CC BY
391
Фрагментация ДНК в сперматозоидах и ее взаимосвязь с нарушением сперматогенеза
С.А. Руднева1, Е.Е. Брагина1, 2, Е.А. Арифулин2, Т.М. Сорокина1, Л.В. Шилейко1, С.А. Ермолаева1, Л.Ф. Курило1, В.Б. Черных1
ФБГУ«Медико-генетический научный центр» РАМН, Москва; Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского ФГБОУВО «Московский государственный университет им М.В. Ломоносова»
Контакты: Любовь Федоровна Курило kurilo@med-gen.ru
Фрагментация ДНК сперматозоидов — один из факторов нарушения мужской фертильности, открытых недавно. В настоящее время патофизиологические механизмы, приводящие к фрагментации ДНК, еще не до конца изучены. Предполагают, что их причиной могут быть дефекты ремоделирования хроматина, апоптоз и окислительные процессы. Спермиологическое обследование выполнено у 461 мужчины с бесплодием в браке. У 23 % обследованных частота фрагментации ДНК сперматозоидов составляла более 15 %, при этом у 18 % пациентов она находилась в диапазоне от 15,1 до 30 %, а у 5 % — превышала 30 %. Показано, что количество сперматозоидов с фрагментированной ДНК при тяжелых формах патозооспермии выше, чем при менее выраженных нарушениях сперматогенеза. Выявлена отрицательная динамика в изменении концентрации сперматозоидов у мужчин с повышенной частотой фрагментации ДНК. Полученные результаты подтверждают предположение о корреляции между спермиологическими показателями (концентрацией, подвижностью и морфологией сперматозоидов) и частотой фрагментации ДНК в сперматозоидах. Таким образом, можно утверждать, что показатель фрагментации ДНК сперматозоидов имеет определенное диагностическое и прогностическое значение в супружеских парах с нарушением репродукции.
Ключевые слова: мужское бесплодие, патозооспермия, сперматогенез, сперматозоиды, фрагментация ДНК
DNA fragmentation in spermatozoa and its relationship with impaired spermatogenesis
S.A. Rudneva1, E.E. Bragina1,2, E.A. Arifulin2, T.M. Sorokina1, L.V. Shileyko1, S.A. Ermolaeva1, L.F. Kurilo1, V.B. Chernykh1
1Research Centre for Medical Genetics, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow;
2A.N. Belozersky Scientific Research Institute of Physical-Chemical Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University
Sperm cells DNA fragmentation is one of the factors of male sub-/infertility discovered recently. At present, pathophysiological mechanisms that cause DNA fragmentation have not been studied completely. It is suggested that they may be caused with defects of chromatin remodeling, apoptosis, and oxidative stress. Spermiological examination was performed in 461 infertile men. With 23 % of the patients examined, the frequency of sperm cells DNA fragmentation comprises over 15 %, with that, 18 % of the patients demonstrated its range from 15.1 to 30 %, and with 5 % of patients, it exceeded 30 %. We found that the amount of sperm cells with fragmented DNA with severe forms of pathozoospermia is higher that with less manifested disturbances of spermatogenesis. Negative dynamics was revealed regarding the change in sperm concentration in men that have increased frequency of DNA fragmentation. Obtained results confirm the suggestion of the correlation between some semen parameters (concentration, motility, and morphology) and sperm DNA fragmentation. Thus, one can state that the DNA fragmentation parameter of sperm cells has a certain diagnostic and forecasting value for married couples with reproduction disorders.
Key words: male infertility, pathozoospermia, spermatogenesis, sperm DNA fragmentation
Введение
Фрагментация ДНК сперматозоидов — один из важных факторов нарушения мужской фертильности [1—15]. Чем больше в клетке одно- и/или двухце-почечных разрывов ДНК, тем ниже степень целостности генетического материала. Следует отметить, что даже сперматозоиды со значительным количеством повреждений ДНК могут сохранить способность оплодотворять ооциты, однако в дальнейшем эмбри-
ональное развитие может быть нарушено, что зачастую приводит к прерыванию беременности [4, 5, 11, 12, 16—18]. В ряде работ отмечено, что в супружеских парах, в которых мужчины имели высокий (> 30 %) уровень фрагментации ДНК сперматозоидов, были низкими и частота формирования бластоцист, и частота наступления беременности в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и интрацитоплазматиче-ской инъекции сперматозоида (ИКСИ), а также повы-
шена вероятность невынашивания беременности [4, 19, 20]. Важно отметить, что фрагментация ДНК в сперматозоидах часто не оказывает влияния на оплодотворение, но имеет важное значение для формирования бластоцисты и имплантации эмбриона [11, 16, 21]. Ни один другой из рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) параметров эякулята, таких как объем, концентрация, подвижность и морфологические параметры сперматозоидов, не может дать прогноза частоты формирования бластоцист и имплантации [22].
В настоящее время патофизиологические механизмы, приводящие к фрагментации ДНК, еще не до конца изучены. Предполагают, что их причиной могут быть дефекты ремоделирования хроматина, апоптоз и окислительные процессы [3, 4, 6—10, 15, 23, 24]. Известно, что хроматин (ДНК-нуклеопротеиновый комплекс) сперматозоидов организован особым образом, отличающимся от организации хроматина во всех типах соматических клеток. ДНК сперматозоидов высоко конденсирована с помощью особых негистоновых белков — протаминов [7, 24—26]. Такая упаковка ДНК плотнее, чем в метафазных хромосомах. Поэтому объем ядра сперматозоида в 6 раз меньше по сравнению с объемом ядра соматической клетки [7]. Однако в сперматозоидах человека на протамины замещаются не все, а лишь 85—90 % гистонов. Остальные же 10— 15 % гистонов в ядре сперматозоида расположены неслучайным образом: они локализованы в последовательностях ДНК, которые должны быть доступны для транскрипции сразу после оплодотворения, например в промоторах генов, кодирующих некоторые сигнальные белки и участвующих в раннем эмбриональном развитии, а также в импринтированных генах [25].
В ходе ремоделинга хроматина, проходящего с участием топоизомераз, которые катализируют и обеспечивают раскручивание ДНК, возникают ее одно-и двухцепочечные разрывы. Они характерны главным образом для постмейотического созревания при сперматогенезе, но недолго существуют и в зрелых сперматозоидах. Таким образом, начало конденсации хроматина сопровождается увеличением числа разрывов в ДНК, затем разрывы репарируются, а их лигирова-ние обеспечивается транзиторными белками [7, 24]. В процессе эпидидимального транспорта сперматозоидов цистеиновые группы протаминов окисляются, образуя дисульфидные связи, которые стабилизируют и компактизуют хроматин. Процесс компактизации хроматина играет важную роль в формировании головки сперматозоида, инактивации транскрипции мужского генома, защите и стабилизации ДНК сперматозоида [26]. Поэтому нерепарированные разрывы ДНК, возникающие в ходе ремоделирования хроматина, рассматривают как один из главных источников разрывов ДНК в сперматозоидах. Их наличие свидетель-
ствует о том, что процесс созревания гаметы не завершился должным образом.
Присутствие разрывов в ДНК может отражать и выраженность апоптоза — генетически программируемой клеточной гибели. В ходе сперматогенеза элиминация половых клеток с различными нарушениями путем апоптоза является нормальным процессом. В норме в 75 % сперматогониев запускается процесс апоптоза [23]. Погибшие в результате этого клетки или фагоцитируются клетками Сертоли, или выходят в просвет семенных канальцев. При нарушении сперматогенеза число половых клеток, вступающих в апоп-тоз, возрастает. Таким образом, разрывы ДНК, выявляемые в эякулированных сперматозоидах, могут являться как следствием дефектов созревания в ходе сперматогенеза (репарации и ремоделинга хроматина), так и маркерами, факторами запуска апоптоза.
Еще одной причиной появления разрывов в ДНК сперматозоидов служит окислительный стресс, который представляет собой процесс повреждения клетки в результате возникновения избыточного уровня свободных радикалов [3, 27]. При этом активные формы кислорода (АФК) являются основными компонентами, участвующими в нарушении окислительно-восстановительного статуса клетки. Мишенью АФК является ДНК сперматозоида. Появление модифицированных в результате окисления оснований ДНК дестабилизирует структуру макромолекулы, приводя к появлению ее разрывов [28]. Поскольку сперматозоид является высокоспециализированной клеткой с минимальным количеством цитоплазмы, внеклеточная антиоксидант-ная защита является основной, особенно в период дозревания сперматозоида в придатке яичка. Снижение уровня антиоксидантов в секретах половых путей приводит к окислительному стрессу и увеличению частоты разрывов в ДНК сперматозоидов, и как следствие — к снижению мужской фертильности.
Предположение о наличии корреляции между параметрами сперматозоидов и частотой фрагментации ДНК в них было выдвинуто на основании того, что важная роль апоптоза в соматических клетках состоит в устранении дефектных клеток. ДНК разрушается в аномальных половых клетках по аналогии с различными типами соматических клеток [15]. Аномалии хроматина в сперматозоидах часто ассоциированы со сниженными показателями спермограммы, однако многие исследователи констатируют, что частота фрагментации ДНК не имеет четкой зависимости от основных параметров, рекомендованных ВОЗ при спермиологическом исследовании (концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов) [3—5]. Сперматозоид, оцененный как «морфологически нормальный» (с использованием световой фазово-контрастной микроскопии), может иметь поврежденную ДНК, и наоборот. В других исследованиях выявлены отрицательные корреляции
Е га Е
и
между частотой фрагментации ДНК и данными параметрами спермограммы, однако во всех приведенных исследованиях были небольшие выборки [11]. Поэтому целью нашей работы стало выявление корреляции между основными параметрами (количество, подвижность и доля атипичных форм) сперматозоидов и повышенной частотой фрагментации ДНК на крупной выборке пациентов.
Материалы и методы
Группу обследованных составил 461 мужчина с диагнозом «бесплодие в браке». Обследование включало: клиническое, стандартное спермиологическое и специальное спермиологическое исследования (анализ фрагментации ДНК с помощью метода TUNEL).
Критериями отбора пациентов служили:
1) первичное и вторичное бесплодие у мужчин, наличие невынашивания беременности у их жен, замершая беременность, неудачные попытки ЭКО;
2) отсутствие в анамнезе и по данным обследования явных причин мужского бесплодия: аномалий кариотипа, непроходимости семявыносящих путей.
Спермиологический анализ эякулята выполняли по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ (1999) [22]. При анализе эякулята оценивали: объем.
цвет, консистенцию, рН, концентрацию сперматозоидов в 1 мл эякулята и их общее количество, степень подвижности, количественный анализ патологических форм сперматозоидов.
Фрагментацию ДНК определяли методом TUNEL на мазках эякулята. Образцы спермы наносили на адгезивные стекла (Histo Bond) и обрабатывали по протоколу фирмы-изготовителя (DеadEndTM Fluorometric TUNEL System, PROMEGA). Препараты окрашивали DAPI (4,6-diamino-2-phenylidole, Sigma) для специфической окраски ДНК. Визуальную оценку осуществляли с помощью микроскопа Axiovert 200V (Carl Zeiss).
Результаты
Уровень фрагментации ДНК в сперматозоидах у обследованных нами мужчин с нарушением репродуктивной функции варьировал от 1 до 84 %. Средний уровень составил 12,6 %. На рис. 1 показан график распределения пациентов с различной степенью фрагментации ДНК сперматозоидов.
Наглядно видно, что частотный максимум приходился на область от 4 до 14 %, при этом у 23 % мужчин с бесплодием частота фрагментации ДНК сперматозоидов была выше нормы, у 18 % пациентов находи-
т а т
u
60
50
40
30
20
10
I II .1 !■■■■
Г Г Г Г ГТТТТТТГ Г Г Г Г Г Г ГT T Г Г Г Г Г Г Г I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85
Уровень фрагментации ДНК сперматозоидов, %
0
Рис. 1. Распределение частоты встречаемости пациентов с различной степенью фрагментации ДНК в сперматозоидах
□ 77 %
□ Фра™. ДНК 0-15 %
□ Фра™. ДНК 15-30 % ■ Фра™. ДНК > 30 %
2 % 3 % 3 <
□ 18 %
5 %
20 %
Рис. 2. Встречаемость различной степени фрагментации ДНК сперматозоидов среди мужчин с нарушением репродуктивной функции (n = 461)
лась в диапазоне от 15 до 30 %, а у 5 % превышала 30 %-ный уровень (рис. 2).
Для дальнейшего спермиологического анализа нами было отобрано 94 пациента. На основании собственных и литературных данных о пороговых уровнях фрагментации ДНК в сперматозоидах [25] обследованные нами пациенты с различным состоянием репродуктивной функции были разделены на 3 группы. Первую группу составили мужчины с уровнем фрагментации ДНК в пределах нормы, т. е. < 15 % (n = 42, возраст мужчин варьировал от 29 до 49 лет, средний возраст — 35 лет); 2-ю группу — мужчины, у которых уровень фрагментации ДНК сперматозоидов находился в диапазоне от 15,1 до 30 % (n = 41, возраст от 27 до 51 года, средний возраст — 37 лет); и 3-ю группу — мужчины, у которых уровень фрагментации ДНК сперматозоидов превышал 30 % (n = 11, возраст от 37 до 51 года, средний возраст — 40 лет). В каждой из этих групп по результатам стандартного спермиологического анализа определена структура патозооспермии, характеризующаяся соотношением (частотой встречаемости) различных ее форм.
Среди пациентов со степенью фрагментации ДНК сперматозоидов в пределах нормы (0—15 %) выявленные формы патозооспермии были представлены астено-тератозооспермией (АТ) и олигоастенотератозооспер-мией (ОАТ) различной степени тяжести (рис. 3). Число
57
15 %
■ ОАТ III степени
■ ОАТ II степени
□ ОАТ I степени
□ АТ
■ Тератозооспермия
□ Полизооспермия
Рис. 4. Формы патозооспермии у мужчин с бесплодием, имеющих фрагментацию ДНК сперматозоидов от 15,1 до 30 %. ОАТ Iстепени — 10—20млн/мл, OATIIстепени — 5—9,9 млн/мл, OAT III степени — 0,1—4,9 млн/мл
пациентов с АТ и ОАТ составило 82 и 18 % соответственно, при этом тяжелые формы ОАТ (II и III степени тяжести) отмечены лишь у 4 % пациентов со степенью фрагментации ДНК сперматозоидов в пределах нормы.
Среди мужчин, у которых частота фрагментации ДНК сперматозоидов находилась в диапазоне от 15,1 до 30 %, количество пациентов с АТ было меньше и составило 57 % (рис. 4), тогда как на долю пациентов с ОАТ приходилось 38 %, при этом количество пациентов с тяжелыми формами ОАТ (II и III степени тяжести) было больше и составило 23 %. Кроме того, в структуре патозооспермии встречались такие формы, как тератозооспермия и полизооспермия, на которые приходилось 2 и 3 % соответственно.
Среди мужчин с частотой фрагментации ДНК в сперматозоидах более 30 % АТ выявлена у 62 % пациентов (рис. 5). ОАТ диагностирована у 28 % мужчин данной группы, при этом число пациентов с ОАТ II степени тяжести составило 18 %, а больных с тератозооспермией — 10 %.
10 %
I ОАТ III степени
■ ОАТ II степени
□ ОАТ I степени
□ АТ
82 %
Рис. 3. Формы патозооспермии у мужчин с бесплодием, имеющих фрагментацию ДНК сперматозоидов от 0 до 15 %. ОАТ I степени -10-20 млн/мл, OAT II степени — 5-9,9 млн/мл, OAT III степени — 0,1—4,9 млн/мл
18 %
■ ОАТ II степени 10 % □ ОАТ I степени
□ АТ
■ Тератозооспермия
62 %
Рис. 5. Формы патозооспермии у мужчин с бесплодием, имеющих фрагментацию ДНК сперматозоидов более 30 %. ОАТ I степени — 10—20млн/мл, OATII степени — 5—9,9млн/мл
Е га Е
и
Е га Е
100 % 90 % 80 % 70 % 60 % 50 % 40 % 30 % 20 % 10 % 0 %
■ Фр. ДНК >30%
■ Фр. ДНК 15,1-30% □ Фр. ДНК 0-15%
50 %
40 %
30 %
20 %
I
I
ы
□ Фр. ДНК 0-15%
■ Фр. ДНК 15,1-30%
■ Фр. ДНК >30%
> 20 млн/мл
Рис. 6. Долевое распределение пациентов с различной частотой фрагментации ДНК при различной концентрации сперматозоидов
На рис. 6 показано распределение количества пациентов с различным уровнем фрагментации ДНК и концентрацией сперматозоидов. Наглядно видно, что среди мужчин, имеющих концентрацию сперматозоидов < 20 млн/мл, количество пациентов, у которых частота фрагментации ДНК сперматозоидов выше нормы, линейно зависит от концентрации сперматозоидов, при этом степень тяжести олигозооспермии обратно пропорциональна количеству мужчин с повышенным уровнем фрагментации ДНК. Таким образом, показано, что степень тяжести нарушения сперматогенеза коррелирует с частотой фрагментации ДНК в сперматозоидах. Чем тяжелее форма олигозооспермии, тем больше вероятность того, что частота фрагментации ДНК сперматозоидов пациента превышает 15 %.
Среди мужчин с нарушением репродукции, имеющих концентрацию сперматозоидов в эякуляте > 20 млн/мл, у 63 % пациентов уровень фрагментации ДНК сперматозоидов превышал нормативные показатели. Можно предположить, что повышение уровня фрагментации ДНК в мужских гаметах при нормальной концентрации сперматозоидов преимущественно связано не с активацией апоптоза и элиминацией поврежденных сперматозоидов, а, вероятно, обусловлено
100 % 95-99 % 90-94 % 89-85 % 84-80 % < 80 %
Рис. 7. Распределение количества пациентов (ось ординат) в зависимости от частоты фрагментации ДНК и количества атипичных сперматозоидов (ось абсцисс)
другими причинами возникновения разрывов в ДНК: окислительным стрессом и/или нарушением в ремо-делировании хроматина.
Следует особо отметить, что у 9 из обследованных нами мужчин, у которых обнаружена повышенная частота фрагментации ДНК, при повторных исследованиях мы наблюдали снижение концентрации сперматозоидов. В таблице приведены данные по динамике концентрации сперматозоидов у пациента Г. М. с повышенной частотой фрагментации ДНК в сперматозоидах (58 %) и (для сравнения) данные пациента Н. Е. (контроль) с частотой фрагментации ДНК, находящейся в пределах нормы (9,6 %).
На рис. 7 и 8 показано распределение обследованных мужчин в зависимости от частоты фрагментации ДНК и доли атипичных сперматозоидов соответственно. На рис. 7 наглядно видно, что встречаемость повышенной частоты (> 15 %) фрагментации ДНК имеет единственный максимум в области 95—99 % морфологически аномальных сперматозоидов с последующим выраженным снижением в области значений атипии гамет 94 % и менее. При этом характер распределения различного количества сперматозоидов у пациентов с уровнем фрагментации от 15,1 до 30 % и > 30 % в целом сходен.
Изменения концентрации сперматозоидов в динамике у пациентов с различной степенью фрагментации ДНК
и Пациент Г. М. (фрагментация ДНК 58 %) Пациент Н. Е. (условный контроль) (фрагментация ДНК 9,6 %)
е концентрация сперматозоидов, млн / мл дата обследования концентрация сперматозоидов, млн/мл дата обследования
•а 17,0 05.11.2009 16,5 09.12.2009
га 8,0 04.03.2010 10,4 23.04.2010
8,5 31.09.2010 20,5 21.05.2010
= 6,75 26.05.2011 19,5 28.06.2010
о 1,85 03.09.2013 16,0 20.09.2010
70 %
60 %
10%
40%
20%
II
■ Фр. ДНК >30 %
■ Фр.ДНК 15,1-30% □ Фр. ДНК 0-15%
40 % 35 % 30% 25 % 20%
III
Н6
0-5% 5,1-10% 10,1- 15,115 % 20 %
20,1- 30,1- >40% 30 % 40%
Рис. 9. Распределение количества пациентов в зависимости от частоты фрагментации ДНК и степени подвижности сперматозоидов
□ Фр.ДНК 0-15%
%4-80 % <80 %
Рис. 8. Долевое распределение пациентов в зависимости от частоты фрагментации ДНК и количества атипичных сперматозоидов
У большей части мужчин с фрагментацией ДНК сперматозоидов от 15,1 до 30 % и > 30 % (54 и 64 % соответственно) количество атипичных гамет составило 95—100 %, причем тотальную тератозооспермию (т. е. количество морфологически нормальных сперматозоидов 0 %) отмечали у 20 и 28 % пациентов данных групп соответственно (см. рис. 8). У пациентов с частотой фрагментации ДНК сперматозоидов ниже нормы график зависимости числа пациентов от количества морфологически аномальных сперматозоидов имел менее выраженное неравномерное распределение.
Как видно из данных, приведенных на рис. 8, повышенное количество сперматозоидов с фрагменти-рованной ДНК обнаружено у 87 % пациентов с тотальной тератозооспермией. Среди мужчин с различным количеством атипичных сперматозоидов встречаемость повышенного уровня фрагментации ДНК линейно зависит от количества аномальных гамет. Таким образом, нами показано, что количество атипичных сперматозоидов, по крайней мере в диапазоне от 80 до 100 %, коррелирует с частотой фрагментации ДНК.
50% 45 %
□ Фр.ДНК 0-15%
■ Фр.ДНК 15,1-30%
■ Фр.ДНК >30%
100% 90% 80 % 70%
■ Фр.ДНК >30% 60%
■ Фр.ДНК 15,1-30% 50%
40 % 30 % 20 % 10% 0
20% 30% 30,1- > 40%' 40 %
Рис. 10. Долевое распределение количества пациентов в зависимости от частоты фрагментации ДНК и степени подвижности сперматозоидов
Чем больше количество атипичных сперматозоидов, тем выше вероятность того, что доля сперматозоидов с фрагментацией ДНК превышает норму (15 %). Однако и среди мужчин, у которых количество типичных сперматозоидов составило более 20 %, число пациентов, у которых фрагментация ДНК сперматозоидов была выше нормы, составило 77 %.
Нами также была оценена зависимость частоты фрагментации ДНК сперматозоидов от степени их подвижности (рис. 9, 10). На рис. 9 представлено распределение количества пациентов в зависимости от частоты фрагментации ДНК и степени подвижности сперматозоидов. У пациентов с высокой степенью фрагментации ДНК сперматозоидов (> 30 %) график имеет экспоненциальный вид с максимумом в интервале подвижности 0—5 %. У большинства (45 %) мужчин данной группы доля прогрессивно-подвижных сперматозоидов составила менее 5 %. График зависимости числа пациентов (степень фрагментации ДНК у которых была в диапазоне от 15 до 30 %) от степени подвижности сперматозоидов имеет два максимума. Первый максимум (24 % пациентов данной группы) отмечен при количестве подвижных сперматозоидов 0—5 %. Второй максимум (29 % пациентов с той же частотой фрагментации) наблюдали при количестве подвижных сперматозоидов от 20 до 30 %. График зависимости доли пациентов с нормальным уровнем фрагментации от количества подвижных сперматозоидов имеет единственный сдвинутый максимум. Значительная часть (30 %) пациентов данной группы имели количество подвижных сперматозоидов в диапазоне от 30 до 40 %.
Среди мужчин с числом подвижных сперматозоидов менее 5 % количество пациентов с повышенной фрагментацией ДНК составило 91 % (см. рис. 10). Рассматривая группы мужчин, у которых степень подвижности сперматозоидов находилась в диапазоне от 0
Е га Е
и
80 %
0%
15%
Е га Е
U
до 20 %, видно, что число пациентов c превышающей норму частотой фрагментации ДНК сперматозоидов увеличивалось среди тех групп мужчин, у которых подвижность сперматозоидов была ниже. Среди пациентов с количеством подвижных сперматозоидов более 20 % доля мужчин с повышенным уровнем фрагментации ДНК составила 73 %. Повышенная частота фрагментации ДНК у пациентов с высокой подвижностью сперматозоидов, так же как это было и при высоких концентрациях сперматозоидов, не может объясняться факторами апоптоза, связанными с элиминацией поврежденных сперматозоидов, а, возможно, связана с окислительным стрессом или нарушением в ремоде-лировании хроматина.
Обсуждение
Полученные нами данные подтверждают предположение об определенной взаимосвязи между основными параметрами сперматозоидов (их концентрацией, подвижностью и морфологией) и частотой фрагментации их ядерной ДНК. Показано, что степень нарушения сперматогенеза прямо коррелирует с частотой фрагментации ДНК в мужских гаметах. Чем тяжелее олигозооспермия, тем больше вероятность того, что частота фрагментации ДНК в сперматозоидах будет выше нормы. Сходные результаты получены нами и по показателям подвижности и морфологии сперматозоидов. Так, количество прогрессивно-подвижных сперматозоидов (в диапазоне от 0 до 20 %) обратно коррелировало с уровнем фрагментации ДНК. Количество атипичных сперматозоидов (в диапазоне от 80 до 100 % морфологически аномальных сперматозоидов) прямо коррелировало с частотой фрагментации ДНК. Таким образом, чем меньше подвижных и больше морфологически аномальных сперматозоидов в эякуляте, тем больше вероятность повышенной частоты фрагментации ДНК в них.
В то же время следует отметить, что среди мужчин с нарушением репродуктивной функции, имеющих различные формы патозооспермии, в том числе тяжелые, есть пациенты, не имеющие повышенного уровня фрагментации ДНК в гаметах: при олигозооспермии III степени тяжести — 5 %, II степени тяжести — 17 %, I степени тяжести — 56 %, при тератозооспермии — 37 %.
Основные параметры эякулята, такие как концентрация сперматозоидов, подвижность и количество морфологически нормальных форм сперматозоидов, несомненно, имеют важное прогностическое и диагностическое значение в отношении оценки фертиль-ности. Однако по результатам стандартного спермио-логического исследования нельзя судить о состоянии генома сперматозоида, поскольку мы обнаружили значительное увеличение частоты фрагментированной ДНК в мужских гаметах при рассмотрении отдельных показателей спермограммы (концентрации и подвиж-
ности сперматозоидов, доли морфологически нормальных их форм), находящихся в пределах нормы. Важная роль в увеличении частоты фрагментирован-ной ДНК в мужских гаметах при нормальных показателях спермограммы и идиопатическом бесплодии отведена окислительному стрессу и нарушениям в процессе ремоделинга хроматина. Его целостность является внутренним параметром повреждения сперматозоидов, который нельзя выявить с помощью обычного спермиологического исследования и который имеет прогностическое значение в отношении успешности лечения и/или решения проблемы деторождения с помощью методов вспомогательной репродукции [20].
Анализ данных литературы свидетельствует о том, что увеличение количества сперматозоидов с фрагмен-тированной ДНК коррелирует с частотой прерывания беременности вне зависимости от метода искусственного оплодотворения. Так, при увеличении количества сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте частота спонтанного прерывания беременности достигает около 37 %, но если количество сперматозоидов с поврежденной ДНК в эякуляте в норме, то частота спонтанных абортов составляет лишь 10 % [29]. Кроме того, нарушение целостности ДНК сперматозоидов может служить причиной появления врожденных пороков развития и генетических заболеваний плода. При оплодотворении ооцита сперматозоидом с фрагментирован-ной ДНК системы репарации ооцита могут исправить около 8 % повреждений ДНК сперматозоида [12]. Однако репарация ДНК с ошибками может привести к появлению точковых мутаций и делеций. Действительно, показано, что до 80 % структурных перестроек хромосом, возникших de novo, имеют отцовское происхождение [30]. Кроме того, у детей, в эякуляте отцов которых число сперматозоидов с фрагментированной ДНК было повышено, частота раковых заболеваний в раннем возрасте в 4—5 раз выше популяционной [29].
Одним из представляющих особый научный интерес и практическое значение результатов данного исследования является то, что у мужчин с частотой фрагментации ДНК > 30 % отмечено выраженное снижение концентрации сперматозоидов с возрастом. Изменения параметров эякулята в динамике у мужчин с повышенной частотой фрагментации ДНК сперматозоидов ранее практически не исследовали. Ухудшение показателей количества и качества сперматозоидов у мужчин с повышенной частотой фрагментации ДНК в мужских гаметах требует дальнейшего исследования, а также поднимает вопрос о целесообразности крио-консервации сперматозоидов у данной группы пациентов для дальнейшего их использования при искусственном оплодотворении.
В последнее время широко развиваются методы преодоления повышенной частоты фрагментации
ДНК в сперматозоидах. В некоторых исследованиях показано, что введение антиоксидантов может снизить уровень фрагментации ДНК сперматозоидов. Это подтверждает гипотезу о том, что механизм возникновения разрывов часто связан с окислительным стрессом. Кроме того, для преодоления высоких показателей фрагментации ДНК в сперматозоидах из эякулята предложено использование для оплодотворения тестикулярных сперматозоидов [24]. Снижение высокого уровня фрагментации ДНК сперматозоидов с помощью терапии и использования методов вспомогательной репродукции в ряде случаев помогает преодолеть нарушение фертильности у мужчин.
Заключение
Следует сказать, что показатель фрагментации ДНК сперматозоидов имеет определенное диагностическое и прогностическое значение в супружеских парах с нарушением репродукции. Особенно это исследование актуально для мужчин с показателями спермограммы, близкими к нормальным, у которых не обнаружено нарушений в кариотипе или других явных причин бесплодия, в случаях неудачных попыток ЭКО, ИКСИ или привычного невынашивания. Исследование фрагментации ДНК сперматозоидов является дополнительным эффективным диагностическим методом, выявляющим нарушения фертильности у мужчин.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьева О.А., Филатов М.В., Леонтьева О.А. Значение анализа организации хроматина ядер сперматозоидов
в диагностике мужского бесплодия. Проблемы репродукции 1997;(4):23—7.
2. Воробьева О.А., Воскресенская А.В., Одинцов А.А., Филатов М.В. Мужское бесплодие и нарушение структурной организации хроматина сперматозоидов. Существует ли связь? Проблемы репродукции 2005;(6):56-62.
3. Маркова Е.В., Замай А.С. Фрагментация ДНК в сперматозоидах человека. Проблемы репродукции 2006;(4):42—50.
4. Шильникова Е.М., Мазилина М.А., Федорова И.Д. Нарушение целостности ДНК сперматозоидов человека: причины, методы исследования, влияние на исход программ ВРТ (обзор литературы). Медицинская генетика (принято к печати).
5. Lopes S., Sun J.G., Jurisicova A. et al. Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation is increased in poor-quality semen samples and correlates with failed fertilization in intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 1998;69(3):528—32.
6. Barroso G., Morshedi M., Oehninger S. Analysis of DNA fragmentation, plasma membrane translocation of phosphatidylserine and oxidative stress in human spermatozoa. Hum Reprod 2000;15(6):1338-44.
7. Fuentes-Mascorro G., Serrano H., Rosado A. Sperm chromatin. Arch Androl 2000;45(3):215-25.
8. Gandini L., Lombardo F., Paoli D. et al. Study of apoptotic DNA fragmentation in human spermatozoa. Hum Reprod 2000;15(4):830-9.
9. Aitken R.J., Krausz C. Oxidative stress, DNA damage and Y chromosome. Reproduction 2001;122(4):497-506.
10. Agarwal A., Said T.M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Hum Reprod 2003;19(4):331-45.
11. Benchaib M., Braun V., Lornage J. et al. Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique. Hum Reprod 2003;18(5):1023-8.
12. Carrell D.T., Liu L., Peterson C.M. et al. Sperm DNA fragmentation is increased in couples with unexplained recurrent pregnancy loss. Arch Androl 2003;49(1):49-55.
13. Giwercman A., Richthoff J., Hjellund H. et al. Correlation between sperm motility and sperm chromatin structure assay parameters. Fertil Steril 2003;80(6):1404-12.
14. Henkel R., Kierspel E., Hajimohammad M. et al. DNA fragmentation of spermatozoa and assisted reproduction technology. Reprod Biomed Online 2003;7(4):477-84.
15. Wang X., Sharma R.K., Sikka S.C. et al. Oxidative stress is associated with increased apoptosis leading to spermatozoa DNA damage in patients with male factor infertility. Fertil Steril 2003;80(3):531-5.
16. Ahmadi A., Ng S.C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J Exp Zool 1999;284(6):696-704.
17. Sakkas D. The use of blastocyst culture to avoid inheritance of an abnormal paternal genome after ICSI. Hum Reprod 1999;14(1):4-5.
18. Henkel R., Hajimohammad M., Stalf T. et al. Influence of deoxyribonucleic acid damage on fertilization and pregnancy. Fertil Steril 2004;81(4):965-72.
19. Virro M.R., Larson-Cook K.L., Evenson D.P. Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril 2004;81(5):1289-95.
20. Seli E., Sakkas D. Spermatozoal nuclear determinants of reproductive outcome: implications for ART. Hum Reprod Update 2005;11(4):337-49.
21. Seli E., Gargner D.K., Schoolcraft W.B. et al. Extent of nuclear DNA damage
in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in vitro fertilization. Fertil Steril 2004;82(2):378-83.
22. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. 4-е изд. Пер. с англ. Р.А. Нерсеяна под научн. ред. рус. перевода Л.Ф. Курило. М.: Изд-во «МедПресс», 2001. 144 с.
23. Oldereid N.B., Angelis P.D., Wiger R., Clausen O.P. Expression of Bcl-2 family proteins and spontaneous apoptosis in normal human testis. Mol Hum Reprod 2001;7(5):403-8.
24. Boissonneault G. Chromatin remodeling during spermiogenesis: a possible role for the transition proteins in DNA strand break repair. FEBS Lett 2002;514(2-3):111-4.
25. Bench G.S., Friz A.M., Corzett M.H. et al. DNA and total protamine masses in individual sperm from fertile mammalian subjects. Cytometry 1996;23(4):263-71.
26. Govin J., Caron C., Lestrat C. et al.
The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur J Biochem 2004;271(17):3459-69.
27. Barnes F., Rabara F., Murphy A. et al. Live births after IVF in men with a DNA fragmentation index of 30% or greater
as determined by the sperm chromatin structure assay (SCSA™). Fertil Steril 2004;82(Suppl 2):S47.
28. Buyalos R., Hubert G., Schiewe M.C. Poor fertility predictive value of the sperm chromatin structure assay (SCSA)
is neutralized by sperm injection: case studies. Fertil Steril 2004;81:(Suppl 3):27-8.
29. Biological and clinical applications in male infertility and assisted reproduction. A. Zini, A. Agarwal (eds.). Springer, 2011. 512 p.
30. Thomas N.S, Durkie M., Van Zyl B. et al. Parental and chromosomal origin of unbalanced de novo structural chromosome abnormalities in man. Hum Genet 2006;119(4):444-50.
E
W
E
u
