CC BY
1
ВЕСТНИК МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ 17. ПОЧВОВЕДЕНИЕ. 2024. Т. 79. № 3 LOMONOSOV SOIL SCIENCE JOURNAL. 2024. Vol. 79. No. 3
ПОЧВОВЕДЕНИЕ И ОХРАНА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ \<®ща
УДК 631.453:631.438:576.08
DOI: 10.55959/MSU0137-0944-17-2024-79-3-170-179
ФОРМЫ ТОКСИЧНОСТИ ПОЧВ ТЕРРИТОРИЙ С ВЫСОКОЙ СТЕПЕНЬЮ ДОЛГОВРЕМЕННОГО РАДИОНУКЛИДНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ, ВЫЯВЛЯЕМЫЕ ТВЕРДОФАЗНЫМ БИОТЕСТОМ С ALLIUM CEPA
В. В. Столбова*, А. И. Щеглов, Г. И. Агапкина, Д. В. Манахов, О. Б. Цветнова
МГУ имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения, 119991, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 * E-mail: [email protected]
В статье представлены результаты измерения токсичности почв с удельной активностью 137Cs в диапазоне 3,3х102-1,3х106 Бк-кг-1, плотностью потока ^-частиц и мощностью дозы у-излучения на поверхности насыпного образца 5,4-192,7 имп-с-1-см-2 и 0,2-2,7 мкЗв-ч-1 соответственно. Формы токсичности выявляли в твердофазном биотесте с Allium cepa L., имитирующим ситуацию внешнего облучения делящихся клеток при контакте с почвой. Токсический эффект оценивали относительно контроля как митотоксичность по снижению митотического индекса и как генотоксичность по индукции хромосомных аберраций с учетом вклада кластогенного эффекта. Величина митотического индекса в серии биотестов с загрязненной почвой снижалась до значений 8,6±1,1-14,6±2,3% по сравнению с контрольным уровнем пролиферации в 14,9±1,2%. При этом частота хромосомных аберраций сопряженно возрастала от 4,7±0,3 до 18,2±3,3%, при контрольном уровне в 3,9±0,5%, с возрастанием до 68% доли нарушений, связанной с кластогенным воздействием на хромосомы. Выявлен ряд значимых корреляций между величинами индексов токсичности и показателями радиоактивного загрязнения почв.
Ключевые слова: радиоактивное загрязнение, внешнее контактное облучение, цитогенетический анализ, митотический индекс, частота хромосомных аберраций, кластогенный эффект, бета-излучение.
Введение
В составе аварийного радиоактивного загрязнения почв присутствуют долгоживущие изотопы, которые с течением времени закрепляются минеральной частью почв в процессе так называемого «старения» радионуклидов [Щеглов, 2000; Радиоэкологические последствия..., 2018]. Даже в отдаленные по времени этапы после радиационных аварий загрязненная радионуклидами почва остается радиоактивной, создавая уровни хронического облучения, способные оказывать влияние на протекание важнейших биологических, в том числе генетических процессов и представлять опасность для человека [Крупные радиационные аварии., 2001; Ярмоненко, Вайнсон, 2004; Гераськин и др., 2021]. Учитывая мутагенность радиационного фактора в аспекте современной беспороговой концепции его нормирования [Ильин и др., 2010], особого внимания заслуживает изучение влияния радиоактивного загрязнения на генетический материал и протекание генетических процессов. Нарушения
процесса митоза, которые лежат в основе канцерогенеза млекопитающих и человека [Ярмоненко, Вайнсон, 2004; Gisselson, 2008], фиксируются методами биотестирования с использованием цито-генетического анализа данных. Биотест на основе клеток корневой апикальной меристемы лука репчатого (Allium cepa L.) выявляет различные формы генетической токсичности радиационного фактора, он обладает системой оценки метаболической активации и рекомендован к использованию в экологических исследованиях, при этом отмечается согласованность результатов с данными по тест-системам крови человека [Пяткова и др., 2009; Уда-лова и др., 2016; Saghirzadeh et al., 2009; Bolsunovsky et al., 2019]. Методика твердофазного (аппликат-ного) биотестирования [Терехова и др., 2023], обеспечивающая контакт радиочувствительных делящихся клеток с твердой фазой радиоактивно загрязненных почв, позволяет в строго стандартных условиях обнаружить цитогенетические эффекты облучения от этого фактора [Stolbova et al., 2018]. Для человека такая ситуация возможна при
© Столбова В.В., Щеглов А.И., Агапкина Г.И., Манахов Д.В., Цветнова О.Б., 2024
инкорпорации радионуклидов аэрального выброса. При вдыхании пыли и радиоактивных частиц почвы возможна ситуация облучения клеток поверхностных тканей верхних дыхательных путей [Ильин и др., 2010]. Для мелких объектов биоты такая геометрия облучения учитывается при разработке подходов к оценке доз в рамках системы экологического нормирования радиационных нагрузок [РеПгеаШ, Woodhead, 2001].
Целью настоящей работы являлось в условиях твердофазного тестирования по цитогенетическим показателям выявить формы и возможный механизм токсичности почв, загрязненных техногенными радионуклидами, а также установить стати-
стическую связь между индексами токсичности и показателями радиоактивного загрязнения.
Объекты и методы
Объектами данного исследования послужили образцы почв (отбор 1998 г.) из 30-километровой зоны отчуждения Чернобыльской атомной электростанции (ЧАЭС) и с территории Брянской области (отбор 2014 г.), характеризующихся высокими уровнями радиоактивного загрязнения (табл. 1).
Образцы хранились в контейнерах со свинцовой защитой в воздушно-сухом состоянии при комнатной температуре. Определение удельной активности 137Cs проводили на гамма-спектроме-
Таблица 1
Характеристика площадок пробоотбора и образцов почв для измерения токсичности в условиях твердофазного теста с Allium cepa L.
Расстояние и направление от ЧАЭС Характеристика образца Характеристика ландшафта и биоценоза Плотность загрязнения 137Cs на 1986 г., МБк-м-2 Ссылки
Киевская обл.
30-километровая зона, Новошепеличи, 2,5-4,5 км на З Слабоподзолистая слабо-дифференцированная песчаная, АОН рН 4,4 Гумус 2,21% Элювиальный, широколиственно-сосновый лес 44,73
30-километровая зона, Новошепеличи, 4,5-5,5 км на С-З Вторично-оподзоленная песчаная, А1 (А2) +АОН Элювиальный, культуры сосны 5,05
30-километровая зона, Новошепеличи, 5,5-9,5 км на С-З А1 А2 Элювиальный, культуры сосны [Щеглов, 2000]
30-километровая зона, Новошепеличи, 9,5-14,5 км на С-З А2 Элювиальный, культуры сосны
30-километровая зона, Копачи, 1-4 км на Ю-В Вторично-оподзоленная песчаная, АОБ рН 5,1 Гумус 1,71% Транзитно-аккумулятивный, сосняк разнотравно-зеленомошный 2,9
30-километровая зона, Дитятки, 6-7 км на Ю Подзолистая иллювиально-железистая песчаная, А1 А2 рН 4,6 Гумус 1,29% Элювиальный, широколиственно-сосновый лес 0,24
Брянская обл.
Брянская область, п. Красная гора, 220 км на СВ-С Дерново-слабоподзолистая песчаная, АОН pH 4,93 Гумус 1,24% Элювиальный, сосняк-зеленомошник 2,26 [Касацкий, 2015]
Московская обл.
Контроль, Зеленоградский опорный пункт ФГБНУ «Почвенный институт им. В.В. Докучаева» Освоенная дерново-подзолистая (агродерново-подзолистая) почва, Апах pH= 6,4 Гумус 1,05% [Котельникова, 2019]
тре «Мультирад». Измерения потоковых характеристик излучений и мощности дозы гамма-излучения велись в непосредственной близости от поверхности насыпного образца почвы. Для измерения интенсивности ^-излучения использован счетчик частиц СКС-99 «Спутник» (БДС №671, БУ 16-25-2008) с контрольным источником 905г-90У № 588-2008. Фоновые значения в течение периода измерений колебались от 0,372 до 0,682 имп-с-1. Калибровка источника — 99 имп-с-1, энергия измерения — 900-9000 кэВ. Для измерения мощности дозы у-излучения использовался дозиметр-радиометр МКС-АТ 6130С.
В качестве биотестера использовали семена лука репчатого А. сера, сорт «Штуттгартен Ризен». Предподготовка тестера включала предварительное 48-часовое проращивание семян во влажной камере в темноте при комнатной температуре. Затем эксикатор с семенами для синхронизации клеточного цикла в клетках меристемы корешков проростков на 24 часа помещали в холодильник (4-6оС). В серии испытаний брали только проклюнувшиеся семена. Почвенные образцы тестировались в 4-х кратной повторности по ранее разработанной нами методике ^оШоуа et а1., 2018]. Помещали по 20 проклюнувшихся семян на поверхность почвенной пасты в чашках Петри и культивировали проростки при комнатной температуре во влажной камере в темноте. Для исключения наложения полей у-излучения во время испытания каждая чашка Петри была отгорожена по периметру свинцовыми блоками от расположенных рядом тестируемых образцов. Также свинцовая защита ограждала всю площадь экспериментальной площадки во время экспозиции биотеста. Такая геометрия свинцовой защиты не позволяла провести единовременное тестирование всех почвенных образцов в 4-х кратной повторности из-за ограничений места на экспериментальной площадке, поэтому эксперимент состоял из двух серий испытаний, разнесенных по времени проведения, а каждая серия включала по две повторности. Время экспозиции при данных уровнях радиоактивного загрязнения составляло 48 часов, что соответствует времени прохождения более двух клеточных циклов в корневой меристеме А. сера.
Подготовку к цитогенетическому исследованию проводили по стандартной методике приготовления препаратов из корневой меристемы [Пауше-ва, 1988; Барыкина и др., 2004]. Препараты окрашивали 2% ацетоорсеином (Sigma-Aldrich, США). Микроскопирование проводили с использованием микроскопа «Микмед-6» с тринокулярной насадкой (ОАО «ЛОМО», Россия). Митотический индекс рассчитывали как отношение числа клеток в митозе к общему числу просмотренных клеток препарата, а частоту хромосомных аберраций — как отношение числа клеток с аберрациями к общему количе-
ству делящихся. Определение видов хромосомных аберраций проводилось по конфигурации окрашенных хромосом с выделением группы нарушений, связанных с проявлением кластогенного эффекта. Анализировали спектр нарушений согласно классификациям, представленным в работах [Паушева, 1988; Дубинин, 2000; Столбова и др., 2019; Gisse1son, 2008; Bo1sunovsky et а1., 2019]. Отмечали: анафазные мосты различной конфигурации, тяжи в телофазе, одиночные и множественные фрагменты и хро-матидные пробелы — лежащие строго на одной линии фрагменты хромосомы, разделенные непро-крашенными участками, а также микроядра как последствия фрагментации хромосом, учитываемые в интерфазе; дезорганизацию хромосом в виде слипания, комкования, рассеивания (чаще в метафазе), в том числе в виде полой метафазы и к-митоза (в ме-тафазе); отставания и убегания (чаще в анафазе и при метакинезе), ацентричные митозы, в том числе (много)полярную асимметрию в анафазе.
В качестве контроля для цитогенетических исследований использовали агродерново-подзо-листую почву (Stagnic С^ашс Albe1uviso1) Зеленоградского опорного пункта ФГБНУ «Почвенный институт им. В.В. Докучаева» [Котельникова, 2019], при измерении радиационных характеристик образцов дополнительным контролем служил промытый песок.
Статистическую обработку проводили с учетом объема полученных выборок цитогенетических данных. Для статистической оценки варьирования внутри почвенного образца расчет величин индексов мито- и генотоксичности проводили на основании четырех повторностей с использованием параметрических методов, считая возможным рассматривать долю в данном диапазоне значений как нормально распределенную величину [Дмитриев, 2009]. Средневзвешенные показатели митотиче-ского индекса для почвенного образца оценивали с учетом объема подвыборок в каждой из четырех повторностей. Стандартное отклонение для величины митотического индекса и частоты хромосомных аберраций оценивали при величине доверительной вероятности 95%. Достоверность различий между контрольным и опытными значениями ми-тотического индекса устанавливали на основании ^критерия Стьюдента, считая их значимыми при р <0,05. Второй вариант оценки величины мито-тического индекса вели на основе объединенной выборки цитогенетических данных [Geras'kin et а1., 2005]. Доверительные интервалы долей при этом методе оценивали после углового ф-преобразования для обоснования нормального распределения изучаемой случайной величины [Дмитриев, 2009]. Достоверность различий между контрольным и опытными значениями устанавливали на основании F-статистики. Для частоты хромосомных аберраций рассчитывали точные биномиальные довери-
тельные интервалы Клоппера-Пирсона [Brown et al., 2001] при 95% уровне доверительной вероятности, объединяя подвыборки цитогенетических данных четырех повторных испытаний для почвенного образца. Рассматривали данную консервативную оценку доверительных интервалов как более адекватную в условиях возможного влияния тестовых и почвенных факторов на результат биотеста при малых объемах выборки. Достоверность различий частот хромосомных аберраций с контрольными значениями дополнительно оценивали для объединенной выборки по критерию х-квадрат. Для показателя «доля кластогенного эффекта» рассчитывали биномиальные интервальные оценки методом Клоппера - Пирсона [Brown et al., 2001]. Точный критерий Фишера использовали для обнаружения достоверных отличий от контроля в распределении аберрантных клеток на типы нарушений в ряду тестовых почвенных образцов в условиях малых выборок. Взаимосвязи между показателями оценивали на основании коэффициентов корреляции Спирме-на и методами параметрической статистики после соответствующего ф-преобразования малых долей.
Результаты
Тестируемые почвенные образцы относительно выровнены по свойствам (кислотность, содержание гумуса) и представлены верхними А1 и А2 горизонтами профиля с включением для нескольких проб нижних слоев лесной подстилки. Радиационные характеристики образцов представлены в табл. 2.
Удельная активность 137Cs характеризуется наибольшими величинами как в образцах почв с площа-
док пробоотбора «ближней зоны» выпадений ЧАЭС, расположенных в непосредственной близости (<5 км) от реактора по направлениям «Ново-шепеличи» и «Копачи» — 1 303000-361 200 и 69 000 Бк-кг-1 соответственно, так и в образце с участка «дальней зоны» в Брянской области — 141 400 Бк-кг-1. Сравнение дозовых и потоковых характеристик излучения от почв позволяет отметить значительный вклад ^-компоненты для образцов «ближней» и «дальней» зон чернобыльских выпадений по сравнению с контрольными почвами. Такое соотношение у- и ^-компоненты потока ионизирующего излучения характерно для смеси техногенных радионуклидов - продуктов ядерного деления (ПЯД) [Крупные радиационные аварии., 2001]. При этом можно отметить значительные величины ^-потока для почвы территории Брянской области, которые превышают таковые даже для образцов «ближней зоны» выпадений ЧАЭС в направлении «Копачи» и «Дитятки».
В качестве цитогенетических индексов токсичности почв анализировали изменения величин митотического индекса и частот хромосомных аберраций. В общей частоте выделяли вклад тех видов хромосомных аберраций, которые отражают кластогенное воздействие радиации (разрывы и ошибки репарации ДНК). Данные нарушения представлены к учету как двойные и одиночные фрагменты и мосты, хроматидные пробелы, микроядра (внеядерный хроматин в интерфазе) [Паушева, 1988; Дубинин, 2000; Столбова и др., 2019; Gisselson, 2008; Bolsunovsky et а1., 2019]. Результаты цитогене-тического анализа биоматериала после твердофаз-
Таблица 2
Удельная активность 137Cs) дозовые и потоковые характеристики излучений от поверхности насыпных образцов тестируемых почв (средние показатели по данным на 2023 г.)
Образец почвы, место отбора Удельная активность 137Cs, Бк-кГ1 Мощность дозы у-излучения, мкЗв-ч-1 Интенсивность потока ß-частиц, имп-с-1-см-2
Новошепеличи, 2,5-4,5 км от ЧАЭС 1 303 000±131 500 2,65±7% 192,70±0,90
Новошепеличи, 4,5-5,5 км от ЧАЭС 361 200±36 580 1,51±11% 88,06±0,38
Новошепеличи, 5,5-9,5 км от ЧАЭС 49 210±5 054 0,32±16% 12,15±0,21
Новошепеличи, 9,5-14,5 км от ЧАЭС 5 037±549 0,07±31% 6,00±0,12
Копачи, 1-4 км от ЧАЭС 69 000±7 271 0,20±20% 7,90±0,19
Дитятки, 6-7 км от ЧАЭС 333,90±48,00 0,08±21% 5,40±0,12
Брянская область, 220 км от ЧАЭС 141 400±14 520 0,37±11% 8,92±0,17
Контроль почва 2,35±9,50 0,06±20% 0,25±0,04
Контроль песок 2,67±7,39 0,06±17% 0,04±0,04
Таблица 3
Цитогенетические данные для оценки токсичности почв по ингибированию митотический активности в условиях твердофазного биотеста с Allium cepa при высоком уровне радиоактивного загрязнения образцов почв
Объем Митотический индекс, % Интервальная
Образец почвы, место отбора оценка после ф-преобразования по объединенной выборке Коэффициент вариации а, %
выборки, число клеток повтор-ность теста среднее ± стандарт (средневзвешенное) p-значение F
971 8,1
Новошепеличи, 2,5-4,5 км от ЧАЭС 1809 633 768 10,2 8,0 7,9 8,6±1,1* (9,0) 0,0003 8,1^9,8 82,1** 12,8
971 11,9
Новошепеличи, 4,5-5,5 км от ЧАЭС 832 1703 600 9,1 13,5 9,9 11,1±2,0* (11,7) 0,0179 10,7^12,7 21,2** 17,9
632 6,3
Новошепеличи, 5,5-9,5 км от ЧАЭС 1543 2210 503 9,3 13,2 10,2 9,8±2,8* (10,8) 0,0164 9,9^11,6 40,4** 29,1
587 11,7
Новошепеличи, 9,5-4,5 км от ЧАЭС 703 1304 1970 12,3 11,0 13,7 12,2±1,2* (12,5) 0,0185 11,5^13,4 12,7** 9,4
1700 11,9
Копачи, 1-4 км от ЧАЭС 943 1200 654 13,4 16,1 16,9 14,6±2,3 (14,1) 0,8411 13,1^15,1 1,3 16,0
1510 10,7
Дитятки, 6-7 км от ЧАЭС 986 2123 530 13,9 15,5 14,9 13,8±2,1 (13,7) 0,4062 12,8^14,7 2,8 15,4
518 10,6
Брянская область, 220 км от ЧАЭС 1930 2001 789 11,9 8,3 9,1 10,0±1,6* (10,0) 0,0028 9,2^10,8 61,6** 16,0
1159 16,3
Контроль 2004 976 1747 14,3 13,5 15,3 14,9±1,2 (14,9) 14,0^15,8 8,2
* Достоверное отличие от контроля по t<t005=3,18, ** достоверное отличие от контроля по F <F0>05= 3,8.
ного биотеста для оценки митотоксичности почв представлены в табл. 3.
Для оценки вариабельности величины мито-токсического эффекта, обусловленной неоднородностью тестируемой субстанции внутри почвенного образца, рассчитывали коэффициент вариации. Как видно из представленных данных, наибольшее варьирование токсичности относительно контрольного образца может быть связано как с присутствием в образце примеси подстилки, так и с неоднородностью радиоактивного загрязнения почв вследствие различного удаления от источника выброса, однако выраженного влияния этих факторов на изменчивость выявить не удалось.
Величины цитогенетических индексов для оценки формы генотоксичности почв с высоким
уровнем радиоактивного загрязнения представлены в табл. 4.
По точному тесту Фишера не удалось в условиях данного эксперимента статистически значимо выявить увеличения доли кластогенного эффекта в общей совокупности клеток с патологиями митоза при воздействии загрязненных радионуклидами образцов.
Корреляционный анализ Спирмена выявил достоверную сопряженность рангов для всех результатов измерений радиационных характеристик почв с тестовыми показателями токсичности (данные не представлены). Однако при анализе характера связи величин радиационных характеристик и индексов токсичности после проведения преобразований для выполнения требований к
Таблица 4
Цитогенетические данные для оценки генотоксичности почв с учетом кластогенного воздействия на хромосомы, полученные в условиях твердофазного биотеста с Allium cepa при высоком уровне
радиоактивного загрязнения образцов почв
Образец почвы, место отбора Частота аберраций хромосом, % Кластогенный эффект, доля
выборка, клетки повтор-ность теста среднее ± стандарт (средневзвешенное) интервальная оценка Клоппера-Пирсона выборка, клетки доля кластогенного эффекта интервальная оценка Клоппера-Пирсона
Новошепеличи, 2,5-4,5 км от ЧАЭС 79 185 51 61 27.8 14,3 16,7 13.9 18,2±3,3* (17,3) 13,6^21,6** 65 0,60 0,47^0,72
Новошепеличи, 4,5-5,5 км от ЧАЭС 115 76 230 59 20,1 15,7 13,9 19,0 17,2 ±1,4* (16,3) 13,1^19,9** 78 0,64 52,4^74,7
Новошепеличи, 5,5-9,5 км от ЧАЭС 40 143 292 51 19,7 13,4 23.3 13.4 17,5 ±2,5* (19,4) 16,1 -^23,0** 102 0,57 46,7^66,6
Новошепеличи, 9,5-14,5 км от ЧАЭС 69 86 143 270 6,2 11,3 9,5 7,2 8,6±1,2* (8,3) 6,1^10,9** 47 0,61 46,4^75,5
Копачи, 1-4 км от ЧАЭС 202 126 193 111 4.0 7,9 6,7 4.1 5,7 ±1,0 (5,7) 4,0^7,8 36 0,51 32,9^67,1
Дитятки, 6-7 км от ЧАЭС 162 137 329 79 5,3 4,7 3,7 4,9 4,7±0,3 (4,4) 3,0^6,2 31 0,56 36,0^72,7
Брянская область, 220 км от ЧАЭС 55 230 166 72 13,7 16,5 7,0 9,9 11,8±2,1* (12,3) 9,6 ^15,4** 64 0,68 55,9^79,8
Контроль 189 287 132 267 3,2 4,9 4,5 2,9 3,9±0,5 (3,9) 2,7 ^ 5,4 34 0,47 29,8^64,9
* Достоверное отличие от контроля по t <^05 =3,18, ** достоверное отличие от контроля по Х2>х\05=3,84.
Таблица 5
Коэффициенты корреляции, характеризующие взаимосвязь между величинами цитогенетических индексов и показателями радиационных характеристик почв (объем корреляционного ряда — 8)
Показатель Митотический индекс / ф-величина Доля хромосомных аберраций / ф-величина Мощность дозы у-излучения Интенсивность потока в-частиц
Митотический индекс / ф-величина -0,81* -0,59 / -0,68 -0,54 / -0,65
Доля хромосомных аберраций / ф-величина -0,81* 0,73*/ 0,71 0,67 / 0,65
Удельная активность 137Cs -0,59 / -0,69 0,62 / 0,60 0,96* 0,98*
log удельной активности 137Cs -0,91*/ -0,76* 0,77*/ 0,80* 0,63 0,58
Мощность дозы у-излучения -0,59 / -0,68 0,73*/ 0,71 0,99*
Интенсивность потока р-частиц -0,54 / -0,65 0,67 / 0,65 0,99*
* Значим при p <0,05.
нормальности случайной величины получены иные закономерности (табл. 5).
Наблюдается сильная положительная взаимосвязь (значения коэффициента корреляции 0,98 при р <0,05) между величиной ^-потока и абсолютной величиной удельной активности 137Сэ. Мощность дозы у-излучения также значимо коррелирует с цезиевым загрязнением. Была выявлена значимая положительная корреляция между аберрациями хромосом и дозовой нагрузкой от у-излучения у поверхности почвенного образца — в диапазоне мощности дозы 0,2-2,7 мкЗв-ч-1. Вместе с тем ми-тотический индекс не коррелировал с величиной дозовой нагрузки от у-излучения.
Обсуждение
Достоверное относительно контроля изменение митотического индекса свидетельствует о митоток-сичности почвы, то есть ее способности ингибиро-вать деление клеток. Данная форма токсичности может быть обусловлена как физиологическими, так и генетическими показателями нарушения процесса митоза. Возрастание частоты аберраций хромосом — генотоксичность - может быть связана как с изменением структуры/поверхности хромосом в результате прямого (разрывы ДНК) действия радиационного фактора, так и косвенного (оксидативный стресс) воздействия на аппарат деления и хромосомы [Ярмоненко, Вайнсон, 2004]. Доля кластогенного эффекта в генотоксичности отражает роль разрывов хромосом в нарушении структуры генетического материала в процессе митоза [Saghirzadeh et а1., 2009; Столбова и др., 2019].
Точки пробоотбора, км удаления от ЧАЭС
Митотический индекс, % -Частота патологий деления, %
Рисунок. Сопряженные (по убыванию величины митотического индекса) ряды цитогенетических
показателей (среднее±стандарт), полученные по результатам твердофазного А11шт-теста для почвенных образцов территорий с высоким уровнем техногенного радиоактивного загрязнения
Для анализа вклада различных механизмов, влияющих на процесс митоза и отражающих в биотесте проявление той или иной формы токсичности, нами рассмотрены сопряженные тренды изменения индексов токсичности, представленные на рисунке.
В рядах сопряженных цитогенетических данных, ранжированных по величине митотиче-ского индекса, выявляется вклад в митотоксичность почв (уменьшение митотического индекса) факторов, влияющих непосредственно на хромосомы, что отражается в существенном увеличении показателя частоты аберраций хромосом. При снижении митотического индекса в 1,5 раза частота аберраций хромосом возрастает более чем в 4,5 раза. В работе [Пяткова и др., 2009] также отмечается меньшая чувствительность величины митотического индекса по сравнению с частотой хромосомных аберраций при биотестировании с А. сера почв Семипалатинского полигона с высокими удельными активностями техногенных радионуклидов. По-видимому, генетическая составляющая токсического воздействия (генотоксичность) оказывала наибольшее влияние на деление клетки в условиях контактного облучения с загрязненной радионуклидами почвой. При этом для загрязненных образцов выявляется тренд увеличения роли кластогенного эффекта в генотоксичности (см. табл. 4). Однако общего количества клеток с хромосомными аберрациями было недостаточно для обнаружения по точному тесту Фишера статистически значимых различий с контрольным уровнем (47%) долей кластогенного эффекта тестовых образцов (диапазон 51-68%).
Анализ массива цитогенетических данных оценки токсичности почв позволяет сделать некоторые выводы методического характера по статистической обработке и выбору инструментов анализа результатов биотеста. Для использования при оценке величины и вариабельности митотического индекса параметрических методов желательно обеспечить приблизительно равные объемы цитогенетических подвыборок в повторностях биотестов для одного почвенного образца. Средневзвешенная величина митотического индекса с учетом этого в значительно меньшей степени отличается от обычной средней, и при оценке достоверности отличий от контроля можно использовать критерий с большей мощностью. Если не стоит задача оценки величины варьирования митотического индекса и частоты аберраций хромосом по повторностям тестов внутри одного почвенного образца, то возможно использовать результаты статистической обработки по объединенной выборке цитогенетических данных. При этом эмпирически выявлено, что при значениях митотического индекса в 12-16% для соблюдения величины относительной вероятной погрешности е в диапазоне 8-12% достаточно выборки в 1500-1700 клеток. При снижении митотической активности до величины 11-6% для обеспечения е
в 13-17% достаточно опробовать 2000-2500 клеток. При ингибировании митотической активности до 5-2% точность е до 24-28% может обеспечить цито-генетическая повторность свыше 3000. Поскольку неизвестно значение индекса при планировании эксперимента с несколькими образцами почв, то лучше обеспечивать повторность около 2500 клеток для получения достаточной точности оценки величины митотического индекса.
По коэффициенту корреляции Пирсона (см. табл. 5) не выявлено значимой взаимосвязи между абсолютной величиной удельной активности 137Cs, митотическим индексом и показателем частоты аберраций хромосом. Мы относим это к очень широкому размаху величины удельной активности 137Cs, взятой в серию тестов, достигающей четырех порядков. По-видимому, «рабочий» диапазон реагирования цитогенетических показателей биотеста в линейном масштабе не охватывает такой размах абсолютных величин удельной активности 137Cs в почвах. Связь между ними не линейна, что и отражается данным коэффициентом, используемым как показатель степени прямолинейной связи случайных величин [Дмитриев, 2009]. Log-преобразование величины удельной активности 137Cs позволило выявить значимость линейной взаимосвязи цезиевого загрязнения почв с индексами токсичности. Взаимосвязь индицируется тестом значимо для митоти-ческого индекса и частоты аберраций хромосом с коэффициентами 0,91 и 0,77 соответственно.
Несколько более сложные корреляции с токсичностью тестируются для дозовых и потоковых характеристик ионизирующего излучения от почв. По-видимому, сильная взаимосвязь бета-потока и показателя мощности дозы у-излучения опосредована уровнем загрязнения почв 137Cs и наличием других бета-излучающих продуктов ядерного деления в почве. Для потоковых характеристик в-излучения почв не выявлены значимые взаимосвязи с величинами индексов токсичности. При этом современные исследования отмечают высокий биоиндикационный потенциал тест-системы с A. cepa для оценки цитогенетических повреждений от в-компоненты ионизирующих излучений [Xavier et al., 2023]. Вероятным объяснением полученных в настоящей работе данных могут служить особенности использованных нами радиационных характеристик в-излучения от почв. Радионуклиды аварийных выбросов представляют собой в основном ПЯД и характеризуются значительным вкладом в-компоненты в поток ионизирующего излучения [Крупные радиационные аварии., 2001]. Особенности энергетического спектра данного вида излучения обусловлены вероятностным характером распределения энергии в-распада радионуклидов. Используемая нами величина плотности потока в-частиц может не отражать энергетические характеристики излучения и потенциала влияния на био-
логическую мишень. Поэтому возможно, что для других показателей, учитывающих энергетические характеристики ^-компоненты ионизирующего излучения от почвы, будет более отчетливо проявлено их влияние на цитогенетические характеристики процесса митоза в облученных клетках. Преобразование случайных величин для выполнения требований к проведению статистического анализа в целом не меняло выявленных закономерностей связи между цитогенетическими показателями и характеристиками почв как источника радиационного воздействия. По величине коэффициентов корреляции фиксируется некоторое ослабление силы связи, однако с сохранением направленности и возможности оценки ее статистической значимости.
Заключение
Для территорий с высокой степенью техногенного радионуклидного загрязнения по цитоге-нетическим показателям показано ингибирующее влияние почв на процесс митотического деления клетки. По форме такая генетическая активность загрязненной почвы может быть охарактеризована как митотоксичность (митозмодифицирующая активность) и генотоксичность (нарушение генетического материала/генетических процессов) в зависимости от первичной «мишени» воздействия и механизмов развития токсического процесса в клетке. Выявлено, что ингибирование митотическо-го деления клеток, которое отражается в условиях твердофазного тестирования снижением митоти-ческого индекса, коррелирует с повреждением генетического материала, которое проявляется возрастанием частоты аберраций хромосом. Кластогенное воздействие на хромосомы в условиях биотеста статистически не значимо, но проявляется отчетливая тенденция его увеличения в реализации геноток-сичности. Преобладание такого типа повреждений хромосом (разрывы и ошибки репарации ДНК) характерно при воздействии ионизирующей радиации на генетический материал клетки. Поэтому с учетом роли кластогенного эффекта в генотоксичности и на основании значимых корреляций токсичности с уровнями радиоактивного загрязнения выявленные формы генетической активности почв можно связать с воздействием радиационного фактора и говорить о радиотоксичности исследуемых почв.
Информация о финансировании работы
Исследование проводилось в рамках НИОКТР № АААА-А21-121012290189-8, выполняемой по государственному заданию.
СОБЛЮДЕНИЕ
ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ
В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. М., 2004.
2. Гераськин С.А., Фесенко С.В., Волкова П.Ю. и др. Что мы узнали о биологических эффектах облучения в ходе 35-летнего анализа последствий аварии на Чернобыльской АЭС? // Радиационная биология. Радиоэкология. 2021. Т. 61, № 3. https://doi.org/10.31857/ 80869803121030061
3. Дмитриев Е.А. Математическая статистика в почвоведении: Учебник. М., 2009.
4. Дубинин Н.П. Радиационный и химический мутагенез. М., 2000.
5. Ильин Л.А., Кириллов В.Ф., Коренков И.П. Радиационная гигиена: Учебник для вузов. М., 2010.
6. Касацкий А.А. Биологический круговорот 137Cs и 40К в лесных фитоценозах южной тайги и лесостепи в отдаленный период после чернобыльских выпадений: Дис. ... канд. биол. наук. М., 2015.
7. Котельникова А.Д. Оценка токсичности дерново-подзолистой почвы при различных уровнях содержания лантаноидов методами биотестирования: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2019.
8. Крупные радиационные аварии: последствия и защитные меры / Р.М. Алексахин, Л.А. Булдаков, В.А. Губанов и др. // Под общей ред. Л.А. Ильина, В.А. Губанова. М., 2001.
9. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М., 1988.
10. Пяткова С.В., Гераськин С.А., Васильева А.Н. и др. Особенности использования АШиш-теста для оценки токсичности образцов воды и почвы с радиоактивно загрязненных территорий // Известия вузов. Ядерная энергетика. 2009. № 3.
11. Радиоэкологические последствия аварии на Чернобыльской АЭС: биологические эффекты, миграция, реабилитация загрязненных территорий / Под ред. Н.И. Санжаровой, С.В. Фесенко. М., 2018.
12. Столбова В.В., Мамихин С.В., Котельникова А.Д. и др. Детализация классификации аберраций хромосом с недифференцированным окрашиванием для учета кла-стогенного воздействия радионуклидных и комплексных загрязнений // Радиационная биология. Радиоэкология. 2019. Т. 59, № 5. https://doi.org/10.1134/S0869803119040118
13. Терехова В.А., Кулачкова С.А., Морачевская Е.В. и др. Методология биодиагностики почв и особенности некоторых методов биоиндикации и биотестирования (обзор) // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2023.
№ 2. https://doi.org/10.55959/MSU0137-0944-17-2023-78-2-35-45
14. Удалова А.А., Пяткова С.В., Гераськин С.А. и др. Оценка цито- и генотоксичности подземных вод, отобранных на промплощадке Дальневосточного центра по обращению с радиоактивными отходами // Радиационная биология. Радиоэкология. 2016. Т. 56, № 2. https://doi. org/10.7868/S0869803116020132
15. Щеглов А.И. Биогеохимия техногенных радионуклидов в лесных экосистемах: По материалам 10-летних исследований в зоне влияния аварии на ЧАЭС. М., 2000.
16. Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А. Радиобиология человека и животных. М., 2004.
17. Bolsunovsky A., Dementyev D., Trofimova E. et al. Chromosomal aberrations and micronuclei induced in onion (Allium cepa) by gamma-radiation // J. of Environmental Radioactivity. 2019. Vol. 207. https://doi.org/10.1016/j. jenvrad.2019.05.014
18. Brown L.D., Cai T. T., Dasgupta A. Interval estimation for a binomial proportion // Statistical Science. 2001. № 2. https://doi.org/10.1214/ss/1009213286
19. Geras'kin S.A., Kim J.K., Dikarev V.G. et al. Cytogenetic effects of combined radioactive (137Cs) and chemical (Cd, Pb, and 2,4-D herbicide) contamination on spring barley intercalar meristem cells // Mutation Research / Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2005. Vol. 586, № 2. https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2005.06.004
20. Gisselson D. Classification of chromosome segregation errors in cancer // Chromosoma. 2008. Vol. 117, № 6. https://doi.org/10.1007/s00412-008-0169-1
21. Pentreath R.J., Woodhead D.S. A system for protecting the environment from ionising radiation: selecting reference fauna and flora, and the possible dose models and environmental geometries that could be applied to them // The Science of the Total Environment. 2001. Vol. 277. https:// doi.org/10.1016/S0048-9697(01)00888-9
22. Saghirzadeh M., Gharaati M.R., Mohammadi Sh. et al. Evaluation of DNA damage in the root cells of Allium cepa seeds growing in soil of high background radiation areas of Ramsar - Iran // J. of Environmental Radioactivity. 2008. Vol. 99. https://doi.org/10.1016/j.jenvrad.2008.03.013
23. Stolbova V.V., Agapkina G.I., Kotelnikova A.D. et al. A short-term method for assessing the genotoxicity of soil as a solid-phase body based on the Allium test // Moscow University Soil Science Bulletin. 2018. Vol. 73, № 5. https:// doi.org/10.3103/S0147687418050071
24. Xavier M.N., Torres Novaes J.A., Cavalcante Silva A.C. et al. Cytogenetic effects of ^-particles in Allium cepa cells used as a biological indicator for radiation damages // J. of Environmental Radioactivity. 2023. Vol. 259-260. https:// doi.org/10.1016/j.jenvrad.2023.107109
Поступила в редакцию 19.03.2024 После доработки 24.04.2024 Принята к публикации 02.05.2024
ВЕСТНИК МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ 17. ПОЧВОВЕДЕНИЕ. 2024. Т. 79. № 3 LOMONOSOV SOIL SCIENCE JOURNAL. 2024. Vol. 79. No. 3
SIL SCIENCE AND ENVIRONMENTAL PROTECTION
FORMS OF SOIL TOXICITY IN AREAS WITH A HIGH DEGREE OF LONGTERM RADIONUCLIDE CONTAMINATION IDENTIFIED BY SOLID-PHASE BIOTEST WITH ALLIUM CEPA
V. V. Stolbova, A. I. Shcheglov, G. I. Agapkina, D. V. Manakov, O. B. Tsvetnova
The article presents the results of measuring the toxicity of soils with a specific activity of 137Cs in the range of 3,3-102-1,3-106 Bq-kg-1, the flux density of ^-particles and the dose rate of y radiation on the surface of a bulk sample of 5,4-192,7 imp-sec-1-cm-2 and 0,2-2,7 ^Sv-h-1, respectively. The forms of toxicity were detected in a solid-phase biotest with Allium cepa L., simulating the situation of external irradiation of dividing cells in contact with soil. The toxic effect was assessed relative to the control as mitotoxicity by reducing the mitotic index and as genotoxicity by inducing chromosomal aberrations, taking into account the contribution of the clastogenic effect. The value of the mitotic index in a series of biotests with contaminated soil decreased to values of 8,6±1,1-14,6±2,3% compared with the control proliferation level of 14,9±1,2%. At the same time, the frequency of chromosomal aberrations increased conjugately from 4,7±0,3 to 18,2±3,3%, with a control level of 3,9±0,5%, with an increase to 68% of the proportion of pathologies associated with clastogenic effects on chromosomes. A number of significant correlations between the values of toxicity indexes and indicators of radioactive contamination of soils have been revealed.
Keywords: radioactive contamination, external contact irradiation, cytogenetic analysis, mitotic index, frequency of chromosomal aberrations, clastogenic effect, beta-radiation.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Столбова Валерия Владимировна, канд. биол. наук, ст. преп. кафедры радиоэкологии и экотоксикологии факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, e-mail: [email protected]
Щеглов Алексей Иванович, докт. биол. наук, профессор, заведующий кафедрой радиоэкологии и экотоксикологии факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, e-mail: [email protected].
Агапкина Галина Ивановна, канд. хим. наук, ст. науч. сотр. кафедры радиоэкологии и экотоксикологии факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, e-mail: [email protected]
Манахов Дмитрий Валентинович, канд. биол. наук, ст. преп. кафедры радиоэкологии и экотоксикологии факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, e-mail: [email protected]
Цветнова Ольга Борисовна, канд. биол. наук, доцент кафедры радиоэкологии и экотоксикологии факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, e-mail: [email protected]
© Stolbova V.V., Shcheglov A.I., Agapkina G.I., Manakov D.V., Tsvetnova O.B., 2024
