CC BY
41
9. Korotun V.N., Lesnikov V.V. Effect of storage conditions and terms of blood samples for the synthesis of ethanol in them. // "European Applied Sciences: modern approaches in scientific researches": papers of the 1st International Scientific Conference. ORT Publishing, Stuttgart, Germany. 2012. -P. 97-100.
10. Korotun V.N., Lesnikov V.V. Postmortem changes in the concentration of ethanol in the blood under different conditions and shelf life. // "Science, Technology and Higher Education": materials of the international research and practice conference. - Westwood, Canada. 2012.
- Vol. l.-P. 555-559.
11. Lewis R. J., Johnson R. D., Angier M.K., Vu N.T. Ethanol formation in unadulterated postmortem tissues. // For. Sci. Int. 2004. - Vol. 146. -Nel.-P. 17-24.
12. Moriya F., Hashimoto Y. Endogenous ethanol production in trauma victims associated with medical treatment. // Nippon Hoigaku Zasshi.
- 1996. -№ 50. - P. 263-267.
13. Petkovic S.M., Simic M.A., Vujic D.N. Postmortem production of ethanol in different tissues under controlled experimental conditions. // J. ForensicSci. 2004, - Vol. 146. -N. 1. -P. 17-24.
14. Yajimaa D., Motania H., Kameib K. et al. Ethanolproduction by Candida ablicans inpostmortem human blood samples: Effects of blood glucose level and dilution. // For. Sci. Int. - 2006. - Vol. 164. —№ 2-3. -P. 116-121.
© Т.В. Найденова, А.Ю. Вавилов, 2013 УДК 340.624
Т.В. Найденова1, А.Ю. Вавилов2 ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПРИЖИЗНЕННОСТИ И ДАВНОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ПЯТЕН КРОВИ НА ТЕКСТИЛЬНЫХ ПРЕДМЕТАХ-НОСИТЕЛЯХ
1БУЗ УР «Бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ УР» (начальник - к.м.н. В.И. Жихорев); 2Кафедра судебной медицины (зав. кафедрой - проф. В.И. Витер) ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия» Представлены результаты авторских исследований оптической плотности вытяжек из пятен сухой крови различной давности, расположенных на текстильных предметах-носителях. Полученные результаты объективизируют диагностику давности пятна крови и факта формирования его кровью живого человека или трупа.
Ключевые слова: пятно крови, давность образования, оптическая плотность, текстильный предмет-носитель, живой человек, труп.
PHOTOCOLORIMETRIC'S DIAGNOSTICS AT VITALITY AND PRESCRIPTION OF FORMATION OF STAINS OF BLOOD ON TEXTILE SUBJECTS-CARRIERS T.V. Naidyonova, A.Ju.Vavilov The paper presents the results of original research of the optical density of extracts from dried blood spots of different periods, located in the textile carrier subject. The results objectifies diagnosis of old blood stains and the fact of formation of the blood of a living person or a corpse.
Key words: blood spot, prescription of formation, optical density, textile subject carrier, live person, dead corpse.
Среди всех биологических объектов, изымаемых работниками правоохранительных органов с мест происшествий в качестве вещественных доказательств и присылаемых для изучения в Бюро судебно-медицинской экспертизы, кровь занимает ведущее место, как по количеству исследований, так и по значимости получаемых результатов для следствия и суда [3].
Кроме вопросов о видовой и групповой принадлежности, работника следствия часто интересует, как давно сформировалось изъятое им сухое пятно, а так же сформировано оно кровью живого человека, или трупа?
Для решения последних вопросов отечественными и зарубежными учеными было предложено множество методов, нашедших ограниченное применение в силу их трудоемкости, дороговизны или малой информативности. Однако, по нашему мнению, потенциал средств, уже имеющихся на вооружении медицинских учреждений, не до конца исчерпан. Так, высокой чувствительностью, возможностью объективной регистрации и оценки результатов, при определенной простоте и удобстве использования, обладают биофизические методы [1, 2], одним из которых является фотоколориметрия, уже давно использующаяся в судебной медицине [4, 7]. Именно ее и было решено применить для повышения качества диагностики давности образования пятен крови на текстильных предметах-носителях, с разработкой критериев определения факта формирования пятна кровью живого лица, либо трупа, по величине оптической плотности вытяжки из сухого пятна крови.
Пятна крови на текстильных материалах (хлопчатобумажная, шерстяная, джинсовая ткани и трикотаж) были сформированы кровью от трупов с давностью смерти, не превышающей одних суток, а так же от живых лиц, и в последующем, после высушивания, хранились в различных температурных условиях внешней среды (комнатная температура, тепло, холод). Из высушенных образцов крови и контрольных предметов носителей с помощью дистиллированной воды готовились вытяжки по способу, представленному нами ранее [5]. Оптическая плотность измерялась с помощью фотоколориметра КФК-3 и двух стандартных кварцевых кювет 1,040 в диапазоне длин волн от 330 до 500 нм с интервалом 10 нм. В течение первого месяца показатели оптической плотности фиксировались через каждую неделю, в последующем через каждые четыре недели.
Построение спектров оптической плотности вытяжек из сухих пятен крови различной давности и температурных условий их хранения и проведение множественных парных сравнений средних величин групп, сформированных по признаку длины волны, позволило прийти к заключению, что выбранный диапазон длин волн (330-500 нм) позволяет получить вполне достоверную информацию об изучаемом объекте (Рис. 1).
Для всех трех групп температурных условий хранения материала, представленных на рисунке, характерен пик на длине волны 390 нм, который с течением времени начинает постепенно снижаться. В этом плане выделяется группа «тепло», где значение оптической плотности на
нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм Длина волны, нм
нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм нм Длина волны, нм
Рис. 1. Спектры оптической плотности вытяжек из образцов крови 1-ой недели хранения
(сверху вниз - группы: «Норма», «Тепло», «Холод»
данной длине волны приближается к ее показателю на длине волны 420 нм.
При изучении температурных условий, в которых находились предметы-носители, установлено, что средние значения оптической плотности вытяжек из сухих пятен крови, хранящихся на предметах-носителях из хлопчатобумажной ткани в условиях комнатной температуры (+18-22°С), демонстрируют значимые различия в большинстве сравниваемых пар в диапазоне 380-420 нм (Таблица 1). Объекты крови различной давности, хранящиеся при повышенной внешней температуре (+30°С), наиболее значимо различались в диапазоне 360-430 нм (Таблица 2). Это позволило сделать вывод, что указанный диапазон длин волн будет способствовать формированию критериев, которые можно будет использовать для решения задач настоящего исследования.
Что же касается хранения объектов крови в условиях внешней температуры равной +5°С (Таблица 3), то полученные результаты подтвердили общеизвестное положение о консервирующем действии понижения температуры на сохраняемость биологических структур, и позволили предположить, что эти условия хранения сухого пятна крови явятся фактором, ограничивающим применимость разрабатываемого метода.
Таблица 1
Результаты сравнения средних значений оптической плотности вытяжек из пятен крови различной давности (недель - н.) на длине волны 380 нм
(«нормальная» температура)
40 н. 36 н. 32 н. 24 н. 28 н. 20 н. 16 н. 12 н. 1 н. 8н. 2н. 3 н.
4 н. 12,07 10,19 9 201 6,371 5,940 3,954 3,873 2,729 1,136 1,123 0,456 0,102
3 н. 11,97 10,09 9,100 6,270 5,839 3,853 3,773 2,629 1,036 1,022 0,353
2н. 11,69 9,801 8,809 5,959 5,527 3,526 3,451 2,302 0,697 0,680
Хм. 10,77 8,937 7,972 5,171 4,753 2,786 2,723 1,602 0,022
1 н. 10,67 8,851 7,894 5,112 4,698 2,744 2,682 1,570
12 н. 8,980 7,194 6,255 3,483 3,083 1,133 1,093
16 н. 7,918 6,132 5,193 2,393 1,997 0,025
20 н. 8,008 6,193 5,240 2,401 2,000
28 н. 5,926 4,151 3,218 0,385
24 н. 5,575 3,792 2,855
32 н. 2,644 0,911
36 н. 1,734
Таблица 2
Результаты сравнения средних значений оптической плотности вытяжек из пятен крови различной давности (недель - н.) на длине волны 380 нм
(«повышенная» температура)
40 н. 36 н. 32 н. 28 н. 24 н. 20 н. 16 н. 12 н. 8н. 4н. 1 н. 3 н.
2н. 17,11 14,90 14,99 11,91 9,888 8,573 7,475 5,174 2,472 1,043 0,845 0,511
Зн. 16,59 14,39 14,47 11,39 9,377 8,067 6,964 4,668 1,966 0,533 0,330
1н. 16,41 14,19 14,27 11,16 9,129 7,810 6,696 4,382 1,657 0,208
4н. 16,06 13,87 13,94 10,86 8,844 7,539 6,432 4,141 1,438
8н. 14,46 12,32 12,36 9,306 7,325 6,046 4,935 2,678
12 н. 11,74 9,639 9,630 6,581 4,623 3,368 2,232
16 н. 9,573 7,494 7,448 4,370 2,413 1,166
20 н. 8,308 6,271 6,203 3,153 1,225
24 н. 7,139 5,103 5,014 1,936
28 н. 5,249 3,229 3,106
32 н. 2,143 0,180
36 н. 1,925
Таблица 3
Результаты сравнения средних значений оптической плотности вытяжек из пятен крови различной давности (недель - н.) на длине волны 380 нм
(«пониженная» температура)
40 н. 36 н. 32 н. 24 н. 28 н. 16 н. 20 н. 12 н. 2н. 1н. 8н. 4н.
3 н. 5,207 4,616 4,264 4,047 3,634 2,710 2,595 2,010 1,062 0,691 0,511 0,001
4н. 5,252 4,656 4,303 4,083 3,666 2,735 2,618 2,027 1,071 0,697 0,516
8н. 4,751 4,155 3,788 3,572 3,155 2,219 2,107 1,521 0,556 0,177
1 н. 4,619 4,017 3,644 3,428 3,007 2,062 1,950 1,361 0,384
2н. 4,212 3,615 3,232 3,022 2,605 1,664 1,557 0,976
12 н. 3,188 2,602 2,195 1,999 1,589 0,656 0,560
20 н. 2,663 2,071 1,646 1,452 1,039 0,092
16 н. 2,596 1,999 1,568 1,373 0,956
28 н. 1,644 1,053 0,598 0,413
24 н. 1,239 0,648 0,181
32 н. 1,073 0,476
36 н. 0,580
Примечание: Серым цветом выделены значения критерия Ньюмена-Кейлса, свидетельствующие о достоверном (Р>95) различии сравниваемых пар. н. - недель хранения образца.
Изучение влияния веса сухого остатка крови на величину оптической плотности вытяжки из пятна показало наличие строгой корреляционной зависимости для всех сроков хранения образца практически на всех использованных длинах волн (Таблица 4, 5). Указанное обстоятельство потребовало внесения корректив в методику исследования, в форме жесткой стандартизации веса сухого остатка крови на этапе изготовления вытяжки. По этой же причине из изучения были исключены атласные и шифоновые ткани. Масса сухого остатка в пятнах крови на этих текстильных материалах всегда была меньше 5 мг и изменения оптической плотности оказались незначительными и недостоверными, в связи с чем, указанные ткани были классифицированы как «невпитывающие».
В ходе изучения средних значений оптической плотности вытяжек из пятен крови, расположенных на
Таблица 4
Значения коэффициента корреляции Пирсона между значением оптической плотности вытяжки из пятна крови и весом объекта-носителя
(давность пятна крови 1 неделя)
Таблица 5
Значения коэффициента корреляции Пирсона между значением оптической плотности вытяжки из пятна крови и весом объекта-носителя
(давность пятна крови 40 недель)
Но эма Тепло Холод
г„ тг тг тг
330 нм 0,553 0,100 0,688 0,097 0,544 0,115
340 нм 0,523 0,103 0,676 0,098 0,506 0,117
350 нм 0,502 0,104 0,693 0,096 0,516 0,117
360 нм 0,481 0,106 0,673 0,099 0,503 0,118
370 нм 0,401 0,111 0,641 0,103 0,476 0,120
380 нм 0,486 0,105 0,661 0,100 0,425 0,123
390 нм 0,448 0,108 0,666 0,100 0,232 0,132
400 нм 0,710 0,085 0,292 0,128 -0,005 0,136
410 нм 0,590 0,097 -0,111 0,133 -0,015 0,136
420 нм 0,504 0,105 0,431 0,121 0,027 0,136
430 нм 0,462 0,108 0,711 0,095 0,506 0,117
440 нм 0,397 0,111 0,717 0,093 0,459 0,121
450 нм 0,476 0,105 0,747 0,089 0,542 0,114
460 нм 0,499 0,104 0,766 0,086 0,546 0,114
470 нм 0,502 0,103 0,781 0,083 0,564 0,112
480 нм 0,468 0,107 0,793 0,081 0,586 0,110
490 нм 0,472 0,107 0,803 0,080 0,592 0,110
500 нм 0,474 0,107 0,810 0,078 0,591 0,110
Но эма Тепло Холод
Гху тг гху тг Гху тг
330 нм 0,738 0,077 0,471 0,118 0,761 0,094
340 нм 0,743 0,077 0,462 0,119 0,766 0,093
350 нм 0,792 0,070 0,450 0,119 0,747 0,096
360 нм 0,766 0,074 0,443 0,120 0,746 0,096
370 нм 0,762 0,074 0,436 0,120 0,731 0,098
380 нм 0,735 0,077 0,409 0,122 0,735 0,098
390 нм 0,690 0,083 0,385 0,124 0,713 0,101
400 нм 0,511 0,099 0,387 0,125 0,526 0,123
410 нм 0,313 0,109 0,426 0,123 0,148 0,143
420 нм 0,632 0,089 0,500 0,117 0,538 0,122
430 нм 0,756 0,075 0,417 0,121 0,489 0,126
440 нм 0,774 0,072 0,434 0,120 0,727 0,099
450 нм 0,764 0,074 0,446 0,120 0,745 0,096
460 нм 0,768 0,073 0,451 0,119 0,760 0,094
470 нм 0,768 0,073 0,454 0,119 0,771 0,092
480 нм 0,769 0,073 0,453 0,119 0,777 0,091
490 нм 0,772 0,072 0,448 0,119 0,777 0,091
500 нм 0,777 0,072 0,447 0,120 0,780 0,090
Примечание: г - коэффициент корреляции (Пирсона); mт - ошибка коэффициента корреляции. Цветом выделено наличие достоверной корреля-
ционной зависимости.
Ё
° 0,8
Ь
5 0,8
330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 Длина волны, нм
-О-Трикотаж ""О— Джинса Шерсть _X—х/бткань
1 неделя
330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 Длина волны, нм
20 недель
330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 Длина волны, нм
32 недели
Рис. 2. Спектры оптической плотности вытяжек из пятен крови на различных предметах-носителях
различных текстильных предметах-носителях, установлено, что величина оптической плотности вытяжки из пятен крови, расположенных на хлопчатобумажной ткани существенно выше таковых, для трикотажа, шерстяной или джинсовой ткани. Между тем, при сравнении оптической плотности вытяжек из пятен крови на трикотаже, шерстяной и джинсовой ткани между собой, достоверные различия получены только в единичных случаях. Это позволило разделить текстильные предметы-носители на хлопчатобумажную ткань и прочие текстильные материалы, отнеся к последним шерстяную, джинсовую ткани и трикотаж (Рис. 2).
Решение вопроса о формировании пятна кровью живого человека или трупа имеет огромное значение для успешного расследования и доказывания уголовных дел против жизни и здоровья граждан, т.к. позволяет более четко и аргументировано сформировать обвинительное заключение, определив, например, является место происшествия местом убийства или расчленения мертвого тела. Изучая пятна, сформированные кровью живого человека и кровью трупа, было установлено, что спектры оптической плотности их вытяжек существенно различались. Наиболее значимые различия были получены в диапазоне длин волн 400-420 нм в интервале от 8 до 40 недель хранения образца (Таблица 6).
Таблица 6
Сравнение средних значений величины оптической плотности вытяжек из пятен крови от живых лиц и от трупов по критерию Данна
Давность пятна крови, недель Длина волны, нм
400 410 420
8 5,11 5,43 4,80
12 5,17 5,38 5,11
16 4,95 5,06 5,05
20 5,11 5,22 5,27
24 5,27 5,32 4,90
28 5,19 5,12 4,48
32 4,84 5,19 5,01
36 4,69 4,43 3,79
40 4,59 4,85 4,11
Критическое значение* 1,96
Следовательно, колориметрия вполне может быть использована с целью установления факта прижизненности или посмертности кровопотери, а значения оптической плотности на длинах волн 400-420 нм приняты в качестве дифференциально-диагностических критериев.
В ходе анализа было сформировано уравнение регрессии, устанавливающее связь между величиной оптической плотности вытяжки из пятна и образованием его кровью живого лица или трупа [6].
Проверка результатов расчетов, проводимая в форме «слепого опыта» на материале 12-и практических судебно-медицинских экспертиз, показала полное соответствие полученного математического выражения его заявленным характеристикам (Таблица 7).
Таблица 7
Результаты проверки колориметрического определения факта формирования сухого пятна кровью живого лица или трупа на практическом экспертном материале
№ п/п Следственные данные Давность пятна, недель Оптическая плотность Результат расчета
400 нм 410 нм 420 нм
1 1 8 0,497 0,611 0,695 1
2 1 8 0,513 0,618 0,710 1
3 1 12 0,504 0,611 0,697 1
10 2 12 0,529 0,635 0,717 2
12 2 16 0,534 0,640 0,711 2
Примечание: 1 - кровь живого лица, 2 - кровь трупа.
Влияния возрастного фактора на величину оптической плотности вытяжек из сухого пятна крови установлено не было, равно как не были установлены влияния на изучаемый параметр половой принадлежности субъекта, категории его смерти, и факта наличия этанола в крови на момент ее наступления. Это позволило перейти к непосредственной разработке способа диагностики давности сухого пятна крови колориметрическим способом.
Для определения вида математической зависимости между величиной оптической плотности вытяжек из пятен крови и их давностью использована система интеллектуального анализа данных - PolyAnalyst, с помощью которой были получены 3 математических выражения для хлопчатобумажной ткани и 3 математических выражения для прочих текстильных материалов, при хранении образцов в условиях комнатной температуры. Хранение объектов при иных температурах не позволило с приемлемой точностью судить о давности ее пятен.
С помощью построения диаграмм рассеивания и определения доверительных интервалов, изучена точность всех разработанных уравнений, расчет по которым сопровождается погрешностью, не превышающей ±3,3 - ±8,5 недель (х/б ткань) и ±3,2 - ±5,4 недель (прочие ткани) на сроках давности пятна крови 16 и 40 недель соответственно.
Проверка адекватности математических выражений проведена на материале 23-х практических судебно-медицинских экспертиз и подтвердила его полное соответствие заявленным критериям.
Для облегчения внедрения в экспертную деятельность представленных научных положений разработаны компьютерные программы, посредством стандартного Windows интерфейса реализующие функции по расчету давности пятна крови и определения факта формирования его кровью живого лица или трупа (Рисунок 3).
Выводы:
1. Разработанная в ходе экспериментальных исследований и проверенная на практическом экспертном материале инструментальная методика, позволяет ре-
-PBS 1.0» .ПОЛ 1.0»
Рис. 3. Основные диалоговые окна компьютерных программ
комендовать колориметрический метод к применению в судебно-медицинской экспертной деятельности, направленной на установление давности пятна крови и факта его формирования кровью живого лица либо трупа.
2. Изучение влияния материала предмета-носителя на величину оптической плотности вытяжки из пятна крови позволило сформировать две группы - хлопчатобумажная ткань и прочие ткани (трикотаж, джинсовая, шерстяная). Оптическая плотность вытяжек из пятен крови на всех текстильных предметах-носителях в зависимости от длительности хранения образца (до 40 недель) демонстрирует тенденцию к снижению изученного колориметрического показателя, наиболее достоверную (Р>95%) в диапазоне длин волн 380-420 нм при комнатной (+18-22°С) температуре. Изменение температуры хранения образца ниже +5°С, либо свыше +30°С, не позволяет судить о давности образования пятна крови с приемлемой точностью в изученном временном интервале.
3. Пол и возраст умершего человека, наличие этанола в его крови на момент смерти, а так же ее категория, не оказывают значимого влияния на величину оптической плотности вытяжек из изученных пятен крови, в связи с чем, могут не учитываться в ходе проведения практических судебно-медицинских экспертиз. В тоже время оптическая плотность вытяжек из пятен, образованных кровью живого лица либо трупа, на длинах волн 400 нм, 410 нм и 420 нм и сроках давности пятна от 8-и до 40 недель достоверно (Р>95%) различается, что может быть использовано в целях диагностики прижизненности кро-вопотери.
4. Применение методов интеллектуального анализа данных позволило сформировать математические выражения, определяющие зависимость между давностью сухого пятна крови и величиной оптической плотности его вытяжки для хлопчатобумажной ткани и прочих тканей, а так же выражение, представляющее связь между величиной оптической плотности вытяжки исследуемого пятна крови и фактом образования его кровью живого лица или трупа:
5. Проверка алгоритма колориметрического исследования сухих пятен крови, проведенная на практическом экспертном материале позволила достоверно (Р>95%) судить о факте образования пятна кровью живого человека или трупа и определять его давность на текстильных предметах-носителях с точностью от ±3,2 до ±8,5 недель, при сроках давности пятна от 16 до 40 недель. Получаемые результаты объективизируют диагностику давности пятна крови и факта формирования его кровью живого человека или трупа.
Литература:
1. Биофизические методы исследования в судебно-медицинской практике / В. О. Плаксин [и др.] // Лабораторные методы исследования в судебноймедицине изадачи судебно-медицинской науки и практики по их совершенствованию. - Ижевск, 1994. - С. 83-86.
2. Жаров В. В., Куздыбаев А. С. Биофизические методы как новое направление исследований для судебно-медицинского определе-ния давности наступления смерти // Тезисы докладов 1-го Всесоюзного съезда судебных медиков. - Киев, 1976. - С. 256-257.
3. Кан В. Б., Беликов И. Е. Судебная медицина. Курс лекций. - Екатеринбург, 2002. - 115 с.
4. Кишеневский А. Н., Кузнецов Л. Е., Каукаль В. Г. Оптические методы сравнительного исследования влажных минерализатов волос человека// Судебно-медицинская экспертиза. —М., 1972. —№3. — С. 32-36.
5. Найденова Т.В., Вавилов А.Ю. Определение давности пятен крови,расположенных на предметах-носителях тканой природы // Проблемы экспертизы вмедицине. -Ижевск, 2012. —№ 3-4. - С. 19-22.
6. Найденова Т.В., Вавилов А.Ю. О возможности дифференциальной диагностики происхождения крови в пятне от трупа или живоголица// Медицинская экспертиза и право. -Москва, 2013. —№1. — С. 37-39.
7. Шалаев Н. Г. Метод фотоколориметрического исследования в определении давности кровяных пятен: автореф. дисс... канд. мед. наук. - Горький, 1954. - 20 с.
© Ю.Д. Алексеев, Е.Н. Савенкова, 2013 УДК 340.6 (035.3)
Ю.Д. Алексеев, Е.Н. Савенкова ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Кафедра судебной медицины им. М.И.Райского (зав. кафедрой - доц. А.А.Ефимов) ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» В работе установлены общие принципы постановки реакции иммунофлюоресценции на примере клеток буккального эпителия и печени человека, которые включают: систему контроля качества, специфичности, активности, красящего титра и рабочего разведения люминесцирующих сывороток, выявление свободного флюорохрома, выбор фиксации препаратов, буферной смеси, температурных режимов. Указанные этапы постановки РИФ гарантируют стандартизацию исследования и сводят к минимуму неспецифическое связывание флюоресцирующих антител.
Ключевые слова: реакция иммунофлюоресценции, люминесцирующие сыворотки, клетка.
GENERAL PRINCIPLES FOR SETTING IMMUNOFLUORESCENCE REACTION FOR THE DETERMINATION OF A SPECIFIC ACCESSORY OF ISOLATED CELLS OF ANIMAL ORIGIN
Y.D. Alekseev, E.N. Savenkova In setting established general principles for immunofluorescence reaction on the example of buccal epithelium cells and human liver, which include: a quality control system, specificity, activity, coloring and working of breeding titer of luminescing serums of free fluorochrome detection, selection of fixation preparations buffer mixture, temperature regimes. Specified stages guarantee standardization setting RIF research and minimize any non-specific binding fluorescing antibodies. Key words: reaction of immunofluorescence, luminescent sera, cell.
С целью выделения общих принципов постановки реакции иммунофлюоресценции были проведены исследования с клетками буккального эпителия и печени человека.
При разработке методики определения видовой специфичности изолированных клеток требовалось провести эксперименты по оценке качества люминесцирующих сывороток (наличие свободного флюорохрома, красящего титра и рабочего разведения, контроля специфичности и активности), выбора способа фиксации, температурного режима, контрастирования фона препаратов и др.
Известно, что проведение реакции иммунофлюо-ресценции (РИФ) возможно в трех основных вариантах: прямое окрашивание, непрямое окрашивание, непрямой метод с использованием комплемента. Для окрашивания препаратов использовали отечественные стандартные антивидовые люминесцирующие сыворотки (ЛС) против глобулинов человека, кролика и барана, выпускаемых НИИ эпидемиологии и микробиологии АМН РФ им. Н.Ф. Гамалеи. Они представляют собой лиофилизированную глобулиновую фракцию иммунной сыворотки, связанную (конъюгированную) с флюорохромом флюоресцеинизо-тиоцианатом (ФИТЦ).
Прямая РИФ (или прямое окрашивание) заключается в инкубации объектов с соответствующей ЛС, последующим удалением не прореагировавших антител и учете результатов реакции под люминесцентным микроскопом. Отличается простотой выполнения, но требует для каждого выявленного антигена определенной антивидовой люминесцирующей сыворотки (ЛС).
Непрямая РИФ проводится в два этапа. На первом этапе объекты инкубируют с соответствующей обычной иммунной сывороткой с последующим удалением не прореагировавших антител. На втором этапе реакции препараты окрашивают ЛС, гомологичной белкам сыворотки, примененной на первом этапе. Такой вариант РИФ позволяет с помощью одной сыворотки определить многие антигены.
Непрямой метод с использованием комплемента основан на выявлении с помощью антикомплементарной люминесцирующей сыворотки комплекса антиген - антитело - комплемент. Этот вариант РИФ хотя и обладает наибольшей чувствительностью, однако из-за сложности постановки не нашел широкого применения в биологии и медицине.
Прямой и непрямой способы окрашивания равноценны по чувствительности. Однако, использование прямого метода предпочтительнее в связи с тем, что при этом исключается введение в реакцию дополнительных белков - реагентов, которые могут стать причиной неспецифического свечения объектов.
Диагностическая ценность РИФ, по мнению многих исследователей, зависит от качества приготовленных цитологических препаратов, так как даже незначительные повреждения клеток могут вызвать изменения в параметрах их флюоресценции. Перечисленные в специальной литературе многочисленные методические приемы позволяют получить качественные цитологические препараты, которые, являются малопригодными для изучения видовой дифференцировки изолированных клеток. Это
