CC BY
13
Ругаль В. И., Семенова Н. Ю., Бессмельцев С. С.
ФГБУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии ФМБА России», Санкт-Петербург
ФОРМИРОВАНИЕ СТРОМАЛЬНОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ И СТАНОВЛЕНИЕ ГЕМОПОЭЗА В ФЕТАЛЬНОЙ ГУБЧАТОЙ КОСТИ
Rugal V. I., Semenova N. Yu., Bessmeltsev S. S.
Russian research Institute of Hematology and Transfusiology of FMBA of Russia
FORMATION OF STROMAL MICROENVIRONMENT AND FORMATION OF HEMATOPOIESIS IN FETAL SPONGY BONE
Резюме. Эндостально-васкулярные структуры стромы костного мозга, формирующие гемопоэтические ниши, регулируют самоподдержание и развитие гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Онтогенез гемопоэ-за изучен в ряде экспериментальных исследований, при этом работы, характеризующие образования структур гемопоэтических ниш во взаимосвязи с развитием родоначальных кроветворных клеток в фетальной губчатой кости человека практически не встречаются. Наша работа посвящена морфологическому исследованию стромального микроокружения костного мозга и становлению гемопоэза в фетальной губчатой кости плодов человек на 9-27 неделях гестации
Представленные данные свидетельствуют о том, что развитие костной и кроветворной тканей в фетальном периоде проходит ряд последовательных этапов и к 27-й неделе ге-стации завершается формирование структур, образующих васкулярную и эндостальную ниши, которые способны регулировать жизнедеятельность родоначальных кроветворных клеток.
Ключевые слова: костный мозг, стро-мальное микроокружение, фетальная кость, гемопоэз.
Summary. The endosteal-vascular structures of the bone marrow stroma that form hematopoietic niches regulate the self-maintenance and development of hematopoietic stem cells (HSCs). The ontogenesis of hematopoiesis has been studied in a series of experimental studies, while the works characterizing the formation of hematopoietic niches structures in relation to the development of ancestral hematopoietic cells in the human fetal spongy bone practically do not occur. Our work is devoted to the morphological study of the stromal microenvironment of the bone marrow and the formation of hematopoie-sis in the fetal spongy bone of human fetuses at 9-27 gestational weeks.
The presented data indicate that the development of bone and hematopoietic tissues in the fetal period passes through a number of successive stages and by the 27th gestational week the formation of structures forming vascular and endosteal niches, which are able to regulate the activity of the ancestral hematopoietic cells, is completed.
Key words: bone marrow, stromal microenvironment, fetal bone, hematopoiesis.
Введение. Функциональные взаимосвязи между остеогенезом и формированием костного мозга как кроветворного органа были впервые представлены в 70-х годах прошлого столетия. Это прежде всего связано с положением о нише гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) сформулированной в 1978 году Р. Shofield [1], который отметил, что рост ГСК не поддерживается в селезенке таким же об-
разом, как в костном мозге. Он также предположил, что ГСК находятся в тесном контакте с костью, и что контакты между остеогенны-ми клетками и ГСК отвечают за неограниченную пролиферативную способность и инги-бицию созревания ГСК.
Концепция Р. Shofield получила дальнейшее развитие и в настоящее время признано, что анатомические области костно-мозго-
вых пространств губчатой кости формируют специфические ниши для создания условий развития ГСК и производства клеток крови [2-5]. Активно ведутся исследования по выявлению и характеристике структур ниши ГСК, на сегодняшний день выявляют несколько ниш ГСК, которые создают разные условия для самоподдержания и дифференцировки ГСК. При этом практические отсутствуют работы, характеризующие образования структур гемопоэтических ниш во взаимосвязи с развитием родоначальных кроветворных клеток в фетальной губчатой кости. Морфологические особенности стромального микроокружения костного мозга на разных сроках гестации важны для понимания роли стромальных компонентов ниши в становлении гемопоэза.
Цель. Изучить структуру стромального микроокружения костного мозга, включая образования, формирующие гемопоэтиче-ские ниши, и становление гемопоэза в фе-тальной губчатой кости плода человека.
Материалы и методы. Ретроспективный анализ фрагментов формирующейся костной ткани 35 плодов человека 9-27 недель геста-ции. Использованы гистологические и гистохимические методы.
Результаты. В гистологических препаратах подвздошной кости плодов 9-14 недель основную массу губчатого вещества составляли клетки эмбриональной мезенхимы. Часть из них дифференцировалась в хрящевую ткань, другая развивалась в остеогенном направлении, так как среди клеток мезенхимы выявлялись тяжи костной ткани, напоминающие трабекулы. Можно было проследить, что по мере увеличения срока гестации, в период 9-14 недель на месте мезенхимы первоначально появлялись элементы гиалинового хряща, а затем образовывались первичный костные балки, между которыми врастали синусоидальные сосуды.
Мезенхимная ткань была представлена слабо базофильным аморфным веществом, в котором располагались клетки двух типов. Одни имели цитоплазму веретенообразного или отростчатого типа и центрально расположенное крупное ядро с компактной структурой хроматина. В части клеток ядра были с нежнодиспергированным хроматином и хорошо заметными ядрышками. Клетки контактировали между собой цитоплазматическими отростками. Среди указанных клеточных эле-
ментов мезенхимы были диффузно распределены клетки небольших размеров с узким ободком цитоплазмы и небольшими выростами. Ядра небольших размеров с отчетливыми границами и небольшими выростами.
С увеличением сроков гестации среди ме-зенхимных клеток нарастал объем хрящевой ткани, которая в подвздошной кости была представлена участками гиалинового хряща. Первично, в местах образования хрящевой ткани мезенхимные клетки начинали группироваться более компактно, вследствие чего располагались значительно ближе друг к другу в сравнении с остальными отделами эмбрионального зачатка. В последующем вокруг них наблюдалось уплотнение межклеточной субстанции, которая начинала интенсивно окрашиваться гематоксилином и азуром. Уплотненная межклеточная субстанция окружала мелкие лакуны с расположенными в них клетками хрящевой ткани. Основную массу хондроцитов составляли клеточные элементы с несколькими сплюснутыми ядрами, содержащими мелкозернистый хроматин, конденсировавшийся по внутреннему краю ядерной мембраны. Как правило, были хорошо видны ядрышки.
В эти же сроки на месте мезенхимы и хряща происходило образование костной ткани. В местах формирования кости мензенхимные клетки теряли веретенообразную или треугольную форму. Их отростки значительно укорачивались, ядра округлялись, цитоплазма становилась резко базофильной. Указанные клетки окружали себя плотным межклеточным матриксом остеоидной ткани, образовывавшей многочисленные первичные костные трабекулы. Причем, на начальных этапах ячеистая структура, характерная для губчатой кости, имеющей костномозговые лакуны, не определялась. Костная ткань была представлена неправильной формы очагами остеоид-ного вещества среди мезенхимы и хрящевой ткани. В последующем участки остеогенной ткани удлинялись, формируя балочные структуры, которые начинали соединяться между собой. Среди костных трабекул располагались мезенхимные клетки, из которых начинали формироваться синусоидальные сосуды. Часть мезенхимных клеток, располагавшихся в непосредственной близости к костной матрице, трансформировались. Прежде всего, происходило увеличение плотности клеточных элементов мезенхимы в эндостальных
и субэндостальных зонах. Некоторые мезен-химные клетки их округлились, цитоплазма имела малочисленные короткие отростки. Другие мезенхимные клетки вытягивались и были ориентированы вдоль костных балок. В межбалочных пространствах увеличивался объем синусоидальных сосудов, их просветы содержали большое количество эритроцитов.
Эндотелиоциты синусоидов были представлены клетками с крупными ядрами овальной формы, в которых отчетливо выявлялись ядрышки. В некоторых случаях их структура напоминала вытянутые клеточные элементы эндоста. Межсинусоидальные пространства были заполнены слабо базо-фильной аморфной межклеточной субстанцией с отростчатыми мезенхимными клетками. Наряду с мезенхимными клеточными элементами, в межбалочных пространствах выявлялись мононуклеарные клетки типа лимфоцитов. Характерной особенностью эмбриональной кости этих сроков было появление среди стромальных клеточных элементов мезенхимы эндостальных и субэндостальных зон молодых гемопоэтических клеток, направление дифференцировки которых определить не представлялось возможным. Их морфологические характеристики свидетельствовали, что это клетки кроветворной направленности. Они располагались изолированно и образовывали скопления. Чаще это были клеточные элементы округлой формы с небольшим объемом цитоплазмы, которая окрашивалась в темно-синие тона. Базо-фильная цитоплазма и отсутствие отростков отличали их от стромальных образований костномозговых пространств. Ядра клеток с отчетливыми границами, крупные, имели нежную структуру хроматина. Ядрышки в таких клетках не обнаруживались. Они обнаруживались в различных участках костномозговых пространств, однако, было заметно увеличение их объема в эндостальных зонах плодов 13-14 недель. Исключение составляли периваскулярные участки, в которых также можно было видеть скопления молодых кроветворных предшественников. Зрелые гранулоциты и жировые клетки в указанный период эмбрионального развития в губчатой кости плодов человека не обнаруживались.
В образцах губчатой кости плодов 16-18 недель наблюдались процессы дальнейшей перестройки стромальных структур костного мозга, сопровождавшиеся активацией гемо-
поэза. Прежде всего, было заметно изменение соотношения различных элементов кроветворных образований стромы. Объем хрящевой ткани в эти сроки гестации снижался, и участки гиалинового хряща определялись только в центральных отделах костных трабекул. Изолированно хрящевая ткань среди мезенхимы не обнаруживалась. По периферии хрящевого зачатка формировалась костная ткань, которая, в свою очередь, изолировалась от ин-трамедуллярных пространств многослойными тяжами гетерогенных по структуре клеток. Непосредственно на костном матриксе многочисленных вновь образованных трабекул располагались сплошным слоем резко базофиль-ные клетки с крупными ядрами. В основном это были вытянутые клеточные элементы, цитоплазматические выросты которых контактировали между собой, образуя пласт, отделяющий костный матрикс от клеточных элементов субэндостальных участков.
Происходило дальнейшее формирование сосудистого русла. Объем синусоидальных сосудов возрастал, широкие просветы синусов истончались, Образующие их эндотели-оциты уплощались. Ядра эндотелиальных клеток вытягивались. Структура хроматина становилась глыбчатой, в большинстве из них исчезали ядрышки.
В пространствах между синусоидальными сосудами и костными балками наблюдались качественные и количественные перестройки системы соединительнотканных клеток и их волокон. Объем недифференцированных мезенхимных клеток уменьшался. Типичные звездчатые клетки мезенхимы встречались в небольшом количестве в эндостальных и субэндостальных участках. В центральных отделах костномозговых пространств число стромальных клеток уменьшалось. Среди просветлений межклеточной субстанции обнаруживалось небольшое число от-ростчатых клеток с плохо окрашивающейся цитоплазмой и крупными, с вдавлениями ядрами. Иногда можно было видеть тонкие цитоплазматические выросты. При импрегнации азотнокислым серебром определялись тонкие прерывистые ретикулиновые волокна. Структура указанных интрамедуллярных стромальных элементов не отличалась от ретикулярных клеток костного мозга взрослых. Количество ретикулярных клеток было увеличено в периваскулярных и эндостальных участках костномозговых пространств.
В этот период в образовавшихся костномозговых полостях начинали появляться очаги неиндентифицируемых бластных кроветворных клеток. Их количество в различных отделах варьировало. Наиболее часто они располагались по краям костных балок и возле кровеносных сосудов. При этом, в островках кроветворной ткани всегда обнаруживались стромальные элементы мезенхимы. Особенно отчетливо это было заметно по ходу костных трабекул в эндостальных и субэндо-стальных зонах. Причем, многие гемопоэти-ческие клетки, которые еще было невозможно отнести к определенному направлению дифференцировки, находились в тесных межклеточных взаимодействиях со стромой. Ци-топлазматические контакты наиболее часто выявлялись с молодыми активными элементами стромы. Мононуклеарные клетки типа лимфоцитов были диффузно распределены в зонах активного гемопоэза вблизи костной ткани. Жировые клетки, как и в препаратах предыдущих возрастных периодов эмбрионального развития, не выявлялись.
В образцах подвздошной кости плодов 2327 недель хрящевая ткань трабекул губчатого вещества значительно уменьшалась в объеме. Очаги гиалинового хряща можно видеть в виде небольших тяжей в центральных отделах трабекул губчатого вещества. Завершалось формирование костномозговых полостей, которые образовались посредством соединения костных балок. Минерализованный матрикс изолировался от интрамедул-лярных пространств эндостальными клеточными элементами. В этот период количество стромальных клеток эндостальных и субэн-достальных зон значительно снижалось, а указанные зоны были представлены кроветворной тканью. Непосредственно на костных балках располагались клеточные элементы эндоста с уплощенной цитоплазмой и вытянутыми темными ядрами. Здесь же встречались более крупные клетки с овальными ядрами, в которых были видны хорошо очерченные округлые ядрышки. Типичные мезенхимные элементы звездчатой формы, которые превалировали среди элементов стромы в начальные периоды гестации у плодов 23-27 недель, определялись в небольшом количестве в эндостальных и периваскуляр-ных участках. В полостях располагались сформированные синусоидальные сосуды, структура которых практически не отличалась от
строения синусоидальных стенок костного мозга здоровых лиц, но характеризовалась увеличенным количеством активированных эндотелиоцитов. Обращало на себя внимание наличие в синусоидальных сосудах, наряду с эритроцитами, большого числа лимфоцито-подобных мононуклеаров и элементов эри-троидного ряда. В межсинусоидальных пространствах располагались дендритические ретикулярные клетки, количество которых в костномозговых лакунах плодов было значительно выше, чем у взрослых. Довольно часто к ретикулярным клеткам прилежали лимфоидные элементы, эритробласты. Наивысшая гранулоцитарная активность была связана с эндостальными и периваскулярны-ми зонами. Причем, в этих участках обнаруживались молодые стромальные клеточные элементы, находящиеся в тесных контактах с развивающимися гранулоцитарными клетками. Кроме того, в субэндостальных участках клеточные образования стромальной и кроветворной ткани располагались довольно компактными полями, в которых на свето-оптическом уровне, в ряде случаев, не представлялось возможным дифференцировать стромальные клетки от лимфоцитоподобных гемопоэтических элементов.
По мере созревания гранулоциты перемещались из эндостальных зон в интрамедул-лярные пространства. При этом морфологический анализ костного мозга плодов 23-27 недель не выявил в межсинусоидальных пространствах типичных для нормального кроветворения взрослых жировых клеток, среди которых всегда располагались зрелые лейкоциты.
Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что становлению кроветворения в эмбриональной кости предшествуют структурные перестройки и характерная организация системы соединительнотканных клеток и межклеточного вещества, которые представляют собой элементы микроокружения, развившиеся из эмбриональной мезенхимы. При этом, лишь после формирования синусоидальной системы костной матрицы и изоляции последней от родоначальных кроветворных клеток становится возможным окончательное созревание гемопоэтических предшественников. Наличие всех клеточных типов стромально-го микроокружения — мезенхимных, хрящевых, остеогенных, ретикулярных, эндотели-
альных клеток не гарантирует становление кроветворения. Только после структурной организации, характерной для деятельного костного мозга, способны осуществляться процессы развития кроветворной ткани.
Очевидно, что на основании только морфологических исследований невозможно делать окончательные выводы о конкретной роли отдельных элементов стромы в регуляции гемопоэза. Однако, можно выделить и охарактеризовать стромальные элементы, которые способны формировать индуцирующее гемо-поэз микроокружение и обеспечить кроветворную функцию костного мозга. Так, результаты, полученные в ходе анализа развития эмбриональной кости в сочетании с данными проведенных исследований деятельного костного мозга здоровых лиц, свидетельствуют о том, что непосредственное участие в кроветворной функции могут принимать эндо-телиальные, ретикулярные и эндостальные клетки. Полученные результаты подтверждают предположение о едином источнике развития различных клеточных элементов стромы. В период эмбрионального развития — это мезенхимные клетки. По всей вероятности, часть из них сохраняется в «дремлющем» состоянии в костном мозге взрослых и находится среди популяции недифференцированных эндостальных и периваскулярных клеток.
Заключение. Представленные данные свидетельствуют о том, что развитие костной и кроветворной тканей в фетальном периоде проходит ряд последовательных этапов: мезенхимные эмбриональные клетки — хрящевая ткань — остеогенная ткань — начало формирования синусов — образование костномозговых лакун с изоляцией костного ма-трикса эндостальными клетками, завершением развития синусов и формированием интрамедуллярного стромального каркаса — становление гемопоэза с топографически закрепленной локализацией молодых и зрелых кроветворных клеток. К 27-й неделе геста-ции завершается формирование структур, образующих васкулярную и эндостальную ниши, которые способны регулировать жизнедеятельность родоначальных кроветворных клеток. Полученные результаты также подтверждают положение, что поддерживать гемопоэз способна только костная ткань, развивающаяся на месте хряща. С определенной долей вероятности можно предполагать, что во взрослом организме нарушения дифференциального потенциала мезенхимных стволовых клеток в направлении хрящевой ткани способны приводить к перестройке остеоге-неза и, как следствие, изменению функциональных свойств эндостальной ниши.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell // Blood Cells.— 1978.— № . 4.—Р. 7-25.
2. Purton L. E., Scadden D. T. The hematopoietic stem cell niche // StemBook, ed. The Stem Cell Research Community.— 2008.—V. 15.— P. 1-14.
3. Akintoye, S. O., T. Lam, S. Shi et al. Skeletal site -specific characterization of orofacial and iliac crest human bone marrow stromal cells in same individuals // Bone.— 2006.—Vol. 38(6).—P. 758-768.
4. Calvi L. M., Adams G. B., Weibrecht K. W., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche // Nature.— 2003.— № 425.—P. 841-846.
5. Nagasawa T., Omatsu Y., Sugiyama T. Control of hematopoietic stem cells by the bone marrow stromal niche: the role of reticular cells // Trends Immunol.— 2011. — № . 32(7).—Р. 315-20.
6. Cumano A., Godin I. Ontogeny of the hematopoietic system // Annu. Rev. Immunol.— 2007.— № 25.— P. 745-785.
7. Ding L., Morrison S. J. Haematopoietic stem cells and early lymphoid progenitors occupy distinct bone marrow niches // Nature. — 2013.— № 495.— P. 231-235.
