CC BY
25
Петрова Е.С. ©
Старший научный сотрудник Отдела общей и частной морфологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург
ФОРМИРОВАНИЕ NOS-СОДЕРЖАЩИХ НЕЙРОНОВ В ЭКТОПИЧЕСКИХ НЕЙРОТРАНСПЛАНТАТАХ ЭМБРИОНАЛЬНОГО НЕОКОРТЕКСА
Аннотация
Целью исследования явилось изучение нитроксидергических нейронов неокортекса, развивающихся в условиях пересадки в поврежденный седалищный нерв крысы. Фрагменты дорсолатеральной стенки переднего мозгового пузыря эмбрионов крыс 15 сут развития, содержащей закладку неокортекса, пересаживали субпериневрально в поврежденный нерв взрослых животных. С помощью применения иммуногистохимического ферментного маркера было установлено, что через 28 сут после пересадки в трансплантатах формируются отдельные NOS-содержащие нейроны, которые не достигают степени дифференцировки нитроксидергических нейронов неокортекса крыс соответствующего срока развития.
Ключевые слова: иммуногистохимия, нейротрансплантация, нерв, NOS.
Keywords: immunohistochemistry, neurotransplantation, nerve, NOS.
Аллотрансплантация эмбриональных закладок ЦНС в периферический нерв взрослых крыс является удобной моделью для изучения гистогенеза эмбриональных закладок мозга [9]. В последние годы исследование гистогенетических процессов в развивающихся органах ЦНС и ПНС осуществляется с помощью иммуногистохимического выявления специфических клеточных антигенов. Так, для идентификации нервных клеток на разных стадиях дифференцировки широко применяется иммуногистохимическое выявление таких специфических маркеров нейрональной дифференцировки, как даблкортин, бета-Ш-тубулин, синаптофизин, ядерный антиген нервных клеток NeuN и др. [1-4; 7; 12]. Применение этих маркеров позволяет исследовать дифференцировку нейральных клеток-предшественников, развивающихся в условиях нейротрансплантации. Показано, что трансплантация в поврежденный нерв или кондуит, соединяющий сегменты перерезанного нерва, стволовых клеток или эмбриональных закладок ЦНС, может способствовать регенерации нерва реципиента [5, 14-16]. Вопрос о медиаторной принадлежности
пересаженных клеток изучен недостаточно. Исследования в этом направлении, на наш взгляд, будут способствовать выяснению молекулярных механизмов влияния клеток нейротрансплантатов на регенерацию нерва реципиента.
Цель настоящей работы - изучение нитроксидергических нейронов, развивающихся в тканевых аллотрансплантатах эмбрионального неокортекса крысы в нерве.
В работе было использовано 10 самцов и 4 беременные самки крыс Вистар. При содержании и умерщвлении животных руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». У эмбрионов крыс 15 сут развития выделяли фрагменты дорсолатеральной стенки переднего мозгового пузыря, содержащие закладку неокортекса, и трансплантировали под периневрий предварительно передавленного зажимом седалищного нерва взрослых крыс [13]. Через 28 сут после операции сегменты седалищных нервов с трансплантатами фиксировали в растворе цинк-этанол-формальдегида [2]. Иммуногистохимические реакции проводили на парафиновых срезах толщиной 5 мкм. Для выявления нейронов применяли антитела к NeuN и NOS
(Таблица 1).
© Петрова Е.С., 2015 г.
Иммуногистохимические маркеры, использованные в работе
Таблица 1
Наименование маркера Первичные антитела Разведение первичных антител Характеристика маркера Ссылка на источник
Ядерный антиген нервных клеток NeuN Моноклональные мышиные антитела, клон А60; Chamicon,США 1:400 Маркер зрелых нейронов [2, 4]
NO-синтаза ( NOS) Поликлональные кроличьи антитела, Spring Bioscience, США 1:1000 Фермент синтеза NO, содержится в нитроксидергическ их нейронах [3]
В качестве вторичных реагентов использовали реактивы из набора Super Sensitive Polymer-HRP Detection System (Bio Genex, США) и реактивы из набора EnVision+System Labbeled Polymer-HRP Anti-Mouse (K4001) (Dako, Дания). Часть срезов окрашивали толуидиновым синим. Контролем служили области соматосенсорной и моторной коры головного мозга крыс в возрасте 20 сут.
Результаты и их обсуждение
Ранее показано, что фрагменты переднего мозгового пузыря крыс выживают после аллотрансплантации в поврежденный периферический нерв, а пересаженные клетки-предшественники дифференцируются в нервные и глиальные клетки [9-11; 13]. Через 28 сут после операции нейрональные элементы трансплантатов представляют собой клетки, экспрессирующие маркер зрелых нейронов - ядерный антиген NeuN (рис. 1). Оказалось, что некоторые из них содержат NOS, однако число таких нейронов невелико. Для оценки их дифференцировки было проведено сравнительное исследование тех же нейронов, развивающихся в неокортексе крыс в условиях in situ. С этой целью изучали NOS-содержащие клетки моторной и соматосенсорной коры головного мозга крыс в возрасте, который соответствует возрасту трансплантатов (20 сут постнатального развития). Многие из них достигают крупных размеров (до 12х21 мкм) и имеют толстые отростки (толщиной в основании до 2 мкм). У некоторых клеток удалось выявить отростки длиной до 50 мкм.
Известно, что NO-ергические нейроны выполняют в ЦНС позвоночных животных множество функций [6, 8]. Одна из основных функций газообразного нейромедиатора NO заключается в регуляции кровотока в мозге. Можно предположить, что присутствие таких клеток в поврежденном нерве может оказывать влияние на ангиогенез и регенерацию последнего.
Следует отметить, что в изученный срок NOS-содержащие клетки трансплантатов отличаются от нейронов неокортекса крысы Р20: они не достигают размеров клеток неокортекса соответствующего срока развития, лишь единичные нейроны снабжены отростками, интенсивность иммуногистохимической реакции в цитоплазме этих клеток ниже, чем в контроле.
Рис.1. Общий вид (а,б) и нейроны (в,г) трансплантатов эмбриональной закладки неокортекса через 28 сут после пересадки в седалищный нерв взрослой крысы. Окраска толуидиновым синим (а,в), иммуногистохимическая реакция на NeuN (б), иммуногистохимическая реакция на NOS
(г). Ув.: х100(а,б); х400 (в,г)
Т - трансплантат; Н - ткани нерва реципиента; стрелка - NOS-содержащие клетки; двойная стрелка - NOS-иммунонегативные нейроны.
По таким морфологическим показателям как размеры клеток, ядерноцитоплазматические отношения, наличие отростков, нитроксидергические нейроны, развивающиеся в условиях эктопической нейротрансплантации, не достигают степени дифференцировки нервных клеток, развивающихся в неокортексе крысы в условиях in situ. Эти данные согласуются с результатами выполненных ранее исследований с применением гистохимической реакции на NADPH-диафоразу [10, 11].
Важно отметить, что газообразный нейромедиатор NO в ЦНС позвоночных животных нередко выступает в роли ко-медиатора и синтезируется в клетках разной медиаторной принадлежности. В связи с этим требуются дальнейшие исследования с применением методов одновременной визуализации нескольких антигенов в нейронах трансплантатов.
Выводы.
Настоящее исследование показало, что в трансплантатах эмбриональных закладок неокортекса, развивающихся в нерве, через 28 сут после операции формируются отдельные NOS-содержащие клетки, однако они не достигают морфологической дифференцировки нейронов, развивающихся in situ. Это может быть связано с нарушением гистогенетических процессов в трансплантатах в ранние сроки после операции.
Литература
1. Колос Е.С. Цитохимическая характеристика клеток спинномозгового ганглия крысы на разных
сроках эмбрионального развития. Материалы II Всероссийской научной конференции молодых
ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» // Медицинский академический журнал. - 2012 (Приложение). - C. 158-161.
2. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Петрова Е.С., Карпенко М.Н., Григорьев И.П., Сухорукова Е.Г., Колос Е.А., Гиляров А.В. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии (руководство) / под ред Д.Э. Коржевского. Санкт-Петербург, 2014. (2-е издание, исправленное и дополненное). - 119с.
3. Коржевский Д.Э., Отеллин В. А., Григорьев И.П., Петрова Е.С., Гилерович Е.Г., Зинькова Н.Н. Иммуноцитохимическое выявления нейрональной NO-синтазы в клетках головного мозга крысы // Морфология. - 2007. - Т. 132. - № 4. - С. 77-80.
4. Коржевский, Д.Э.; Петрова, Е.С.; Кирик, О.В.; Безнин, Г.В.; Сухорукова, Е.Г. Нейральные маркеры, используемые при изучении дифференцировки стволовых клеток // Гены и клетки. -2010. - V.5. - № 3. - P. 57-63.
5. Карагяур М.Н., Лопатина Т.В., Стамбольский Д.В., Калинина Н.И., Ткачук В.А. Мезенхимальные стволовые клетки стимулируют восстановление периферического нерва благодаря секреции нейротрофических факторов. В сб. науч. Трудов Всерос. Конф. «Регенеративная биология и медицина». М.: Издат.Дом «Нарконет», 2011, с.78-79.
6. Мотавкин П.А., Дюйзен И.В. Нитроксидергические механизмы формирования боли // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2003. - № 2. - С. 11-16.
7. Обухов Д. К. Современные представления о развитии, структуре и эволюции неокортекса конечного мозга млекопитающих животных и человека // Вопросы морфологии XXI века. Выпуск 1. / Под редакцией доктора медицинских наук С. В. Костюкевича. — СПб.: СПбГМА им. И. И. Мечникова, Издательство ДЕАН, 2008. - С.200-223.
8. Обухов Д.К., Пущина Е.В., Вараксин А.А. Газообразные медиаторы в ЦНС позвоночных животных // Успехи современного естествознания. - 2011. - № 12. - С. 49-51.
9. Петрова Е.С. Изучение гистогенетических и нейродегенеративных процессов в нервной системе с помощью гетеротопической нейротрансплантации // Морфология. - 2009. - Т. 136. - № 6. - С. 8-19.
10. Петрова Е.С., Отеллин В.А. NADPH-d-положительные нейроны в гетеротопических трансплантатах эмбриональных закладок ЦНС // Бюллетень эксперим. биологии и медицины. -2000. - Т. 130. - № 12. - С. 688-691.
11. Петрова, Е.С.; Отеллин, В.А. НАДФН-диафораза-позитивные нервные клетки в
гетеротопических трансплантатах спинного мозга // Онтогенез. - 2000. - Т. 35. - №2. - C. 118123.
12. Сухорукова Е.Г. Ядерный белок NeuN в нейронах черного вещества головного мозга человека // Морфология. - 2013. - Т. 143. - № 2. - С. 78-80.
13. Чумасов Е.И., Петрова Е.С. Имплантация эмбриональных закладок неокортекса и спинного мозга в поврежденный периферический нерв взрослой крысы // Бюл. экспер. биол. - 1990. -Т.108. - №8. - С. 198-201.
14. Lopatina T., Kalinina N., Karagyaur M., Stambolsky D., Rubina K., Revischin A., Pavlova G., Parfyonova Y., Tcachuk V. Adipose-derived stem cells stimulate regeneration of peripheral nerves: BDNF secreted by these cells promotes nerve healing and axon growth de novo // PLoS ONE. - 6 : e17899.
15. Walsh S, Midha R. Use of stem cells to augment nerve injury repair // Neurosurgery. - 2009. - V.65. -№ 4. - A80-6.
16. Xiong G., Ozaki N., Sugiura Y. Transplanted embryonic spinal tissue promotes severed sciatic nerve regeneration in rats // Arch. Histol. Cytol. - 2009. - V. 72. - №2. - Р. 127-138.
