CC BY
60
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2018. T. 73. № 1. С. 29-33
29
МЕТОДЫ
УДК 576.535:57.089.67
ФОТООТВЕРЖДАЕМЫЕ ГИДРОГЕЛИ, СОДЕРЖАЩИЕ СПИДРОИН
ИЛИ ФИБРОИН
И.В. Бессонов1, М.С. Котлярова1*, М.Н. Копицына1, А.В. Федулов2,
А.М. Мойсенович1, А.Ю. Архипова3, В.Г. Богуш4, Д.В. Багров1, А.А. Рамонова3, А.Е. Машков2, К.В. Шайтан1, М.М. Мойсенович3
1Кафедра биоинженерии и 3лаборатория конфокальной микроскопии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12;
2Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского, Россия, 129110, г. Москва, ул. Щепкина, д. 61/2, корп. 1;
4Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов национального исследовательского центра «Курчатовский институт», Россия, 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1 *e-mail: kotlyarova.ms@gmail.com
Получены биосовместимые фотоотверждаемые гидрогели, состоящие из метакри-лированного желатина и белков шелка (рекомбинантного аналога спидроина каркасной нити паутины Nephila clavipes и фиброина шелка из коконов тутового шелкопряда Bombyx mori). Данные полимеры характеризуются высокой биосовместимостью и способностью к биодеградации, что обуславливает возможность их применения в тканевой инженерии. Гидрогели были изготовлены двумя способами, позволяющими получать либо изделия большого размера, либо микроструктуры заданной формы. Для изготовления объемных гидрогелей образцы фотополимеризовали в свете ультрафиолетовой лампы в течение 10 мин. В результате были получены образцы гидрогелей, представляющие собой диски диаметром 13 мм. Методом сканирующей электронной микроскопии было показано, что они обладают пористой структурой. Микроструктуры были сформированы на покровном стекле с использованием лазера с длиной волны 405 нм микроскопа Eclipse Ti-E с конфокальным модулем А1 (Nikon, Япония). Данный подход позволяет контролировать топографические особенности получаемых субстратов, он применим для создания микроструктурированных поверхностей, которые могут быть использованы для изучения взаимодействия клеток с субстратом.
Ключевые слова: гидрогели, фотополимеризация, спидроин, фиброин, тканевая инженерия, метакрилированный желатин
Фотоотверждаемые материалы затвердевают при облучении светом определенной области спектра. Их использование в биомедицинских исследованиях представляет интерес как в фундаментальном, так и в прикладном аспекте. Так, они могут являться основой микроструктурированных поверхностей с контролируемой топографией и распределением лигандов для клеточных рецепторов, что позволяет моделировать различные биологические процессы, например, рост аксонов [1]. Также фотоотверждение лежит в основе ряда аддитивных технологий, позволяющих создавать трехмерные структуры с субмикронной точностью позиционирования [2].
Одной из наиболее востребованных областей применения фотоотверждаемых материалов является получение скаффолдов для тканевой инженерии, направленной на поиск эффективных подходов к восстановлению повреждений в различных тканях и органах. Скаффолды играют роль искус-
ственного внеклеточного матрикса, на основе которого формируется ткань, поэтому большое значение имеет материал, из которого они состоят.
Метакрилированный желатин является фотоот-верждаемым материалом, который широко используется для различных биомедицинских приложений вследствие его нетоксичности, биодеградируемости и возможности контролировать его свойства [3]. Однако даже химически сшитые гидрогели, сформированные из этого полимера, не обладают необходимыми механическими свойствами, а также имеют высокие коэффициент набухания и скорость биодеградации. Один из подходов к решению этой проблемы был предложен ранее: в водный раствор метакрилированного желатина перед проведением фотополимеризации добавляли небольшие количества (5—20%) фиброина шелка [4]. В результате получали гидрогели, обладающие структурой взаимопроникающих сеток. В их состав входят химически сшитый по двойным связям С=С-полимер
на основе метакрилированного желатина и физически сшитый благодаря формированию бета-структур фиброин шелка. Такой состав обеспечивает лучшие механические и технологические характеристики получаемого биоматериала по сравнению с однокомпонентными аналогами.
Структурные белки шелка, к которым относится фиброин, обладают всеми свойствами, необходимыми для применения в тканевой инженерии, а также характеризуются уникальной для природных полимеров прочностью и эластичностью. Особенно интересна возможность использования белков паутины — спидроинов. Ранее было показано, что имплантация сформированных из рекомби-нантного спидроина пористых скаффолдов в область дефекта бедренной кости крысы приводит к значительному ускорению регенерации по сравнению с регенерацией незаполненного дефекта бедренной кости, а также регенерацией дефекта при имплантации фиброинового скаффолда [5].
Целью данной работы являлось получение фо-тоотверждаемых гидрогелей на основе метакрилли-рованного желатина и структурных белков шелка — рекомбинантного аналога спидроина каркасной нити паутины Nephila clavipes и фиброина шелка из коконов тутового шелкопряда Bombyx mori.
Материалы и методы
Материалы. Метакриловый ангидрид (94%), оксид дифенил(2,4,6-триметилбензоил)фосфина (97%), диметилсульфоксид (99,9%) и бромид лития (99%) (Sigma-Aldrich, Германия), муравьиная кислота (99%) (Acros Organic, США), этанол (95%) (Медихимпром, Россия), желатин кристаллический (особо чистый, Carl Roth, Германия), среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM, ПанЭко, Россия), эмбриональная телячья сыворотка (HyClone, США), параформальдегид (Sigma-Aldrich, Германия), краситель SYTOX Green Nucleic Acid Stain (Invitrogen, США), хирургические шелковые нити (ООО «Моснитки», Россия), рекомбинантный аналог спидроина 1F9, полученный по описанной ранее методике [6], 0,1 М калий-фосфатный буферный раствор (pH 7,2).
Синтез метакрилированного желатина. Навеску кристаллического желатина (1 г) помещали в круглодонную колбу, оснащенную магнитной мешалкой, и добавляли 20 мл 0,1 М калий-фосфатного буферного раствора (pH 7,2). Растворение желатина производили на водяной бане (50°С) при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Итоговая концентрация составляла 5 мас.%. В полученный раствор вносили избыток метакрилового ангидрида. Реакцию проводили в течение 3 ч при
постоянном перемешивании и нагревании (50°С). Далее к реакционной смеси добавляли 20 мл 0,1 М калий-фосфатного буферного раствора (pH 7,2), после чего охлаждали смесь до комнатной температуры и очищали диализом в целлюлозных мембранах против двадцатикратного объема дистиллированной воды при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со сменой каждый час в течение 3 сут до исчезновения запаха метакрилового ангидрида. Продукт реакции переносили в чашку Петри, замораживали при —18°С и лиофилизиро-вали на приборе Alpha 1-2 LDplus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Германия) до постоянной массы.
Получение водного раствора фиброина шелка. Навеску хирургических шелковых нитей растворяли в 9,3 М растворе бромида лития, затем диализовали против дистиллированной воды в течение суток с десятью сменами воды. Раствор фиброина замораживали в чашках диаметром 10 см и лиофилизи-ровали на приборе Alpha 1-2 LDplus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Германия). Необходимую для получения раствора с нужной концентрацией массу белка растворяли в дистиллированной воде.
Формирование гидрогелей. Для изготовления гидрогелей на основе фиброина навеску метакри-лированного желатина растворяли в диметилсуль-фоксиде в термошкафу при температуре 50—60°С до его полного растворения и добавляли фотоинициатор оксид дифенил(2,4,6-триметилбензоил) фосфина (97%, 3 мас.% по метакрилированному желатину). Далее аккуратно при перемешивании приливали водный раствор фиброина. Концентрация метакрилированного желатина в итоговом растворе составляла не менее 3 мас.%, а соотношение мономеров (метакрилированный желатин:фибро-ин) - 2:1.
Для изготовления гидрогелей на основе спид-роина навеску белка растворяли в 90%-ной муравьиной кислоте, затем аккуратно добавляли метакри-лированный желатин и встряхивали до полного растворения. Далее к смеси добавляли фотоинициатор оксид дифенил(2,4,6-триметилбензоил) фосфина (97%, 5 мас.% по метакрилированному желатину). Концентрация метакрилированного желатина в итоговом растворе составляла не менее 10 мас.% при соотношении мономеров (метакрилированный желатин:спидроин) 2:1.
Фотополимеризация. Для получения макроскопических образцов гидрогелей растворы мономеров (300 мкл) вносили в полипропиленовую форму диаметром 13 мм так, чтобы образовался ровный слой. После этого смесь фотополимеризо-вали в свете ультрафиолетовой лампы мощностью
3б Вт в течение 10 мин. Далее в формы добавляли 95%-ный этиловый спирт и выдерживали при комнатной температуре в течение одного часа. Затем отмывали растворители избытком дистилирован-ной воды в течение 2—3 ч при постоянном перемешивании и смене раствора. При необходимости дальнейшего хранения переносили гидрогелевые образцы в 70%-ный этиловый спирт.
Микроскопические гидрогелевые структуры были сформированы посредством фотоотверждения с применением микроскопа Eclipse Ti-E с конфокальным модулем А1 (Nikon, Япония). С помощью программы NIS-elements (Nikon, Япония) создавали шаблоны заданной формы и облучали соответствующие им области смеси, нанесенной на покровное стекло, лазером с длиной волны 405 нм, используя объектив Plan Fluor 40x/1,30 Oil DIC. Отмывали полученные микроструктуры дистиллированной водой, после чего обрабатывали их 95%-ным этиловым спиртом.
Культивирование фибробластов 3Т3 на гидрогелях. Фибробласты 3Т3 суспендировали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Концентрацию фибробластов доводили до 24 тыс. клеток в одном миллилитре. Гидрогели помещали в чашки Петри диаметром 35 мм и вносили 2 мл суспензии. Через 48 ч клетки фиксировали 4%-ным параформальдегидом. Ядра клеток выявляли красителем SYTOX Green Nucleic Acid Stain (Invitrogen, США). Для получения изображений использовали конфокальный микроскоп Axiovert 200M LSM 510 Meta и программное обеспечение 3D for LSM (Zeiss, Германия).
Сканирующая электронная микроскопия. Гидрогели обезвоживали в возрастающих концентрациях этилового спирта и ацетоне, затем высушивали на приборе Critical point dryer HCP-2 (Hitachi Ltd., Япония) и напыляли слоем платины толщиной 20 нм с использованием прибора IB-3 Ion Coater (Eiko Engineering Co., Ltd, Япония). Полученные образцы изучали на микроскопе CamScan S2 (Cambridge Instruments, Великобритания).
Результаты и обсуждение
Гидрогели представляют собой трехмерные полимерные сети, способные поглощать и удерживать большие количества воды. Многие исследования посвящены изучению возможности их использования для тканевой инженерии, направленной доставки лекарственных средств и других биомедицинских приложений [7].
Активным направлением применения гидрогелей является создание на их основе раневых покрытий, так как они обладают способностью удерживать экссудат в ране, что способствует ускорению зажив-
ления. Также к достоинствам гидрогелей можно отнести возможность введения в их состав антибиотиков и других фармацевтических препаратов [8]. Ранее было показано, что изготовленные из фиброина [9] и спидроина [10] микроносители при введении в область полнослойной кожной раны способствуют ускорению заживления с восстановлением всех структурных компонентов кожи. Вероятно, раневые покрытия, сформированные из гидрогелей на основе данных структурных белков шелка, также могут способствовать регенерации. В рамках данной работы были созданы прототипы таких изделий, состоящие из метакрилированного желатина в сочетании со спидроином или фиброином. Были получены образцы гидрогелей в виде дисков диаметром 13 мм (рисунок, А и Б).
В качестве фотоинициатора был выбран оксид дифенил(2,4,6-триметилбензоил)фосфина (97%), являющийся высокореактивным нерастворимым
Рисунок. Фотоотверждаемые гидрогели, содержащие спидроин (А, В) или фиброин (Б, Г, Д). А — диски, сформированные из гидрогелей на основе метакрилированного желатина и спидроина. Б — диски, сформированные на основе метакрилированного желатина и фиброина. В, Г — структура дисков на основе метакрилированного желатина в сочетании со спидроином (В) или с фиброином (Г), изображения получены методом сканирующей электронной микроскопии. Д — ядра фибробластов 3Т3, культивируемых 48 ч на поверхности гидрогеля на основе метакрилированного желатина в сочетании со спидроином. Е — микроструктура, сформированная из гидрогеля на основе фиброина и метакрилированного желатина
в воде соединением, применяемым для быстрого фотоотверждения, например, для лазерной сте-реолитографии. В ранее описанной системе с ме-такрилированным желатином и фиброином был использован 2-гидрокси-4'-(2-гидроксиэтокси)-2-метилпропиофенон (Irgacure 2959) [4]. Это изменение позволило сократить время требуемого УФ-облучения в 5—10 раз и осуществлять фотополимеризацию в слоях раствора толщиной до 5 мм.
Внутреннее пространство высушенных дисков характеризовалось пористой структурой (рисунок, В и Г). Для оценки биосовместимости фотоотверж-даемых гидрогелей в модельных системах in vitro были использованы мышиные фибробласты линии 3Т3. На рисунке (Д) представлено репрезентативное изображение ядер клеток через 48 ч после нанесения суспензии фибробластов на поверхность спидроин-содержащего гидрогеля. Плотность клеток указывает на их активную пролиферацию. Аналогичные данные были получены и для фиброин-содержащих гидрогелей. Таким образом, фотоот-верждаемые производные фиброина или спидроина после их модификации метакрилированным желатином и фотоотверждающими реагентами сохраняют биосовместимость в модельных системах in vitro.
Возможность создания микроскопических структур была оценена с использованием оптической системы конфокального микроскопа. На поверхности покровного стекла были сформированы рельефные элементы из гидрогеля на основе фиброина
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Li S, Tuft B.W., Xu L, Polacco M.A., Clarke J.C., Guymon C.A., Hansen M.R. Microtopographical features generated by photopolymerization recruit RhoA/ROCK through TRPV1 to direct cell and neurite growth // Biomaterials. 2015. Vol. 53. P. 95-106.
2. Chia H.N., Wu B.M. Recent advances in 3D printing of biomaterials // J. Biol. Eng. 2015. Vol. 9. 4.
3. Yue K., Trujillo-de Santiago G., Alvarez. M., Tamayol A., Annabi N., Khademhosseini A. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels // Biomaterials. 2015. Vol. 73. P. 254-271.
4. Xiao W., He J., Nichol J.W., Wang L., Hutson C.B., Wang B., Du Y., Fan H., Khademhosseini A. Synthesis and characterization of photocrosslinkable gelatin and silk fibroin interpenetrating polymer network hydrogels // Acta Biomater. 2011. Vol. 7. N 6. P. 2384-2393.
5. Moisenovich M.M., Pustovalova O.I., Shackelford J., Vasiljeva T.V., Druzhinina T.V., Kamenchuk Y.A., Guzeev V.V., Sokolova O.S., Bogush V.G., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P., Agapov I.I. Tissue regeneration in vivo within recombinant spidroin 1 scaffolds // Biomaterials. 2012. Vol. 33. N 15. P. 3887-3898.
6. SidorukK.V, DavydovaL.I., KozlovD.G., Gubaidullin D.G., Glazunov A.V., Bogush V.G., Debabov V.G. Fermentation optimization of a Saccharomyces cerevisiae strain producing 1F9 recombinant spidroin // Appl. Biochem. Microbiol. 2015. Vol. 51. N 7. P. 766-773.
шелка, линейные размеры которых в одном из сечений не превышали 5 мкм (рисунок, Е). Микроструктурированные поверхности могут применяться в модельных системах для изучения влияния микроокружения клеток на их функции. В частности, могут быть разработаны алгоритмы для автоматизированного изучения единичных клеток [11]. Кроме того, применение метакрилированного желатина позволяет адаптировать производные структурных белков шелка к аддитивным технологиям и технологиям прототипирования.
Таким образом, были получены фотоотверж-даемые гидрогели на основе метакрилированного желатина и рекомбинантного спидроина и фотоот-верждаемые гидрогели на основе метакрилирован-ного желатина и фиброина шелка, которые могут быть использованы при формировании скаффол-дов для тканевой инженерии и раневых покрытий, в том числе микроструктурированных. Биосовместимые фотоотверждаемые производные спидроина были получены впервые.
Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в соответствии с соглашением о предоставлении субсидий №14.604.21.0167 от 26 сентября 2017 г. «Создание функционализированного композитного фотоотверждаемого биоразлагаемого материала на основе структурного белка шелка и мета-крилированных производных желатина» (уникальный идентификатор КРМЕР160417Х0167).
7. Calô E., Khutoryanskiy V.V. Biomedical applications of hydrogels: a review of patents and commercial products // Eur. Polym. J. 2015. Vol. 65. P. 252-267.
8. Kamoun E.A., Kenawy E.R.S., Chen X. A review on polymeric hydrogel membranes for wound dressing applications: PVA-based hydrogel dressings //J. Adv. Res. 2017. Vol. 8. N 3. P. 217-233.
9. Arkhipova A.Y., Nosenko M.A., Malyuchenko N.V., Zvartsev R.V., Moisenovich A.M., Zhdanova A.S., Vasil'eva T.V., Gorshkova E.A., Agapov I.I., Drutskaya M.S., Nedospasov S.A., Moisenovich M.M. Effects of fibroin microcarriers on inflammation and regeneration of deep skin wounds in mice // Biochemistry (Mosc). 2016. Vol. 81. N 11. С. 1251-1260.
10. Moisenovich M.M., Malyuchenko N.V., Arkhipova A.Y., Kotlyarova M.S., Davydova L.I., Goncharenko A.V., Agapova O.I., Drutskaya M.S., Bogush V.G., Agapov I.I., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P. Novel 3D-microcarriers from recombinant spidroin for regenerative medicine // Dokl. Biochem. Bio-phys. 2015. Vol. 463. N 1. P. 232-235.
11. Burri O, Wolf B, Seitz A., Gonczy P. TRACMIT: An effective pipeline for tracking and analyzing cells on mi-cropatterns through mitosis // PLoS ONE. 2017. Vol. 12. N 7. e0179752.
Поступила в редакцию 14.11.2017
Принята в печать 15.12.2017
METHODS
PHOTOCURABLE HYDROGELS CONTAINING METHACRYLATED GELATIN AND
SPIDROIN OR FIBROIN
I.V. Bessonov1, M.S. Kotliarova1", M.N. Kopitsyna1, A.V. Fedulov2, A.M. Moysenovich1, A.Yu. Arkhipova3, V.G. Bogush4, D.V. Bagrov1, A.A. Ramonova3, A.E. Mashkov2, K.V. Shaitan1, M.M. Moisenovich3
1 Department of Bioengineering and3Laboratory of Confocal Microscopy, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—12, Moscow, 119234, Russia;
2M.F. Vladimirsky Moscow Regional Scientific Research Clinical Institute, Shepkina st. 61/2—1, Moscow, 129110, Russia;
4 State Research Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms of National Research Center "Kurchatov Institute", 1-st Dorozhniypr. 1, Moscow, 117545, Russia *e-mail: kotlyarova.ms@gmail.com
Photocurable hydrogels were fabricated from methacrylated gelatin and silk proteins, including recombinant analogue of spidroin from Nephila clavipes spider web and fibroin from the cocoons of the silkworm Bombyx mori. These polymers have high applicability in tissue engineering due to their biocompatibility and biodegradability. Hydrogels were fabricated using two different methods that allowed us to obtain either large-sized products or microstructures of certain shape. For the production of extensive hydrogels, samples were photopolymerized in the UV light within ten minutes. As a result samples of hydrogels were obtained as disks with a diameter of 13 mm. Scanning electron microscopy confirmed their porous structure. Microstructures were formed on coverslips using confocal microscope Eclipse Ti-E with 405 nm laser. This approach gives us an opportunity to control the topographic features of the obtained substrates and is applicable for creating micropatterns for studying the interaction of cells with a substrate.
Keywords: hydrogels, photopolymerization, spidroin, fibroin, tissue engineering, methacrylic gelatin
Сведения об авторах
Бессонов Иван Викторович - мл. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-499-348-95-58; e-mail: ivanbessonov@gmail.com
Котлярова Мария Сергеевна - аспирант кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-13-65; e-mail: kotlyarova.ms@gmail.com
Копицына Мария Николаевна - мл. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-499-348-95-58; e-mail: mariankuznetsova@gmail.com
Федулов Александр Владимирович - науч. сотр., детский хирург отделения детской хирургии Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского. Тел.: 8-495-631-74-45; e-mail: iksanderf@mail.ru
Мойсенович Анастасия Михайловна - аспирант кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-13-65; e-mail: a-moisenovich@mail.ru
Архипова Анастасия Юрьевна - канд. биол. наук, мл. науч. сотр. лаборатории конфокальной микроскопии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-13-65; e-mail: anastasia-yu-arkhipova@yandex.ru
Богуш Владимир Григорьевич - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории белковой инженерии ГосНИИгенетика. Тел.: 8-495-315-04-56; e-mail: bogush@genetika.ru
Багров Дмитрий Владимирович - канд. физ.-мат. наук, науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-23-74; e-mail: dbagrov@gmail.com Рамонова Алла Аликовна - мл. науч. сотр. межкафедральной лаборатории конфокальной микроскопии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-12-56; e-mail: a.ramonova@yandex.ru
Машков Александр Евгеньевич - докт. мед. наук, руководитель отделения детской хирургии Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского. Тел.: 8-495-631-05-82; e-mail: malexe@yandex.ru
Шайтан Константин Вольдемарович - докт. физ.-мат. наук, проф. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-23-74; e-mail: shaytan49@yandex.ru
Мойсенович Михаил Михайлович - канд. биол. наук, зав. лабораторией конфокальной микроскопии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-13-65; e-mail: mmoisenovich@mail.ru
