CC BY
1
УДК 543.31 DOI: 10.24412/2071-6176-2024-1-63-76
ФОРМИРОВАНИЕ РЕЦЕПТОРНОЙ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ МИКРООРГАНИЗМОВ АКТИВНОГО ИЛА ДЛЯ ОЦЕНКИ БПК
Т.В. Лаврова, А.С. Харькова, М.М. Герцен
Активный ил с очистных станций промышленного предприятия и медиатор ферроцен использованы для формирования биорецепторной системы для экспресс-определения БПК5 (биохимическое потребление кислорода). Аналитическую систему необходимо калибровать с помощью раствора на основе глюкозы и глутаминовой кислоты при потенциале 0,25 В относительно Ag/AgCl. Биосенсор показывает высокую стабильность работы с относительным стандартным отклонением аналитического сигнала 5,1 %, быстрое время отклика (5 минут), высокую долговременную стабильность (59 суток) и чувствительность (нижняя граница определяемых содержаний составила 1,3 мг/дм3). Значения БПКпроб природной воды, измеренные с помощью разработанного биорецептора, коррелируют с результатами стандартного метода (R = 0,9950, число образцов 12), что указывает на возможность использования биосенсора для быстрой диагностики индекса БПК5.
Ключевые слова: биосенсор, биохимическое потребление кислорода БПК5, активный ил, ферроцен.
Введение
Одной из важных задач аналитической химии является эффективная оценка содержания поллютантов в поверхностных, грунтовых и сточных водах. Важной характеристикой загрязнения воды легко окисляемыми органическими соединениями является показатель биохимического потребление кислорода (БПК). Однако за время проведения стандартного анализа БПК (5 суток) возможны необратимые изменения в природных водных объектах, например гибель водного биоценоза [1]. Автоматизация стандартного метода анализа не избавляет от длительной инкубации пробы.Сократить время анализа до нескольких минут можно с помощью биосенсорного анализа. так как биосенсорные анализаторы позволяютрегистрировать скорость окисления органических соединений биоматериалом [2].
Правильность анализа БПК5 по стандартным методикам определяется с помощью стандартных растворов, например, ГСО 8048-94 содержитглюкозу и глутаминовую кислоту, заявленный индекс БПК5 составляет 90±5 мг/дм3. ГСО применяется для калибровки экспресс-систем оценки БПК5 [3], в том числе, амперометрических медиаторных биосенсоров. Микроорганизмы в составе рецепторных систем окисляют органические компоненты стандартного раствора, и затем восстанавливаютмедиаторы электронного транспорта, которые находятся в составе рецепторного элемента или вводятся вместе с пробой.
Восстановленная форма медиатора окисляется на поверхности электрода при приложенном потенциале. Поток электронов от субстрата через фермент и медиатор поступает на электрод, что приводит к увеличению силы тока в системе по сравнению с начальным значением, зарегистрированным до введения пробы в измерительнуюячейку. Изменение силы тока является аналитическим сигналом в медиаторных амперометрических биосенсорах и зависит от концентрации легко окисляемыхорганических компонентов в пробе. Используя стандартные растворы с разной концентрацией органических веществ, моделируется различное значение БПК5 в ячейке, а регистрируемое изменение силы тока в результате окисления введённых органических веществ становится функцией БПК5. Таким образом, устанавливается количественная связь аналитического сигнала медиаторных биосенсоров от БПК5 исследуемыхпроб.
Медиаторные биосенсоры являются перспективными инструментами для оценки состояния водной среды, поскольку их сигнал не зависит от концентрации растворенного кислорода, что позволяет анализировать пробу в анаэробных условиях, например, при контроле качества анаэробной очистки сточных вод. Применение медиаторных биосенсоров для оценки БПК5 обеспечивает низкие время анализа (5 минут), хорошую чувствительность метода (амперометрический детектор позволяет проводить регистрацию окислительной активности биологического материала в наноамперном диапазоне токов, что позволяет различать пробы с близким значением БПК5) и возможность значительной миниатюризации микробных биосенсорных систем по аналогии с современными глюкометрами [4].
В качестве биоматериала БПК-биосенсораприменяют отдельные штаммы [1-3, 5], микробные сообщества [6-11],бактерии активного ила очистных станций [6, 8-12]. Биосенсорна основе активного ила и медиатора метиленового синего [12] в оптимальных условиях характеризовался высокой долговременной стабильностью - 65 дней и широким линейным диапазоном от 1,0 до 100 мгО2/дм3, при этом время единичного анализа не превышало 10 минут.
В нашем предыдущем исследовании обсуждалась возможность использования активного ила с очистных станций ОАО «ТулаГорВодо-канал» в составе рецепторных элементов БПК-биосенсора [6]. Устройства характеризовались высокой долговременной стабильностью (от 36 до 40 суток), чувствительностью (нижняя граница определяемых значений БПК5 - 0,01 мгО2/дм3) и небольшим временем эксперимента (15 минут). Основной проблемой, ограничивающей использование активного ила в составе биорецепторных элементов, является сложность стандартизации биорецепторных элементов на основе активного ила, взятого с разных очистных станций.
Целью работы является сопоставление аналитических возможностей рецепторных элементов на основе графито-пастового электрода, модифицированного медиатором ферроценом и активного ила очистных станций промышленных предприятий, и аналога, отличающегося тем, что активный ил отобран с городских очистных станций.
Материалы и методы исследования
Культивирование микроорганизмов.Микроорганизмы выращены на среде состоящей из 200 см3 дистиллированной воды, в которой содержалисьШО («Диаэм», Россия), триптон («Condra», Испания) (содержание компонентов 10 г/дм3) и дрожжевой экстракт («Helicon», Россия) (5 г/дм3). Полученную среду стерилизовали в автоклаве 45 минут, p=1,1 атм. Бактерии выращивали с доступом воздуха в течении суток, Т=29 °С. Клетки промывали фосфатным буферным раствором (33 мМ KH2PO4 + 33 мМ N2HPO4 («Диаэм», Россия)) с рН 7,2, на центрифуге-встряхивателе Vortex CM-70M-07 («ELMI», Латвия) и затем центрифугировали при 10000 об/мин 10 минут.
Формирование рабочего электрода. Графитовой пастой, для приготовления которой использовали пудру («Fluka», Германия) и парафиновое масло («Fluka», Германия), наполняли пластиковую трубку. Для модификации графитовой пасты 10 мг ферроцена («Sigma- Aldrich», Германия) растворяли в 0,5 мл ацетона (Диаэм», Россия) и добавляли к 90 мг графитовой пудры. Площадь рабочей поверхности составила 6,3 мм2.
При формировании биоэлектродов на поверхность наносили 10 мкл суспензии микроорганизмов с титром 330 мг/мл. Для закрепления микроорганизмов на поверхности электрода использовали диализную мембрану («Roth», Германия), зафиксированную при помощи пластикового кольца.
Электрохимические измерения окислительной способности биоматериала. Рабочий электрод и хлоридсеребряный электрод помещали в ячейку, которую заполняли калий-натрий фосфатнымбуферным раствором (pH=6,8). Электроды подключали к гальванопотенциостату «IPC-micro» (ООО НТФ Вольта, Санкт-Петербург). Аналитический сигнал регистрировали как изменение силы тока (мкА) при введении стандартного раствора в ячейку.
Циклическая вольтамперометрия. Анализатор «Экотест-ВА» (ООО «Эконикс-Эксперт», Россия) применяли для исследования электрохимических процессов системы. Вольтамперограммы получали при комнатной температуре в трехэлектродной ячейке и объеме буферного раствора (pH=6,8) 30 мл.
Регистрация изображений суспензии активного ила. Для
проведения оптической микроскопии с фазовым контрастом использовали микроскоп NikonEclipseCi («Nikon», Япония).
Анализ БПК5 природных вод. Пробы речной воды инкубировали в течении 5 суток в специальных колбах в соответствии с ПНД Ф [13]. Концентрацию растворенного кислорода измеряли в первый и пятый день инкубации с помощью анализатора ЭКСПЕРТ-001 («Эконикс-эксперт», Россия). Разница полученных значений - БПК5 проб.
Определение БПКбыстр, который коррелирует с БПК5, проводили с помощью биосенсора на основе активного ила проводили следующим образом: в день анализа проводили калибровку электрода с помощью стандартных растворов с разным значением БПК5. Затем измеряли изменение силы тока при введении в ячейку анализируемых проб и по построенному градуировочному графику находили БПК5.
Обсуждение результатов
Электрохимическая характеристика биоэлектродов на основе активного ила. Активный ил получен с очистных сооружений промышленных предприятий. Используемый активный ил представляет популяцию различных микроорганизмов. Сопряжение микроорганизмов активного ила с графито-пастовым электродом проводили с помощью медиатора ферроцена. Выбор ферроцена обусловлен тем, что он быстро обратимо окисляется и восстанавливается (Е0 = 250 мВ), и устойчив и в окисленной и в восстановленнойформе [17].
100 200 300 400 500 600 700 800 900
Потенциал, мВ
Рис. 1. Изменение анодных токов графито-пастового электрода на основе активного ила и ферроцена до (1) и после (2) добавления в ячейку
глюкозы (С=12,5 мМ)
Эффективность переноса электронов в системе «активный ил -медиатор ферроцен - графито-пастовый электрод» исследовали при помощи метода циклической вольтамперометрии. На рис. 1 представлены анодные токи до и после введения глюкозы при скорости развертки 10 мВ/с.
Возникновение экстремума обусловлено окислением ферроцена на электроде (уравнение 1)
^^5)2]°- е ^ ^^5)2]+ (1)
Увеличение анодного тока после введения глюкозы происходит из-за регенерации ферроцена медиатора через каталитический цикл (схема 2-3).
Глюкоза + Еок ^ продукт + Ев (2)
Ре(С5Ш)2]+ + Ев ^ Еок + ^е(С5Ш)2]°, (3)
где Еок и Ев - ферменты микроорганизмов активного ила в окисленной и восстановленной форме.
Подобная ситуация наблюдалась в исследованиях [18-22]. Эффективность взаимодействия биокатализатора с медиатором (уравнение 3) оценивали, расчитывая константу скорости взаимодействия ферроцена с микроорганизмами помодели Николсона-Шайна [23], для этого фиксировали предельный анодный ток в присутствии и отсутствие субстрата при разных скоростях развертки. Отношения предельных анодных токовв присутствии и в отсутствии субстрата обратно пропорциональны квадратному корнюскорости развертки потенциала. По тангенсу угла наклона рассчитана константа скорости взаимодействия микроорганизмов активного ила и ферроцена. Она составила 0,21±0,02 дм3/(гс). По сравнению с другими микроорганизмами активный ил отличается наибольшей константой взаимодействия с ферроценом [6, 17] что предопределяет его применение для создания высокочувствительного БПК-биосенсора.
Влияние неблагоприятных факторов окружающей среды на рецепторную систему. Производственные стоки могут включать компоненты, изменяющие кислотность среды, а следовательно, снижать окислительную способность рецепторного элемента. Зависимость ответа биосенсора на добавление раствора, содержащего глюкозу и глутаминовую кислоту, от рН буферного раствора представлена на рис. 3А.
Рис. 3. Зависимость ответа биосенсора на основе суспензии микроорганизмов от рН среды (А) и изменение аналитического сигнала в присутствии ионов тяжелых металлов, взятых в концентрациях 10ПДК и 100ПДК (Б). Ответ биосенсора рассчитан как среднее значение пяти последовательных измерений, доверительный интервал вычислен при доверительной вероятности 95 %
Ответ биосенсора при рН от 6,6 до 7,4 практически не изменяется. Следовательно, в данном диапазоне микроорганизмы активного илапроявляют наибольшую окислительную активность, следует отметить, что биосенсоры на основе активного ила, взятого с разных очистных станций, генерируют максимальный аналитический сигнал в данном диапазоне (табл. 1).
Наличие ионов тяжелых металлов может изменять окислительную активность микроорганизмов рецепторных элементов биосенсора [24, 25], а следовательно, и искажать результаты определения БПК5 проб. Изменение аналитического сигнала в присутствии ионов СГ2О72-, Cd2+, Fe3+, Pb2+ и Zn2+, взятых в концентрациях соответствующим 10 ПДК и 100 ПДК [26]. Изменение окислительной активности микроорганизмов активного ила на добавление раствора, содержащего глюкозу и глутаминовую кислоту, в присутствии солей, включающих исследуемые ионы, представлена на рис. 3Б. При концентрации 100 ПДК ответы биосенсора уменьшаются не более чем на 20 %, активный ил в составе рецепторного элемента способен функционировать в присутствии ионов тяжелых металлов, в концентрациях, превышающих ПДК.
Метрологические и аналитические характеристики БПК-биосенсора. Типичными представителями бактериального состава активного ила являются бактерии рода Escherichia и Pseudomonas [13-15], однако характер сточных вод (бытовые или промышленные) может изменить субстратную специфичность микроорганизмов активного ила [16], взятого с разных очистных станций, поэтому проведена оценка субстратной специфичности микроорганизмов активного ила очистных станций промышленного предприятия производства метанола и микроорганизмов активного ила городских очистных установок, используемого ранее [6] (рис. 4).
Рис. 4. Субстратная специфичностьмикроорганизмов активного ила с промышленного предприятия и городских очистных сооружений [6]
Микроорганизмы активного ила городских очистных станций [6] окисляют более широкий спектр соединений, чем микроорганизмы активного ила промышленного предприятия. Оба консорциума более эффективно окисляют углеводы, чем другие классы органических соединений. Возможность окисления разветвленных спиртов микроорганизмами активного ила промышленного предприятия в отличие микроорганизмов активного ила городских очистных обусловлена характером сточных вод при производстве метанола.
Для определения индекса БПК5 природных или сточных вод получена гиперболическая зависимость ответа биосенсора от БПК5 (рис. 5), которая имеет типичный для ферментативных реакций вид, поэтому экспериментальные данные аппроксимированыпо уравнениюМихаэлиса-Ментен [27]. Различную величину индекса БПК5 в измерительной кювете моделировали с помощью раствора, содержащего глюкозу и глутаминовую кислоту [13].
Рис. 5. Градуировочная зависимость ответа сенсора от БПК5 (А) и долговременная стабильность биосенсора на основе активного ила очистных промышленных предприятий (Б)
Коэффициент смешанной корреляции 0,9932 указывает на высокую степень соответствия экспериментальных данных с предложенным для их обработки математическим уравнением гиперболы с двумя параметрами. Коэффициент смешанной корреляции градуировочной зависимости ответа биосенсора на основе активного ила очистных установок «ТулаГорВодо-канала» от БПК5 ниже полученного в этой работе и составлял 0,9882 [6]. Значение параметров гиперболической регрессии (рис. 5): максимальная скорость ферментативной реакции окисления глюкозо-глутаматной смеси микроорганизмами активного ила в присутствии медиатора ферроцена равна 2,0±0,4 мкА и кажущаяся константа Михаэлиса - значение БПК5, при котором максимальная скорость равна половине максимального значения составила 26±8 мг02/дм3. При сопоставлении полученных параметров с результатами аппроксимации зависимостей ответа биосенсора на основе активного ила городских очистных сооружений [6] установлено, что максимальная скорость ферментативной реакции различается в 2 раза: 2,0±0,4 мкА (данная работа) и 3,5±0,6 мкА [6], а константы Михаэлиса в 1000 раз 26±8 мг02/дм3 (данная работа) и 0,09±0,05 мг02/дм3 [6]. Полученные результаты указывают на необходимость предварительной калибровки рецепторного элемента перед оценкой биохимического потребления кислорода.
Долговременная стабильность определяет срок эксплуатации рецепторного элемента биосенсора. Долговременную стабильность оценивали по зависимости ответа биосенсора измеренного при введении раствора глюкозо-глутаматной смеси, БПК5 которого составляет 5,3 мг02/дм3 (рис. 5Б), от времени эксплуатации рецепторного элемента (сут.). При эксплуатации рецепторного элемента более 59 суток, происходит снижение аналитического сигнала более 50 % относительно максимального ответа биосенсора. Операционную стабильность оценивали
по результатам относительного стандартного отклонения ответа биосенсора при 15 последовательных измерений на добавление раствора, содержащего глюкозу и глутаминовую кислоту (БПК5 = 5,3 мг02/дм3). В таблице представлены характеристики разработанного биосенсора и аналогов на основе активного ила.
Характеристики медиаторных биосенсоров
Биоматериал/ Медиатор [ссылка] рН Долговременная стабильность, сутки Относительное стандартное отклонение, % (п=15, Р=0,95) Линейный диапазон БПК5, мг/дм3 Время анализа, мин
Активный ил промышленного предприятия / ферроцен 7,0 59 5,1 1,3-28 5
Активный ил очистных сооружений «ТулаГорВодока-нала» / ферроцен [6] 7,0 49 4,7 0,01-0,06 8
Активный ил / метиленовый синий / графен [12] 6,5 65 2,9 1-100 9
Бактерии из активного ила / ковалентно связанный ферроцен / УНТ [1] 6,8 50 5,0 0,1-4,5 5
Следует отметить, что оптимальный рН для эксплуатации биорецепторных элементов составляет 6,5-7,0. Долговременная стабильность биосенсора на основе активного ила более 50 дней. Относительное стандартное отклонение аналитического сигнала при 15 последовательных измерений при уровне доверительной вероятности Р=95 %, генерируемого биосенсорами на основе активного ила не превышает 6 %. Определение БПК5 с помощью медиаторных биосенсоров на основе активного ила обеспечивает экспресс-анализ - время для проведения единичного анализа не превышает 10 минут. А нижние границы определяемых концентраций БПК5 потенциально позволяет проводить анализ природных вод с довольно низким индексом БПК5 ~1 мг/дм3, предельно-допустимые концентрации БПК5 для поверхностных вод составляет 2 мгО2/дм3. Таким образом,
стабильные рецепторные элементы можно получать на основе активного ила различных очистных станций для проведения экспресс-анализа БПК5.
Апробация разработанного биосенсора. Для оценки возможности применения разрабатываемой системы как БПК-биосенсора проводили анализ 12 образцов поверхностных вод, отобранных на территории Тульской области. На рисунке 6 показана корреляция результатов анализа стандартным и биосенсорным методами.
Измерение БПК,разрл6отаннь[м биосенсором, мг/дм3
Рис. 6. Линейная зависимость результатов анализа БПК5 проб, полученных стандартным методом, от БПК5, измеренных с помощью
биосенсора
Статистическая обработка проводилась с использованием модифицированного теста Стьюдента. Полученные данные указывают на то, что выборки отличаются незначительно, следовательно, является возможным применение разработанного биосенсора для анализа БПК5.
Заключение
Сформирован БПК-биосенсор на основе активного ила промышленных станций очистки сточных вод и медиатора ферроцена. Экспресс-анализаторы на основе активного ила обладают высокой чувствительностью (нижняя граница составила 1,3 мгО2/дм3), могут использоваться в течение длительного времени (более 50 суток) и занимают меньше времени на единичный анализ (менее 15 минут) по сравнению со стандартной методикой, в соответствии с которой требуется 5-суточная инкубация пробы. Результаты биосенсорного и стандартного метода, полученные при анализе образцов, отличаются незначимо. Рецепторный элемент сформированный в данной работе и аналоги на основе медиаторов электронного транспорта и активного ила различных
очистных станций позволяют проводить анализ проб, значение БПК5 которых находится в пределах ПДК. Биорецепторы на основе активного ила, вне зависимости от характера очистных станций, на которых он был отобран (табл. 1), показывают максимальную оксилительную активность в диапазоне 6,5-7,0 рН, высокую долговременную стабильность (49-65 суток), а нижняя граница определяемых значений БПК5 позволяет проводить анализ проб, значение БПК5 которых находится в пределах ПДК. Полученные результаты могут стать основой формирования рецепторных микробных медиаторных биосенсоров экспресс-анализа БПК5 непосредственно на очистных сооружениях.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-73-01220, https://rscf.ru/project/23-73-01220/
Список литературы
1. Use of biocompatible redox-active polymers based on carbon nanotubes and modified organic matrices for development of a highly sensitive BOD biosensor/ V.A. Arlyapov, A.S. Kharkova, S.K. Kurbanaliyeva [et al.] // Enzyme and microbial technology. 2021. V. 143. № 109706. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2020.109706.
2. A redox mediated UME biosensor using immobilized Chromobacteriumviolaceum strain R1 for rapid biochemical oxygen demand measurement / K.B. Hooi, A.K. Ismail, R. Ahamad [et al.] // Electrochim. Acta. 2015. V.176. P.777-783. DOI: 10.1016/j.electacta.2015.07.089.
3. Rational design of signal amplifying fluorescent conjugated polymers for environmental monitoring applications: Recent advances and perspectives/ S. Hussain, C. Zhu, Z. Yue [et al.] // Coordination Chemistry Reviews. 2024. V. 499. P. 215480. DOI: 10.1016/j.ccr.2023.215480.
4. A review of biosensor for environmental monitoring: principle, application, and corresponding achievement of sustainable development goals / C. W. Huang, C. Lin, M. K. Nguyen [et al] // Bioengineered. 2023. V. 14. № 1. P. 58-80. DOI: 10.1080/21655979.2022.2095089.
5. A kinetic approach to the formation of two-mediator systems for developing microbial biosensors as exemplified by a rapid biochemical oxygen demand assay // A. S. Kharkova, V.A.Arlyapov, A.S.Ilyukhina [et al.] // 3 Biotech. 2021.V. 11. N 5. P. 1-13.DOI: 10.1007/s13205-021-02709-8.
6. Зайцева А.С., Арляпов В.А., Решетилов А.Н. Медиаторный биосенсор на основе микроорганизмов активного ила для экспресс-определения низких значений БПК5 // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю. А. Овчинникова. 2017. Т. 13. № 1. С. 50-57.
7. Hu J., Gao G., Xia S. Development of a mediator-type bioelectrochemical sensor based on polypyrrole immobilized ferricyanide and
microorganisms for biochemical oxygen demand fast detection // Int. J. Electrochem. Sci. 2015. V. 10. № 11. Р. 9695-9705. DOI: 10.1016/S1452-3981(23)11212-0.
8. Biochemical oxygen demand measurement by mediator method in flow system/ L. Liu, L. Bai, D. Yu, J. Zhai [et al.] // Talanta. 2015. V. 138. P. 36-39. DOI: 10.1016/j.talanta.2015.02.001.
9. A ferricyanide-mediated activated sludge bioassay for fast determination of the biochemical oxygen demand of wastewaters / M. A. Jordan, D. T. Welsh, P. R. Teasdale [et al.] // Water Res. 2010. V. 44. № 20. P. 59815988. DOI: 10.1016/j.watres.2010.07.042.
10. A sensitive ferricyanide-mediated biochemical oxygen demand assay for analysis of wastewater treatment plant influents and treated effluents / M. A. Jordan, D. T. Welsh, R. John [et al.] // Water Res. 2013. V. 47. № 2. Р. 841849. DOI10.1016/j.watres.2012.11.010.
11. Jordan M.A., Welsh D.T., Teasdale P.R. Ubiquity of activated sludge ferricyanide-mediated BOD methods: A comparison of sludge seeds a cross wastewater treatment plants// Talanta. 2014. V. 125. P. 293-300. DOI: 10.1016/j.talanta.2014.03.004.
12. A novel BOD biosensor based on entrapped activated sludge in aporous chitosan-albumin cryogel incorporated with graphene andmethylene blue / S. Niyomdecha, W. Limbut, A. Numnuam [et al.] // Sensors and Actuators B: Chemical. 2017.V. 241. P. 473-481.DOI: 10.1016/j.snb.2016.10.102.
13. ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. М.: 1997. С. 25.
14. Selection of electrogenic bacteria for microbial fuel cell in removing Victoria blue R from wastewater / C.Y. Chen, T.H. Tsai, P.S. Wu [et al.] // Journal of Environmental Science and Health, Part A. 2018. V. 53. №2. P. 108115. DOI: 10.1080/10934529.2017.1377580.
15. Direct detection of phenol using a new bacterial strain-based conductometric biosensor / N. Kolahchi, M. Braiek, G. Ebrahimipour [et al.] // Journal of environmental chemical engineering. 2018. V. 6. № 1. P. 478-484. DOI: 10.1016/j.jece.2017.12.023.
16. Activated sludge microbial community and treatment performance of wastewater treatment plants in industrial and municipal zones / Y. Yang, L. Wang, F. Xiang [et al.] // International Journal of Environmental Research and Public Health. 2020.V. 17. № 2. P. 436. DOI: 10.3390/ijerph17020436.
17. Mediator BOD biosensor based on cells of microorganisms isolated from activated sludge / A.S. Kharkova, V.A. Arlyapov, A.D. Turovskaya [et al.] // Applied Biochemistry and Microbiology. 2019. V. 55. № 2. P. 189-197. DOI: 10.1134/S0003683819010083.
18. Bioelectrocatalytic oxidation of glucose by immobilized bacteria gluconobacteroxydons / E. Babkina, E. Chigrinova, O. Ponamoreva [et al.] // Evaluation of water-insoluble mediator efficiency // Electroanalysis. 2006. V. 18. № 19-20. P. 2023-2029. DOI: 10.1002/elan.200603608.
19. Song Y., Wang J., Yau S.T. Controlled glucose consumption in yeast using a transistor-like device // Scientific reports. 2014. V. 4. № 1. P. 5429. DOI: 10.1038/srep05429.
20. Song Y., Nayfeh M. H., Yau S. T. Electrostatically enhanced performance of a yeast-based microbial fuel cell // RSC advances. 2015. V. 5. V. 25. P. 19203-19205. DOI: 10.1039/C4RA01545B.
21. Disposable Prussian blue-anchored electrochemical sensor for enzymatic and non-enzymatic multi-analyte detection / R.V. Blasques, J.S. Stefano, J.R. Camargo [et al.] // Sensors and Actuators Reports. 2022. V. 4. P. 100118. DOI: 10.1016/j.snr.2022.100118.
22. Effects of methylene blue and methyl red mediators on performance of yeast based microbial fuel cells adopting polyethylenimine coated carbon felt as anode / M. Christwardana, D. Frattini, G. Accardo [et al.] // Journal of Power Sources. 2018. V. 396. P. 1-11. DOI: 10.1016/j.jpowsour.2018.06.005.
23. Nicholson R. S., Shain I. Theory of stationary electrode polarography. Single scan and cyclic methods applied to reversible, irreversible, and kinetic systems // Analytical Chemistry. 1964. V. 36. № 4. P. 706-723. DOI: 10.1021/ac60210a007.
24. Liu L., Zhai J., Zhu C. One-pot synthesis of 3-dimensional reduced graphene oxide-based hydrogel as support for microbe immobilization and BOD biosensor preparation // Biosensors and Bioelectronics. 2015. V. 63. P. 483-489. DOI: 10.1016/j.bios.2014.07.074.
25. Козлова Т.Н., Косаренина М.М., Юдина Н.Ю. Влияние негативных факторов среды на окислительную активность лиофилизированных бактерий Paracoccus yeei в составе БПК-биосенсора // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2023. № 4. С. 67-75.
26. СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод». 2001.
27. Emelyanova E. Microbial Biosensor for Characterization of a Microorganism: A Review fo-cusing on the Biochemical Activity of Microbial Cells // Micromachines. 2023.V. 14. № 4. P. 733.
Лаврова Татьяна Валерьевна, магистрант, lavrova0000@yandex.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Харькова Анна Сергеевна, канд. хим. наук, доцент, anyuta zaytseva@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Герцен Мария Михайловна, мл. науч. сотр. лаборатории химии и экологии почв, mani.gertsen@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого
FORMATION OF A RECEPTOR SYSTEM BASED ON ACTIVE SLUDGE MICROORGANISMS FOR BOD ASSESSMENT
T.V. Lavrova, A.S. Kharkova, M.M. Gertsen
Activate sludge from industrial wastewater treatment plants and the mediator ferrocene were used to form a bioreceptor system for the rapid determination of BOD5. The analytical system must be calibrated using a glucose-glutamic acid solution at a potential of 0.25 V versus Ag/AgCl. The biosensor shows high operational stability with a relative standard deviation of 5,1 %, fast response time (5 minutes), high long-term stability (59 days) and sensitivity (the lower limit of the determined content was 1.31 mg O2/dm3). The BOD5 values measured using the developed bioreceptor correlate with the results of the standard method when analyzing natural water samples (R2 = 0.9901, number of samples 12), which indicates the possibility of using the biosensor for rapid diagnosis of the BOD5 index.
Key words: biosensor, biochemical oxygen demand, BOD5, activated sludge.
Lavrova Tatyana Valerievna, master's student, lavrova0000@yandex.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Kharkova Anna Sergeevna, Candidate of Chemical Sciences, Associate Professor, anyuta_zaytseva@mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Gertsen Maria Mikhailovna, junior researcher at the Laboratory of Soil Chemistry and Ecology, mani.gertsen@gmail. com, Russia, Tula, Tula State Pedagogical University. L.N. Tolstoy
