальмологии» с успехом может применяться при гемофтальмах различной этиологии, различных глазных паталогиях детей, катаракте, хирургических операциях на глазах.
Препараты гепатопротекторного действия
В ТИБОХ ДВО РАН из реликтового растения маакии амурской, дерева из семейства бобовых, было выделено около 20 ароматических соединений, обладающих антиоксидантной, антиангиогенетической, противоопухолевой, желчегонной и другими видами физиологической активности. В числе идентифицированных в маакии веществ были изофлавоны генистеин, даидзеин, ретузин, афромозин, фор-мононетин, оробол, текторигенин, 3-гидроксивеститон; птерокарпаны маакиаин, медикарпин [6]. Для маакии амурской, произрастающей в Приморье, характерно высокое содержание в ее древесине мономерных стильбенов резвератрола и пице-атаннола, а также изофлавоностильбена маакиазина. Полярные фракции экстрактов маакии содержат также олигомерные стильбены сцирпусин А, сцирпусин В, маакин, маакин А и стильбенолигнан мааколин [6].
На основе физиологически активных веществ этого уникального растения был создан препарат «Максар» (аббревиатура от фамилий руководителей коллективов-разработчиков О.Б.Максимова и А.С.Саратикова) — малотоксичное гепатоза-щитное и желчегонное средство, прошедшее все необходимые стадии доклинического и клинического исследования [1]. У больных хроническим гепатитом препарат способствовал уменьшению признаков заболевания (повышалась работоспособность, уменьшались боли и диспептические расстройства), снижалась активность аминотрансфераз, щелочной фосфатазы, содержание билирубина в крови, улучшались показатели печеночной структуры по данным ультразвукового исследования, показатели клеточного и гуморального иммунитета. «Максар» предохранял цитохром Р-450 от конверсии в метаболически инертный цитохром Р-420, восстанавливал нормальное течение реакций окисления и конъюгирования с глю-куроновой кислотой. Препарат оказывал также антинекротическое, противовоспалительное и желчегонное действие. У больных повышалось содержание в желчи билирубина и желчных кислот. Желчегонное влияние «Максара» превосходило желчегонный эффект фламина.
По клинической эффективности «Максар» превосходил карсил и другие импортные гепатозащитные средства. На основании результатов клинической апробации Фармакологический государственный комитет МЗ РФ рекомендовал «Мак-
сар» в качестве гепатопротектора для медицинского применения и промышленного выпуска. В 2003 г. в рамках гранта программы «Фундаментальная наука — медицине» была разработана нормативно-техническая документация на этот препарат (фармакопейные статьи и технологические регламенты), усовершенствованы методы его анализа и стандартизации, организован выпуск опытных партий препарата для прохождения фармэкспертизы и регистрации нового лекарственного средства в Министерстве здравоохранения РФ. Процесс регистрации «Максара» находится на завершающей стадии.
Медицинские препараты противоожогового и ранозаживляющего действия
Ранозаживляющие и антиожоговые препараты имеют важное медицинское значение. Некоторые из препаратов этой серии имеют в качестве активных субстанций ферменты, разрушающие некротизированные участки ткани. На основе комплекса коллагенолитических протеаз из гепатопанкреаса камчатского краба (гепа-топанкреас является отходом его промышленной переработки) в ТИБОХ ДВО РАН был создан и после выполнения комплекса доклинических и клинических исследований разрешен Фармацевтическим комитетом России к применению новый лекарственный препарат «Коллагеназа КК». Он был рекомендован как средство ферментативного очищения ран при изъязвлениях и некрозах, включая ожоги, отморожения, гангрены, хронический остеомиелит, варикозные язвы и т. п. [3].
Был осуществлен выпуск первой небольшой промышленной партии «Коллаге-назы КК» на ГУП «Иммунопрепарат» (Уфа). Часть этой партии была реализована через аптечную сеть, а другая ее часть передана безвозмездно в Управление Министерства по чрезвычайным ситуациям г. Москвы, НИИ им. Склифасовского для пострадавших при известном взрыве в подземном переходе, в Ожоговый центр (Омск) для пострадавших при взрыве цистерны с бензином, госпиталь им. Бурденко (Москва) для раненых в период 1-й Чеченской войны и т. д. От всех этих и многих других организаций были получены хорошие отзывы о препарате, что позволяет рекомендовать его для использования в военно-полевой хирургии и для формирования специальных аптечек для гражданской обороны и МЧС.
Опыт клинического применения коллагеназы показывает, что этот препарат, кроме указанных выше областей медицинского применения, может оказаться полезным при лечении хирургами, травматологами, офтальмалогами некоторых других заболеваний и послеоперационных осложнений.
«Коллагеназа КК» и синтетический сорбент «Гелевин» входят в состав нового перевязочного средства «Коллавин». «Коллагеназа КК» и «Гелевин» могут стать прототипами новых лекарственных форм целой серии препаратов для лечения гнойно-некротических патологий, послеоперационных осложнений, в лицевой хирургии и т. п.
В ТИБОХ ДВО РАН была также создана рецептура нового лекарственного препарата «Линимент Полимед», включающего водный раствор высокомолекулярного хитозана, антисептики и стимуляторы регенеративных процессов. Препарат запатентован в России и Белоруссии. На стадии клинических испытаний к работе над препаратом было подключено ОАО «Белмедпрепараты».
Клинические испытания лекарственного средства «Полимед», проведенные на базе 10-й Городской клинической больницы г. Минска Министерства здравоохранения Республики Белоруссии, показали, что при лечения ран и ожогов различной этиологии и различной степени тяжести препарат «Полимед» оказывает выраженный лечебный эффект. Под действием этого препарата ожоги у больных заживали в основном эпителизацией. Лечащими врачами при этом отмечались
самостоятельное очищение ран от некротических тканей и участков поверхностных струпов, а также отсутствие гноя в ранах. Заживление ожоговых ран в 90 % случаев протекало без осложнений. Препарат был разрешен к применению в Белоруссии. В настоящее время проводятся необходимые работы для его регистрации в России.
Препараты с иммуностимулирующими свойствами
Моря, прилегающие к Дальнему Востоку России, богаты различными морскими беспозвоночными. На основе их метаболитов созданы принципиально новые лекарственные препараты. Съедобные виды голотурий (трепанги) широко известны своей биоактивностью. Пищевые продукты из них в странах Восточной Азии сотни лет успешно используются в качестве общеукрепляющих средств (так называемый морской корень), для прекращения кровотечения, лечения артритов и других заболеваний. Химически голотурии отличаются от других организмов наличием так называемых голостановых гликозидов [18], обладающих антигрибковым и иммуномодулирующим действием. В прибрежных водах Дальнего Востока России массовым промысловым видом голотурий является Cucumaria japónica. В нашем Институте изучено химическое строение кукумариозидов из Cucumaria japónica, выполнены исследования иммуномодулирующих и биостимулирующих свойств этих соединений [12, 13], разработан иммуностимулирующий ветеринарный препарат «КД» с защитными свойствами против алеутской болезни норок и других бактериальных и вирусных инфекций. Введение препарата позволяет животным выживать после инъекций таких количеств грамотрицательных бактерий, которые в 3—5 раз превышают смертельную дозу. Была показана выраженная противовирусная активность кукумариозидов, предложено применять кукумариозиды для лечения лучевой болезни. За последние годы сотрудниками ТИБОХ опубликовано 20 статей и получено 2 патента Российской Федерации по вопросам, связанным с кукумариозидами. В то же время медицинских препаратов на основе этих веществ до сих пор не создано. Отчасти это связано с относительно высокой их токсичностью при внутривенном введении и быстрой дезактивацией в желудке, из-за чего при пероральном введении они практически не токсичны, но и мало активны.
В 2003 г. в рамках гранта программы «Фундаментальная наука — медицине» были разработаны новая форма иммуномодулирующего препарата на основе гли-козидов кукумарии японской («Кумазид») и новый метод получения этой субстанции. Наработана ее опытная партия, выполнена серия доклинических испытаний, подтвердивших высокую иммуномоделирующую активность и низкую токсичность «Кумазида».
В Институте в течение многих лет изучались ферменты, гидролизующие полисахариды из бурых водорослей. Было установлено, что некоторые из таких ферментов, выделенных из моллюсков, способны в определенных условиях катализировать обратную реакцию, так называемое трансгликозилирование [10]. При этом можно увеличить молекулярную массу полисахарида и изменить степень его разветвленности. Такой ферментативный синтез новых полисахаридов был осуществлен на основе широко распространенного в бурых водорослях ламинарана. Один из продуктов синтеза был назван «транслам». «Транслам» является глюка-ном, т. е. включает остатки только глюкозы, он совершенно не токсичен и обладает при этом иммуностимулирующим действием. Препарат был запатентован в качестве средства, уменьшающего вредные последствия радиации, причем его действие связано с восстановлением функций иммунной системы. Доклинические
испытания «транслама», выполненные на самых различных животных от крыс до обезьян, дали хорошие результаты.
Перспективы разработки других препаратов
На основе природных соединений наземного происхождения были созданы широко известные противоопухолевые препараты «винбластин» (велбан, розе-вин), «винкристин» (онковин), «навелбин» (винорелбин), «этопосид» (VP-16), «тенипосид» (VM-26), «таксол» (паклитаксел), «таксотер» (доцетаксел), «топоте-кан» (гикамтин), «иринотекан» (кампто) и др. [15]. Удивительно, что по своей химической природе эти вещества принадлежат всего лишь к четырем структурным сериям. Из этих примеров и анализа распространения в различных видах следует, что суперактивные противоопухолевые агенты редко присутствуют в наземных растениях и микроорганизмах, а вероятность нахождения среди этих организмов источников высоко активных противоопухолевых веществ, относящихся к новым структурным сериям, не очень велика.
К настоящему времени усилиями ученых из разных стран установлено строение и изучены свойства нескольких десятков морских природных соединений, представляющих значительный интерес для медицины своим экстремально высоким противоопухолевым действием [14—17]. Они относятся к другим структурным сериям по сравнению с противоопухолевыми веществами растительного происхождения. Например, пептиды доластатины, в частности доластатин 10 из моллюска Dolabella auricularia, в дозе 11 мкг/кг вызывал 80 %-ное выживание подопытных животных с меланомой В16, алкалоид ЕТ-743 из карибской асцидии Ecteinascidia turbinata тормозил развитие опухолей, резистентных к действию других лекарств, и с недавних пор применяется в Европе для лечения сарком и рака груди. Бриостатин-1 из мшанки Begula nerita, ингибитор протеинкиназы С и мощный иммуностимулятор, необычный цереброзид из губки Agelas mauritanius (так называемый KRN 7000), алкалоид бенгамид из губки Jaspis sp., пептид кахалаид F из моллюска Elysia rubefescens, стероид скваламин из акулы Squalus acanthias, 15-членный макролид эпотилон В из миксобактерии Sorangium cellulosum и ряд других морских противоопухолевых соединений находятся на разных стадиях клинического изучения [15].
Таким образом, в результате исследования морских природных соединений число структурных типов природных соединений, которые могут быть использованы при создании антиопухолевых лекарств сами по себе или в качестве моделей для синтетических модификаций, значительно выросло. Это открывает новые возможности для создания более мощных и специфических ингибиторов опухолевого роста.
В нашем Институте изучаются алкалоид поликарпин из асцидии Polycarpa aurata, его производные и синтетические аналоги, проявляющие цитостатические и противоопухолевые свойства. Однако поликарпин имеет неблагоприятный терапевтический индекс; его эффективные дозы близки к токсичным, что тормозит дальнейшие работы по созданию на его основе противоопухолевого средства. В то же время некоторые аналоги этого соединения значительно менее токсичны, но при этом сохраняют тот же уровень активности [3, 8].
Изученные нами алкалоиды варацины А-С из дальневосточной асцидии Polycitor sp. также тормозят деление опухолевых клеток, причем наиболее перспективным в этом отношении является варацин С [3], превосходящий по своему цитотоксическому эффекту применяемые в медицине противоопухолевые препараты. Эта группа веществ интенсивно изучается сейчас в качестве потенциальных противоопухолевых средств.
Большинство препаратов, применяемых для лечения синдрома приобретенного вирусного иммунодефицита человека, — это синтетические производные природных нуклеозидов. Они являются ингибиторами обратной транскриптазы, ключевого фермента вируса иммунодефицита человека. Среди них наиболее известен ази-дотимидин (зидовудин, AZT) [15].
Недавно среди производных бетулина — широко распространенного тритерпе-ноида из коры берез — найдена серия производных бетулиновой кислоты (так называемые DSD и DSB), обладающих сильным ингибирующим действием против вируса иммунодефицита человека [15]. Эти соединения приблизительно в тысячу раз активнее азидотимидина и имеют прекрасные терапевтические индексы. В нашем Институте на протяжении многих лет исследовались производные бетулина и бетулиновой кислоты. В частности, было изучено распространение бетулина, бе-тулиновой кислоты и близких к ним соединений в коре семи видов берез, произрастающих как на Дальнем Востоке, так и в европейской части России [9]. Учитывая, что бетулин является весьма доступным соединением, простой способ его трансформации в бетулиновую кислоту разработан, а также то обстоятельство, что бетулиновая кислота не только исходное вещество для получения противоспидо-вых препаратов, но и обладает свойством избирательно ингибировать развитие некоторых опухолей человека, в том числе меланому, может возникнуть потребность в организации ее производства. Существующий в нашем Институте научный задел позволяет решить эту задачу.
Лечебно-профилактические средства и другие биопрепараты
В последнее время большую популярность приобрели различные лечебно-профилактические средства и пищевые добавки. Они корректируют дефицит витаминов, антиоксидантов и микроэлементов, характерный для питания людей на огромных, в особенности удаленных от центральной части страны территориях, содержат различные природные стимуляторы, пищевые волокна и другие полезные соединения.
Безалкогольные лечебно-профилактические бальзамы серии «Гербамарин» (в настоящее время в ТИБОХ ДВО РАН создано четыре различных варианта таких бальзамов), выпуск которых организован на ОАО «Уссурийский бальзам», содержат экстракты лекарственных растений, разрешенных к использованию Фармакопеей России, и биопрепараты из съедобных видов морских организмов. Различные бальзамы этой серии обладают общеукрепляющим, гепатозащитным, кардиопро-текторным и антидиабетичеким действием соответственно [3].
Изученный в ТИБОХ ДВО РАН «Зостерин», полисахаридный препарат из морских трав, представляющий собой необычный растительный пектин, выпускается с 1986 г., является высокоактивным полианионным сорбентом, связывающим и выводящим из организма ионы тяжелых металлов и проявляющим гипохолестери-немическое, антибактериальное, противоязвенное и антиаллергенное действие. Зостерин является компонентом целого ряда лечебно-профилактических средств, напитков и других продуктов, производимых промышленностью [3].
«Митилан», углевод-белковый комплекс из отходов переработки мидии Crenomytilis grayanus, успешно применяется в качестве биологически активной добавки и гидратанта в составе косметических кремов, выпускаемых фармацевтической промышленностью (фабрики «Линда», «Свобода» и др.) [3].
Таким образом, фундаментальные исследования строения, биогенеза, физиологической активности новых метаболитов морского происхождения в ТИБОХ ДВО РАН, которые проводятся с начала 1970-х годов, создали надежную базу для разработки и внедрения новых лекарств, лечебно-профилактических средств и других биопрепаратов. К настоящему времени целый ряд новых медицинских препаратов, включающих морские природные соединения, либо уже вошел в число средств, применяемых практикующими врачами, либо находится на разных этапах доклинического или клинического изучения.
Изучение молекулярных основ различных патологий
На Дальнем Востоке России еще в 1950-х годах были зарегистрированы вспышки инфекционного заболевания, которое по внешнему сходству со скарлатиной было названо дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой (сейчас более употребительно название «псевдотуберкулез»). Его вызывают бактерии Yersinia pseudotuberculosis. В последние годы заболевания, вызванные иерсиния-ми, включая псевдотуберкулез, занимают важное место в патологии человека и регистрируются повсеместно.
В нашем Институте в лабораториях молекулярных основ антибактериального иммунитета и химии углеводов был выполнен большой объем работ исследований химической структуры и биологической активности отдельных компонентов клеток псевдотуберкулезного микроба, среди которых по физиологическому действию особое место занимают липополисахариды (ЛПС) и липополисахарид-белко-вые комплексы (ЛПБК), локализованные на клеточной поверхности. Именно эти вещества узнаются иммунной системой человека, и на них формируется специфический иммунный ответ. Работы Института в этом направлении вносят важный вклад в решение вопросов патогенеза, эпидемиологии, терапии и диагностики различных иерсиниозов.
Молекулы ЛПС состоят из углеводной (О-специфические полисахариды) и липидной (липид А) частей. Были установлены структуры О-полисахаридов всех серовариантов двух патогенных видов иерсиний: Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis, а также других видов иерсиний. О-Полисахариды Y. pseudotuberculosis сероваров IA, IB, IIC, III, IVB, VA, VB, VI и VII представляют собой нейтральные разветвленные гексозаминогликаны, содержащие в своем составе все известные изомеры 3,6-дидезоксигексоз: абеквозу, аскарилозу, ко-литозу, тивелозу и паратозу. Полисахарид из серовара IB содержит р-паратофу-ранозу, единственный известный пример существования 3,6-дидезоксигексоз в фуранозной форме. Впервые в О-антигенном полисахариде Y. pseudotuberculosis серовара VI идентифицирована разветвленная октоза — 3,6-дидезок-си-4-С-(Б-глицеро-4'-гидроксиэтил)-Б-ксилогексопираноза, названная иерси-ниозой А. В составе О-антигенов Y. enterocolitica и Y. intermedia обнаружен сте-реоизомер этого сахара — иерсиниоза В. Строение иерсиниоз подтверждено встречным синтезом обоих изомеров.
О-Полисахариды двух штаммов Y. enterocolitica представляют собой гомопо-лимеры 6-дезокси-а-Ь-альтрофуранозы с трисахаридным О-ацетилированным по одному из сахаров повторяющимся звеном. В составе антигенных полисахаридов трех штаммов Y. enterocolitica найдены редкие моносахариды D- и Ь-трео-пент-2-улозы, впервые обнаруженные в составе бактериальных полисахаридов.
Полученные результаты обеспечили химическую основу внутривидовой классификации бактерий, что необходимо для идентификации штаммов, вызывающих заболевание.
В наружной мембране ЛПС присутствует в виде ЛПБК, известных также как полные О-соматические антигены, или антигены Буавена. В силу их токсичности для теплокровных животных эти комплексы получили название «эндотоксины». К началу исследований ТИБОХ ДВО РАН они были плохо охарактеризованы химически, не было известно, какое влияние оказывает белок на иммунобиологические свойства ЛПС.
Было выполнено комплексное исследование ЛПБК из двух видов бактерий, принадлежащих к разным семействам: Yersinia pseudotuberculosis (сем. Enterobacteriaceae) и Pseudomonas fluorescens (сем. Pseudomonadaceae). Основной результат проведенных исследований состоит в том, что впервые была предложена модель структурной организации полных О-соматические антигенов с токсическими свойствами из наружной мембраны грамотрицательных бактерий (см. 3-ю сторонку обложки, рис. 1).
На основании полученных данных было сделано заключение, что антигены Буавена представляют собой комплексы ЛПС с белками, которые реально существуют в наружной мембране бактериальной клетки. Биологическую активность антигена Буавена как интактного компонента клетки нельзя свести к активности ЛПС. Более того, собственные свойства ЛПС в комплексе существенно модифицированы.
Интересные результаты были получены при изучении компонентов ЛПС, называемых липидами А [5]. На основе экспериментальных данных был определен минимальный фрагмент молекулы, сохраняющий антигенную активность липи-да А, и впервые получены искусственные антигены, реагирующие с антителами к липиду А.
Широкий спектр биологической активности липида А в сочетании с небольшой молекулярной массой и относительно простым строением стимулировал развитие работ в области синтеза биологически активных аналогов липида А. Среди них следует отметить ряд гликолипидов, родственных по структуре липиду А, на основе хитобиозы и хитоолигосахаридов. Эти гликолипиды нового типа показали при низкой токсичности антиопухолевую и иммуномодулирующую активность. Они являются индукторами интерлейкина-1 и фактора некроза опухолей, обладают рН-зависимыми цитостатическими свойствами.
В последние годы в связи с разработкой химических вакцин, которые имеют важные преимущества перед клеточными вакцинами, но являются слабо иммуно-генными, возникла настоятельная потребность в веществах адъювантного действия, усиливающих эффект вакцинации. Используя опыт получения амфифильных соединений — аналогов липида А, в Институте был синтезирован ряд 4-ацилок-сибутил-1-фосфатов. Соединения, содержащие остатки 3-окси- и 3-миристои-локси-миристиновой кислот, в эксперименте усиливали иммунный ответ к эритроцитам барана в 3—4 раза. Они могут быть рекомендованы для дальнейшего изучения как потенциальные водорастворимые адъюванты, легко выводимые из организма.
Важными компонентами наружной мембраны грамотрицательных бактерий и вторыми по значимости антигенами, определяющими иммунный ответ хозяина на эти бактерии, являются порообразующие белки (порины). Порины обладают широким спектром иммунобиологических свойств и не являются токсинами. Это выгодно отличает их от ЛПС, когда рассматривается вопрос об использовании в медицинской практике [21].
В последние годы на стыке физико-химической биологии и вычислительной техники быстро развивается направление, связанное с изучением пространственной организации и механизмов функционирования белков методами молекулярного моделирования и молекулярной динамики. Определение первичной структуры поринов из разных видов иерсиний (в т. ч. патогенных), выполненное в Институте, и наличие высокогомологичных белков-прототипов с известной пространственной структурой позволяют реализовать этот подход для изучения данных белков. Была построена модель пространственной структуры порина из псевдотуберкулезного микроба (см. 3-ю сторонку обложки, рис. 2). Планируется получить пространственные модели поринов из других видов иерсиний и провести их сравнительный анализ. Работа с этими моделями ш бШсо позволит изучать механизмы функциональной и биологической активности поринов.
На основе белка-порина из У. рБеМоШЬегси^Б разработана и внедрена в практику лечебных учреждений Приморского края иммуноферментная тест-система для диагностики псевдотуберкулеза. Она может быть адаптирована для диагностики кишечных иерсиниозов. Налажен выпуск небольших партий диагности-кума. Получен патент Российской Федерации «Способ диагностики псевдотуберкулеза». Разработан технологичный метод получения порина из псевдотуберкулезного микроба, пригодного для использования в диагностической тест-системе. В настоящее время завершаются работы по получению рекомбинантного порина, который будет использован как диагностический антиген.
Порин из псевдотуберкулезного микроба не токсичен для животных и не обладает пирогенным действием. В то же время он показал высокую протективную активность в экспериментах на лабораторных животных. Все эти обстоятельства позволяют рекомендовать этот порин в качестве основы для создания вакцины против псевдотуберкулеза.
За серию работ «Химическое и иммунохимическое исследование О-соматичес-ких антигенов грамотрицательных бактерий» коллективу авторов из ТИБОХ ДВО РАН была присуждена в свое время премия им. И.И. Мечникова АН СССР. Эти и последующие работы способствовали лучшему пониманию механизмов развития бактериальных инфекций и молекулярных основ антибактериального иммунитета.
Исследования некоторых опухолевых маркеров и молекулярных особенностей функционирования эмбриональных и раковых тканей, выполненные в Институте, освещены в статье д. х. н. П.А.Лукьянова и Н.В.Журавлевой «Современная гликобиология и медицина» в данном выпуске «Вестника ДВО РАН».
Заключение
В ТИБОХ ДВО РАН проводятся фундаментальные исследования, тесно связанные с важнейшими проблемами экспериментальной и клинической медицины. Эти исследования в ряде случаев привели к важным прикладным результатам, в т. ч. к лучшему пониманию молекулярных механизмов некоторых заболеваний, созданию ряда новых лекарственных препаратов и ценных пищевых композиций.
ЛИТЕРАТУРА
1. Белобородова Э.И., Венгеровский А.И., Гайсаев Р.О., Саратиков А.С., Федореев С.А. Новое ге-патозащитное средство — максар // Сибирский журн. гастроэнтерологии и гепатологии. 1999. № 8. С. 443—445.
2. Богуславская Л.В., Храпова Н.Г., Максимов О.Б. Полигидроксинафтохиноны — новый класс природных антиоксидантов // Изв. АН СССР. Сер. хим. 1985. № 7. С. 1471—1475.
3. Еляков Г.Б., Стоник В.А. Морская биоорганическая химия — основа морской биотехнологии // Изв. Акад. наук. Сер. хим. 2003. № 1. C. 1—18.
4. Еляков Г.Б., Стоник. В. А. Терпеноиды морских организмов. М.: Наука, 1986. 226 с.
5. Красикова И.Н., Капустина Н.В., Светашев В.И. и др. Химическая характеристика липида А из некоторых протеобактерий // Биохимия. М., 2001. Т. 66. С. 1047—1054.
6. Кулеш Н.И., Максимов О.Б., Денисенко В.А., Глазунов В.П. Изофлавоноиды из ядровой древесины Maackia amurensis Rupr. et Maxim. // Химия природ. соединений. 2001. № 1. С. 29—31.
7. Мищенко Н.П., Федореев С.А., Багиров В.Л. Новый оригинальный отечественный препарат ги-стохром // Хим.-фармацевт. журн. 2003. Т. 37. С. 49—53.
8. Новиков В.Л. Синтез и свойства вторичных метаболитов некоторых высших растений и морских беспозвоночных и некоторых их производных // Успехи в изучении природных соединений / Ред.
B.А.Стоник. Владивосток: Дальнаука, 1999. С. 33—84.
9. Похило Н.Д., Уварова Н.И. Тритерпеноиды различных видов Betula // Успехи в изучении природных соединений / Ред. В.А. Стоник. Владивосток: Дальнаука, 1999. С. 6—15.
10. Сова В.В., Звягинцева Т.Н., Светашева Т.Г., Бурцева Ю.В., Елякова Л. А. Химическая характеристика гидролиза и трансгликозилирования, катализируемых р-1,3-глюканазами из различных источников // Биохимия. М., 1997. Т. 62. С. 1113—1118.
11. Стоник В.А. Полярные стероиды из морских организмов // Успехи химии. 2001. T. 70.
C. 763—808.
12. Agafonova I.G., Aminin D.L., Avilov S.A., Stonik V.A. Influence of cucumariosides upon intracellular [Ca2+]i and lysosomal activity of macrofages // J. Agric. Food Chem. 2003. Vol. 51. P. 6982—6986.
13. Aminin D.L., Agafonova I.G., Berdyshev E.V., Isachenko E.G., Avilov S.A., Stonik V.A. Immunomodulatory properties of cucumariosides from edible Far-Eastern holothurian Cucumaria japonica // J. Med. Food. 2001. Vol. 4. P. 127—135.
14. Bongiorni L., Pietra F. Marine natural products for industrial application // Chemistry & Industry. 1996. 15 Jan. P. 54—58.
15. Jiu-Hong Wu, Morris-Natschke S.L., Kuo-Hsiung Lee. Progress in the recent discovery and development of promising anticancer and anti-HIV agents from natural products in the United States // J. Chin. Chem. Soc. 2003. Vol. 50. P. 11—22.
16. Newman D.J., Cragg G.M., Snader K.M. Natural products as sources of new drugs over the period 1981—2002 // J. Nat. Prod. 2003. Vol. 66. P. 1022—1037.
17. Proksh P., Erada R.A., Ebel R. Drugs from the sea — current status and microbial applications // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. Vol. 59. P. 125—134.
18. Stonik V.A., Kalinin V.I., Avilov S.A. Toxins from sea cucumbers (holothuroids): chemical structures, biosynthesis, and evolution // J. Nat. Toxins. 1999. Vol. 8. P. 235—248.
19. Takamatsu S., Hodges T.W., Rajbhandari I., Gerwick W.H., Hamman M.T., Nagle D.G. Marine natural products as novel antioxidant prototypes // J. Nat. Prod. 2003. Vol. 66. P. 605—608.
20. Utkina N.K., Denisenko V.A., Virovaya M.V., Scholokova O.V., Prokof'eva N.G. Two new minor polibrominated dibenzo-p-dioxins from the marine sponge Dysidea dendyi // J. Nat. Prod. 2002. Vol. 65. P. 1213—1215.
21. Vostrikova O.P., Novikova O.D., Kim N.Y., Likhatskaya G.N., Solovieva T.F. Pore-forming proteins from Yersinia. Genus Yersinia: entering the functional genomic era // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. Vol. 529. P. 261—263.
