CC BY
49УДК 616-002.828
ФОСФОЛИПАЗЫ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ ГРИБОВ:
ИХ ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ И ДИАГНОСТИКЕ МИКОЗОВ
Карпунина Т.И., Олина А.А., Машуров М.Г., Чемурзиева Н.В., Драбкова В.А.
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия им. Е.А. Вагнера Росздрава», Пермь, Россия
© Коллектив авторов, 2006
Встречаемость оппортунистических инфекций, в том числе ассоциированных с Candida spp., за последнее десятилетие возросла на 75-400%. Проведен анализ данных из научной литературы о продукции гидролитических ферментов, в частности фосфолипаз, различными представителями оппортунистических грибов. Рассмотрены такие аспекты проблемы, как: основные типы фосфолипаз и их вклад в вирулентность грибов рода Candida; возможная роль в патогенезе кандидоза; перспективы использования этих ферментов в диагностике заболеваний, а также при разработке новых фунгицидных препаратов, прежде всего, для лечения диссеминированных микозов.
Ключевые слова: вирулентность, оппортунистические грибы, фосфолипазы
PHOSPHOLIPASES OF OPPORTUNISTIC FUNGI: THEIR POTENTIAL ROLE IN PATHOGENESIS AND DIAGNOSIS OF MYCOSES
Karpunina T.I., Olina A.A., Mashurov M.G., Chemurzieva N.V., Drabcova V.A.
SEI HPE «Ye.A.Wagner Perm State Medical Academy», Perm, Russia
© Collective of authors, 2006
The prevalence of opportunistic infections, including Candida-associated, has increased by 75-400% within the last decade. An analysis of scientific literature data about the production ofhydrolytic
enzymes, particularly phospholipases, by different specimens of opportunistic fungi had been done. Such aspects as: the main types of phospholipases, their input into the virulence of Candida, their possible role in the pathogenesis of candidosis, prospective use of these enzymes in diagnosing of the diseases and in elaboration of the new fungicidal drugs for the treating of disseminated mycosis were discussed.
Key words: opportunistic fungi, phospholipases, virulence
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время особую значимость приобретает возрастающая роль оппортунистических инфекций, в том числе ассоциированных с Candida spp., встречаемость которых за последнее десятилетие возросла на 75-400%. Кроме роста заболеваемости, четко выделяют две тенденции— изменение видового спектра возбудителей в этиологической структуре микозов и обострение проблемы их лекарственной устойчивости. В связи с двойственной природой Candida spp. (комменсалы и/или этиопа-тогены) у клиницистов нередко возникают сложности в оценке результатов обследования, при определении целесообразности и выборе препаратов для лечения. В диагностике оппортунистических инфекций решающее значение придают численности обнаруженного микроба в пораженном органе, а в случае микст-инфекции — установлению количественных соотношений между ассоциантами. Однако многие исследователи, с которыми солидарны и мы, наиболее перспективным считают определение у выделенных культур факторов патогенности. Микробные клетки обладают конститутивными и индуцируемыми гидролитическими ферментами, разрушающими составляющие мембран клеток организма-хозяина, что приводит к дисфункции последних и, соответственно, к инвазии его тканей. Липиды и белки, как основные компоненты клеточных мембран, представляют собой мишени для атаки двумя основными типами ферментов: протеиназами, которые воздействуют на пептидные связи, и фосфолипазами, гидролизующими фосфолипиды. Изучение вклада фосфо-липаз в вирулентность грибов представляет собой сравнительно новое, быстро развивающееся направление в современной медицинской микологии. Цель настоящей работы - провести аналитический обзор доступной нам информации по этой проблеме.
Методы определения фосфолипазной активности
О секреции внеклеточных фосфолипаз (ФЛ) Candida albicans впервые сообщили в 1960-х гг. Costa с соавт. и Werner при выращивании дрожжей на твердой среде, содержащей желток яйца или лецитин, и анализе продуктов липидного метаболизма. Позднее фосфолипазная активность была обнаружена у многих патогенных штаммов С. albicans при использовании сред, содержащих сыворотку крови и эритроциты барана. Наблюдение того факта, что С. albicans секретирует фосфолипазы, подтолкнуло Pugh и Cawson (1975) к разработке лецитин-зависимого цитохимического метода выявления этого фермен-
та. В последующем авторы использовали этот метод в дополнение к оценке кандидозной инвазии и для определения места продукции фосфолипаз при заражении хорионаллантоисной оболочки куриного эмбриона. Инвазию инициировали нанесением бластоспор С. albicans на мембрану что приводило к стимуляции клеточных изменений в них. Многие бластоспоры образовывали гифы, в которых активность фосфолипаз концентрировалась в растущих верхушках и, если гифы находились в непосредственном контакте с мембраной, активность ферментов была максимальной. Более того, только гифы могли успешно внедряться в мембрану. Основываясь на этих результатах, исследователи предположили, что внеклеточные фосфолипазы имеют значение для инвазии тканей С. albicans.
Другие исследования были нацелены на разработку простых методов выявления кандидозных фосфолипаз. Так, Odds и Abbott (1980) измеряли внеклеточного фосфолипазную и лиз о-фосфолипаз-ную активности у С. albicans, основываясь на том, что фосфатидилхолин (ФС) гидролизуется, образуя лизо-фосфатидилхолин (лизо-ФС). Небольшое количество этих продуктов деградации авторы всегда выявляли. Недостатком подобного анализа является его длительность и, следовательно, невозможность использования для тестирования большого количества изолятов одновременно. Описан чашечный метод для выявления активности фосфолипаз у С. albicans, позволяющий обойти этот недостаток. Поскольку желток яйца содержит большое количество фосфолипидов, преимущественно ФС и фосфа-тидилэтаноламина, его включали в агаризованную среду Сабуро с глюкозой. При росте на этой среде фосфолипазопозитивные изоляты Candida spp. образовывали отдельную, четко отграниченную, плотную белую зону преципитации вокруг колонии. Эта белая зона, возможно, обусловлена формированием комплекса кальция с жирными кислотами, образующимися под действием фосфолипазы на фосфолипидах, находящихся в желтке яйца. В этом анализе фосфолипазную активность определяли как соотношение диаметра колонии и диаметра плотной белой зоны преципитации вокруг фосфолипазопо-зитивных колоний. Этот простой чашечный метод стал традиционным скрининговым тестом определения активности фосфолипазы для видов Candida и других грибов, например Cryptococcus neoformans. В наших исследованиях на его основе, с помощью компьютерной микроскопии и морфометрического анализа, был разработан показатель- коэффициент вирулентности С albicans, служащий дополнительным критерием дифференциации кандидоза от кан-дидоносительства [1]. Но, поскольку яичный желток содержит субстраты для фосфолипазы (фосфолипиды) и для липаз (триглицериды), анализ с яичным желтком недостаточно специфичен, поэтому его использование больше оправдано лишь при первичном скрининге. Обнаружение фосфолипазной активнос-
ти необходимо проводить специфическим радиометрическим или колориметрическим методом при использовании концентрированного культурального фильтрата, применительно к штаммам с низкой продукцией фосфолипаз особенно.
Типы кандидозных фосфолипаз
Термин «фосфолипазы» относят к гетерогенной группе ферментов, которые обладают способностью гидролизовать одну или более эфирных связей в глицерофосфолипидах. Хотя для всех фосфолипаз субстратами являются фосфолипиды, каждая разновидность фермента обладает способностью катализировать реакцию расщепления специфической эЛипной связи Ппи этом заглавными буквами А В С и D обозначают специфические связи - мишени для ФЛ в фосфолипидных молекулах (Рис.1).
Л 1--
\о
HX-O-C-R
R-CVO-C-H
/ НлС-ОгР-ОжХ
Л2"
с- -D
Рис. 1. Места действия фосфолипаз А1, А2,
В, С на эфирные связи в фосфолипиде
В научной литературе имеются противоречивые сведения о количестве и специфических типах фос-фолипаз, секретируемых С. albicans. Сообщено о секреции фосфолипазы А (ФАА) и фосфолипазы С (ФАС) этими клинически значимыми грибами. Так, показано, что С. albicans секретирует три типа фос-фолипаз- лизо-ФЛ, лизофосфолипазу-трансацилазу (LPTA) и фосфолипазу В (ФЛВ). Takahashi и соавт (1991) получили в очиттгенном виле лве различные формы LPTA из фильтрата культуры Эти ферменты из клеток С. albicans отличались от ферментов трзпитвд:1еш[МГ]яЛ ,ттр тМИндиjnnuiimO<M,V f Oftj-ibv о л — няк-о их губгтпятняя гттР1гм(Ъмчногть hp бьтля оттпр-леГена Отечественные автооы указывав на то что
Лолипая с о п т и ™ . \ A1ZCZU2ZA - Tb и 8 6 m В 1мбпяТ7 карточной стрнкр ™бя солрп
Z, I t «TZ fT;! ™Z ! Z'
ролитическое отщепление жирной кислоты от второго атома углевода в фосфолипиде. Продукт этого гидролиза (лизофосфатид) отличается высокой токсичностью и вызывает разрушение клеточных мембран. Цитохимическими методами показано [3,4], что этот фермент концентрируется преимущественно в кончиках гиф.
О способности различных видов Candida продуцировать фосфолипазы
Ранее показано, что только С. albicans продуцирует внеклеточную фосфолипазу Samaranayake и соавт. (1984) проводили скрининг изолятов Candida spp. на фосфолипазную активность, используя планшетный метод, и обнаружили, что 79% протестированных штаммов С. albicans продуцировали фосфолипазы, в то время как ни один из штаммов С. tropicalis, С. gla-brata и Сparapsilosis не образовывали этих ферментов. Количество фосфолипаз, продуцируемых С. albicans, варьировало в разных изолятах и зависело от локализации инфекции. Штаммы, выделенные из крови, обычно секретировали значительно большие количества фермента, чем изоляты из ран или мочи. Напротив, Clancy и соавт. [5] показали, что не-albi-cans виды Candida тоже продуцируют внеклеточные фосфолипазы, определяемые по методу с яичным желтком и колориметрическим анализом. В их исследовании 41% штаммов Cglabrata, 50% С parapsilosis, 70% С. tropicalis, 80% С. lusitaniae и 100% С. krusei продуцировали распознаваемые, хотя и значительно меньшие, по сравнению с С. albicans, количества фос-фолипаз (например, у Ckrusei их активность ниже примерно в 10 раз). Хотя Clancy и соавт. показали, что не-albicans виды могут, подобно С. albicans, сек-ретировать фосфолипазу, уместно напомнить, что количество тестированных изолятов Candida spp. было ограниченным (п=51). Кроме того, расхождение, наблюдаемое различными авторами при оценке активности фосфолипаз для видов не-albicans, может быть связано и с межштаммовой вариабельностью.
С. glabrata все чаще идентифицируют как важный нозокомиальный патоген. Он стоит третьим в ряду видов Candida по числу сообщенных случаев канди-демии. С. glabrata имеют клиническое значение не только вследствие возрастания частоты встречаемости, но также и потому, что они ассоциируются с высокой частотой при осложнениях с высокой смертностью. Так, Clancy и соавт. сообщили о выявлении экстрацеллюлярной фосфолипазной активности у С. glabrata и привели данные, подразумевающие ее участие как фактора вирулентности у пациентов с кандидемией. В этом исследовании фосфолипазную активность изучали у 51 не-albicans вида Candida {Cglabrata, 22; С.parapsilosis, 12; С tropicalis, 10; С. lusitaniae, 5; С. krusei, 2), выделенных от пациентов с кандидемией. Фосфолипазную активность обнаруживали в 53% изолятов. Как и в случае С. albicans, ФЛВ и лизо-ФЛВ обусловливали 100% фосфо-липазной активности. В супернатантах, собранных от различных тестированных изолятов С. glabrata, не выявляли какой-либо активности ФЛЛ или ФЛС. Общепризнанно, что среди Candida есть как фос-фолипазоположительные, так и фосфолипазоотри-цательные штаммы [2,6], но факторы и механизмы, определяющие проявление фосфолипазной активности грибами этого рода, как и многими другими микроорганизмами, изучены еще недостаточно [7].
Данные о корреляции между фосфолипазной активностью и вирулентностью
Хотя о значении фосфолипаз в патогенезе бактерий и простейших известно давно, исследования, в которых эти ферменты ассоциируются с грибковой вирулентностью, были предприняты лишь в последнее время. Barrett-Bee и соавт. (1985) впервые оценили роль внеклеточных фосфолипаз Candida spp. в их вирулентности, используя мышиную модель кан-дидоза. При измерении фосфолипазной активности у шести видов дрожжей (4 штамма С. albicans и по одному штамму С. parapsylosis и S. cerevisiae) была обнаружена корреляция между фосфолипазной активностью и двумя возможными параметрами патогенности. Изоляты С. albicans, которые наиболее прочно адгезировались к щечным эпителиальным клеткам и были наиболее патогенными для мышей, имели наибольшую активность фосфолипазы. Менее патогенные изоляты С. albicans, С parapsylosis и S. cerevisiae с меньшими адгезивностью к эпителиальным клеткам и летальностью для мышей имели и меньшую фосфолипазную активность. Хотя этими данными подтверждается взаимосвязь между фос-фолипазной активностью и вирулентностью Candida spp., наблюдаемые различия в их вирулентности могут быть обусловлены другими факторами (кроме фосфолипазной активности). Более того, Samaranay-ake и соавт. [8] не обнаружили связи между экспрессией ФЛВ и другими факторами вирулентности у штаммов С. albicans, изолированных от пациентов, больных СПИД.
Для определения роли фосфолипаз в вирулентности Candida sp. Ibrahim и соавт. (1995) использовали две стратегии: 1) сравнение способности изолятов С. albicans из крови больных и оральных штаммов от здоровых добровольцев продуцировать фосфолипа-зы и 2) сравнение патогенности клинических изоля-тов с различными уровнями секреции фосфолипаз в мышиной модели диссеминированного кандидоза. В первом сравнительном исследовании были протестированы 11 изолятов С. albicans из крови пациентов с диссеминированным кандидозом и 11 «ком-менсальных» изолятов. Значительно более высокие уровни продукции фосфолипаз были обнаружены у изолятов из крови по сравнению с комменсалами. Кроме того, они значительно быстрее «созревали», и их ростковые трубки были значительно длиннее. Очевидно, что возбудители генерализованной инфекции, в отличие от комменсалов, могут обладать усиленной экспрессией нескольких факторов вирулентности, включая скорость созревания и продукцию фосфолипаз, что обеспечивает им возможность проникать в ткани организма-хозяина.
В том же исследовании Ibrahim и соавт. проспективно изучили 9 изолятов из крови в отношении экспрессии факторов вирулентности, включая продукцию фосфолипаз, адгезивность, созревание, скорость роста и способность к повреждению эндотелиальных клеток. Среди изученных факторов
вирулентности только активность внеклеточных фосфолипаз обладала прогностическим значением в отношении смертности.
В целях получения дальнейшей информации о значении фосфолипаз в характеристике патогенности Candida spp., сравнивали вирулентность двух изолятов С. albicans (САЗО и СА87) в модели на новорожденных мышах. Единственным явным различием в экспрессии факторов вирулентности между двумя штаммами была повышенная способность САЗО к продукции фосфолипаз.
Для того, чтобы определить, имеется ли корреляция между фосфолипазной активностью и «клинической вирулентностью», Clancy и соавт. [5] классифицировали изоляты С. glabrata по двум группам: персистирующие изоляты — это штаммы, которые оставались в крови, несмотря на терапию антифун-гальными препаратами, эффективными in vitro, и удаление всех внутривенных катетеров, а непер-систирующие изоляты— штаммы, которые можно было элиминировать. Среди протестированных не-albicans видов Candida связь между фосфолипазной активностью и персистирующей кандидемией была наиболее сильной в случае с С. glabrata. Кроме того, «медианная активность» ФЛВ и лизо-ФЛВ была наибольшей у персистирующих изолятов (9,5 и 24 пмоль/л соответственно) по сравнению с неперсис-тирующими(0и5,8пмоль/мг).
Механизмы, с помощью которых фосфолипа-зы повышают вирулентность Candida
Механизмы, определяющие вирулентность Candida spp. через посредство секретируемых ФЛ, до настоящего времени окончательно не определены. Есть основания предполагать, что эти ферменты участвуют на ранних этапах инвазии организма (адгезия, пе-нетрация и повреждение).
Многие исследователи приводят доказательства участия фосфолипаз в микробной адгезии к клеткам хозяина. В одной из работ [9] представлены факты о том, что эти ферменты опосредуют адгезивные взаимодействия между клетками макроорганизма и С. tropicalis. Кроме того, была выявлена корреляция между способностью дрожжей, включая С. albicans, адгезироваться к щечным эпителиальным клеткам и их фосфолипазной активностью. Напротив, два изо-лята С. albicans различались по способности продуцировать фосфолипазы, и слабые продуценты с большей авидностью адгезировались к гастроинтестинальному тракту новорожденных мышей, чем клетки — активные продуценты фосфолипаз. С другой стороны, фосфолипазы могут облегчать адгезию в некоторых (но не во всех) организмах или при некоторых специфических условиях. При сравнении способности ФЛВ-дефицитных мутантов и родительских штаммов адгезироваться к эпителиальным и эндотелиальным клеткам с помощью стандартного анализа in vivo показано, что адгезивность (в %) для ФЛВ-дефицит-ного мутанта и родительского штамма к эпителиаль-
ным клеткам (НТ-29) составила 36±3,9% и 35±2,2% соответственно [10]. Аналогично, не обнаруживали значительной разницы в способности изогенных пар штаммов адгезироваться к эндотелиальным клеткам пупочной вены у человека (HUVE C). Эти данные свидетельствуют о том, что ФЛВ, по-видимому, напрямую не влияет на способность клеток С. albicans ад-гезироваться к клеткам макроорганизма.
Поскольку мишенью фосфолипаз являются фосфолипиды мембран, постольку именно их повреждение, очевидно, является основным механизмом, объясняющим возрастание вирулентности микробов. Возможно, с этим связано и более легкое проникновение инфицирующего агента in vivo. В этом контексте Klotz и соавт. (1983), показали, что грибы сначала адгезируются к эндотелию, а затем проникают в него, нарушая «непрерывность» эндотелиальных клеток. Авторы объясняют «растворение» части эндотелиальных клеток фосфолипазной активностью. Были описаны аналогичные предположительные доказательства значения ферментной активности С. albicans в пенетрации глоточного эпителия у крыс и человека, о подобном механизме в цервикальной ткани и коже у мышей. Недавно в опытах да vitro и in vivo были получены новые доказательства участия фосфолипазы в пенетрации и повреждении клеток организма. В исследованиях in vitro сравнивали способность родительских и ФЛВ-дефицитных штаммов проникать в монослой эпителиальных и эндотелиальных клеток. Leidich и соавт. [11], используя сканирующую электронную микроскопию, показали, что как родительские, так и caPLBl-дефицитные мутанты формируют ростковые трубки, которые проникают в HUVEC и НТ-29-клетки. Процент пенетрирующих родительских гифов составляет 66,7±1,7% для линии эндотелиальных клеток и 57,8±2,5% — для линии эпителиальных клеток. Напротив, процент пенетрирующих ФЛВ-дефицитных гифов составил 37,3±1,3% для HUVEC (р< 0,0002) и 29,0±2,9% — для НТ-29 клеточных линий (р<0,0003). В этих же экспериментах сравнивали повреждение, вызванное супернатантами, полученными из клеток С. albicans и непатогенного S. cerevisiae. В отличие от значительного повреждения, вызванного С. albicans, S. cerevisiae вызывали лишь минимальное повреждение (3,95±0,48%). Seshan и соавт. [12] в опытах in vivo показали, что кандидозная ФЛВ облегчает проникновение Candida spp. в ткани хозяина. Эти авторы, используя орально-интрагастральную модель кандидоза у новорожденных мышей, показали, что продуцирующие фосфолипазу родительские штаммы глубоко проникают в слизистую оболочку желудка и субмукозные ткани после интрагастрального заражения. Напротив, caPLBl-дефицитные мутанты были не так инвазивны и, в основном, секвестрировались в просвете желудка.
Таким образом, снижение способности caPLBl-дефицитных штаммов проникать через желудочнокишечный тракт и вызывать системную инфекцию в
сочетании с их сниженной способностью проникать в монослой клеток хозяина, а фосфолипаз — лизиро-вать клетки хозяина, подтверждают, что ФЛВ может играть роль в вирулентности Candida spp. благодаря прямому повреждению мембран клеток макроорганизма.
Выполняют ли внеклеточные фосфолипазы другие функции, способствующие вирулентности?
Основываясь на данных, полученных при исследовании бактериальных фосфолипаз, можно полагать, что грибные фосфолипазы, кроме повреждения клеточных мембран, могут выполнять и другие функции, облегчающие проявление вирулентности, например, в передаче сигналов, стимуляции клеток организма к выбросу цитокинов и воспалительном ответе макроорганизма.
Многочисленные липиды и производные липидов, образующиеся под действием фосфолипаз, действующих на фосфолипидные компоненты в клеточных мембранах макроорганизма, участвуют в передаче сигналов в качестве медиаторов и вторичных посредников. ФЛ с Candida spp. могут участвовать также в пока не идентифицированном механизме передачи сигналов, потенцируемом на лизофосфо-липидном уровне. В этом отношении имеются сообщения об индукции активации протеинкиназы С под действием попутных продуктов деградации ФЛВ, таких как лизофосфолипиды. Активация протеин-киназы С, возможно, играет роль в дизрегуляции клеточных сигналов посредством местных эффектов или вследствие общих влияний на физиологию клеток макроорганизма.
Стимуляция клеток организма к продукции цито-кинов в ответ на растворимые факторы микробного происхождения доказана для многих микроорганизмов [13]. Показано, что микробные фосфолипазы являются мощными агентами, индуцирующими накопление в очаге эффекторных клеток и плазменных белков, а также выброс различных медиаторов воспаления in vivo. Поскольку продукция фосфолипаз тесно связана с повреждением клеток макроорганизма Candida spp., вполне допустимо, что этот фермент может непосредственно или косвенно стимулировать клетки организма к продукции специфических цитокинов. Получение очищенных грибковых фос-фолипаз и изогенных пар штаммов, отличающихся только по продукции фосфолипаз, перспективно для тщательного исследования в данном направлении.
Грибковые фосфолипазы как мишени для диагностики и терапии
Значение ФЛ как фактора вирулентности у
С. albicans при использовании животных моделей гематогенно-диссеминированного и гастроинтестинального кандидоза и выявление этого гидролитического фермента у других патогенных грибов, включая Cryptococcus neoformans, Aspergillusfumigatus и A.flavus, делает ее потенциальной терапевтической
мишенью. Более того, данные о том, что фосфоли-пазы секретируются различными клинически важными видами грибов, и доказательства того, что эти грибы имеют одинаковый класс фосфолипаз, а именно — ФЛВ, подтверждают, что эти гидролитические ферменты могут представлять общий механизм, используемый патогенными грибами в качестве универсального фактора вирулентности. Если это так, то можно применять разнообразные подходы к разработке препаратов и средств, направленных на грибковые литические ферменты [14]. Эти подходы включают создание вакцин, поиск агентов, ингибирующих их продукцию или секрецию либо блокирующих структурные компоненты этих белков [10].
Предварительные попытки определить ингибиторы кандидозных фосфолипаз уже были предприняты ранее; авторы проводили скрининг синтетических веществ, ингибирующих ФЛ, используя модели in vitro и in vivo. Их усилия привели к определению свинец-содержащих структур, способных подавлять фосфолипазную активность in vitro. Кроме того, отмечали пролонгирование выживания животных при использовании этих веществ вместе с флуконазолом. В другой работе [15] описана взаимосвязь чувствительности грибов к амфотерицину В и их фосфоли-пазной активностью. Результаты вышеупомянутых исследований в какой-то мере подтверждают концепцию о возможности использования грибковых фосфолипаз в качестве терапевтических мишеней и обосновывают системный подход для открытия лекарственных веществ с учетом роли этого типа ферментов.
Другое перспективное направление— использование внеклеточных грибковых фосфолипаз для диагностики. Поскольку было показано, что сыворотка пациентов с системным кандидозом содержит антитела, реагирующие с очищенной кандидозной ФЛВ, вполне допустимо, что именно этот антиген может быть применен в анализе на выявление антител. ФЛВ обладает большим числом преимуществ, которые делают ее привлекательной в плане разработки диагностических методов: 1) она является естественно секретируемым белком, а не клеточным или цитоплазматическим компонентом, за исключением ас-партил-протеиназ; 2) она является рафинированным, хорошо обозначенным антигеном, а не смешанным экстрактом, содержащим полисахариды клеточной стенки; 3) изоляты из крови обычно секретируют значительно большие количества этого фермента, чем выделенные из ран и мочи или ротовой полости здоровых людей.
Секреция ФЛВ большим количеством патогенных грибов, включая Candida spp., Cryptococcus neoformans и Aspergillus spp., может дать толчок к созданию высокоспецифичных и чувствительных диагностических тестов. Эта возможность может быть реализована, если станет более доступной информация о генах, кодирующих ФЛ соответствующих патогенов, и эти белки будут очищены.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Целью данного обзора была оценка современных знаний о грибковых фосфолипазах, с особым акцентом на их возможною роль в вирулентности. Ясно, что мы находимся лишь в начале пути, а впереди— удивительные просторы для будущих исследований. Среди патогенных грибов клонирование, расщепление и оценка причастности к вирулентности генов, кодирующих внеклеточные фосфолипазы, были завершены лишь для С. albicans, а усилия по клонированию генов, кодирующих эти ферменты у других видов, еще предстоит предпринять и провести. Исследования, направленные на определение роли фосфолипаз в вирулентности различных патогенных грибов, должны показать, являются ли эти ферменты для них универсальными факторами вирулентности.
Выявление механизмов, с помощью которых фос-фолипазы усиливают вирулентность, представляет собой другую область, заслуживающую внимания. Актуальны также разработки по очистке грибковых фосфолипаз, что должно помочь в разработке проти-
вогрибковых препаратов, воздействующих на новые мишени в клетках. Пока недостаточно информации о регуляции генов фосфолипаз in vivo, так же как и о том, действует ли этот класс ферментов, повышая вирулентность грибов, в координации с другими ферментами такими, например, как аспартат-про-теиназы. Исследования в этой области помогут нашему пониманию патогенеза грибковой инфекции. Хотя механизмы, которые модулируют вирулентность грибов, до конца не расшифрованы, предварительные данные свидетельствуют о том, что прямое повреждение и лизис клеток организма-хозяина являются основными факторами, способствующими грибковой вирулентности. Как только значимость фосфолипаз при этом будет окончательно доказана, станет обоснованной и реальной перспектива использования литических ферментов в качестве терапевтических мишеней и/или основы для разработки вакцинных препаратов. Возможность применения фосфолипаз как диагностических маркеров грибковых инфекций все еще остается заманчивой областью исследований, которые смогут оказаться плодотворными.
ЛИТЕРАТУРА
1. Карпунина Т.И., Трухина Е.В., Олина А.А. Способ диагностики вагинального кандидоза. Приоритетная справка ВНИИГПЭ № 2005108241 о выдаче Патента на изобретение РФ от 23.03.2005 г.
2. Кубась В.Г., Аанилова О.П., Чайка Н.А. Кандидозная инфекция. - СПб., 1996,— С. 46.
3. Ghannoum М.А. Extracellular phospholipases as universal virulence factor in pathogenic fungi//J. Med. Mycol.— 1998,-Vol.39.- P. 55-59.
4. Hillier S.L., Lau R.J. Vaginal microflora in postmenopausal women who have not received estrogen replacement therapy// Clin. Infect. Dis.- 1997,- Vol.25, Sup. 2. - P. 123-126.
5. Clancy C.J., Ghannoun M.A., Nguyen MM. Programs Abstr. 36th Annu. Meet. //Infect. Dis. Soc. Am., abstr. -1998.-P. 317.
6. Naglik J.R., Challacombe S.J., Hube B. Candida albicans Secreted Aspartyl Proteinases in Virulence and Pathogenesis// Microbiol. Mol. Biol. Rev.— 2003,— Vol.67.— P. 400-428.
7. Mukherjee P.K., Seshan K.R., Leidich S.D., et al. Reintroduction of the PLB1 gene into Candida albicans restores virulence in Vwo 11 Microbiology- 2001.-Vol.147.-P. 2585-2597.
8. Samaranayake Y.H., Dassanayake R.S., Jayatilake J.A., et al. Phospholipase В enzyme expression is not associated with other virulence attributes in Candida albicans isolates from patients with human immunodeficiency virus infection // /. Med. Microbiol.- 2005.-Vol.54.-P. 583-593.
9. PrakobpholA., LefflerH., Fisher S.J. Specific adherence of Candida tropicalis to lysophospholipids// Biochemistry-1998.-Vol.33.- P.9496-9503.
10. Ghannoum M. Potential Role of Phospholipases in Virulence and Fungal Pathogenesis //Clin. Microbiol. Rev.-2000.-Vol,-13,№1.-P.122-143.
11. Leidich S.D., Ibrahim A.S., Fu Y., et al. Cloning and disruption of caPLBl, a phospholipase В gene involved in the pathogenicity of Candida albicansU J. Biol. Chem.- 1998,- Vol.273.-P.26078-26086.
12. Seshan K.R., Vitullo J.C., Leidich S.D., et al. A genetically defined phospholipase B-deficient Candida albicans mutant is less virulent in the oral-intragastric infant mouse model. Submitted for publication.
13. Eckmann L., Reed S. L., Smith J. R., Kagnoff M.FEntamoeba histolytica trophozoites induce an inflammatory cytokine response by cultured human cells through the paracrine action of cytolytically released interleukin-lCt // J. Clin. Investig. - 1996,- P.1269-1279.
14. Ripeau J.-S., Aumont F, Belhumeur P., et al. Effect of the echinocandin caspofungin on expression of Candida albicans secretory aspartyl proteinases and phospholipase in vitro// Antimicrob. Agents Chemother. -2002.-Vol.46.-P. 3096-3100.
15. Gottfredsson M., Jessup C. J., Cox G. M., et al. Fungal phospholipase activity and susceptibility to lipid preparations of amphotericin B// Antimicrob. Agents Chemother- 2001.-Vol.45.-P. 3231-3233.
Поступила в редакцию журнала Рецензент: Т.С.Богомолова
15.11.06
