CC BY
86
11° ^tL ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
'3 (114) апрель 2018 г.
УДК 617.735-007.23:617.741-004.1
П.А. ЛЕБЕДЕВ1, И.В. МАЛОВ1, Е.С. ПШЕНИЦЫНА1, Л.Г. СЕННОВА1, Е.В. БАУКИНА1, В.Н. ГРИШАНОВ2, Д.В. КОРНИЛИН2, А.С. ЧЕБОТАРЕВ2, М.В. КОМАРОВА2, В.П. ЗАХАРОВ2
1Самарский государственный медицинский университет, 443099, г. Самара, ул. Чапаевская, д. 89 2Самарский национальный исследовательский университет им. акад. С.П. Королева, 443086, г. Самара, Московское шоссе, д. 34
Флюоресцентный метод определения содержания конечных продуктов гликирования в коже у пациентов с возрастной макулярной дегенерацией и катарактой
Контактная информация:
Лебедев Петр Алексеевич — доктор медицинских наук, заведующий кафедрой терапии, тел. +7-927-260-20-24, e-mail: lebedcard@rambler.ru
Малов Игорь Владимирович — доктор медицинских наук, заведующий кафедрой глазных болезней, тел. (846) 956-52-44, e-mail: ivmsamara@gmail.com
Пшеницына Елена Станиславовна — кандидат медицинских наук, доцент кафедры глазных болезней, тел. (846) 956-52-44, e-mail: pshenicina@gmail.com
Сеннова Людмила Георгиевна — кандидат медицинских наук, доцент кафедры глазных болезней, тел. (846) 956-52-44, e-mail: ipokgb@mail.com
Баукина Екатерина Васильевна — ординатор кафедры терапии, тел. +7-927-260-20-24, e-mail: lebedcard@rambler.ru Гришанов Владимир Николаевич — кандидат технических наук, доцент кафедры лазерных и биотехнических систем, тел. +7-927-751-16-55, e-mail: vladgrishanov@yandex.ru
Корнилин Дмитрий Владимирович — кандидат технических наук, доцент кафедры лазерных и биотехнических систем, тел. (848) 267-45-50, e-mail: vladgrishanov@yandex.ru
Чеботарев Александр Сергеевич — магистрант кафедры лазерных и биотехнических систем, тел. (848) 267-45-50, e-mail: vladgrishanov@yandex.ru
Комарова Марина Валерьевна — кандидат технических наук, доцент кафедры лазерных и биотехнических систем, тел. (848) 267-45-50, e-mail: vladgrishanov@yandex.ru
Захаров Валерий Павлович — доктор физико-математических наук, заведующий кафедрой лазерных и биотехнических систем, тел. (848) 267-45-50, e-mail: vladgrishanov@yandex.ru
Работа посвящена исследованию взаимосвязи между аутофлюоресценцией кожи, обусловленной накоплением в ней конечных продуктов гликирования (КПГ) и возрастной макулярной дегенерацией (ВМД) и катарактой. В исследовании выявлено достоверное увеличение параметра АФКу пациентов с ВМД: 0,154±0,005, p<0,008 в сравнении с контрольной группой: 0,125±0,004 и пациентами с катарактой: 0,127±0,009. Авторы считают, что данный метод имеет перспективу как скрининговый, результаты которого могут увеличить предсказуемую ценность подхода, основанного на оценке факторов риска ВМД.
Ключевые слова: аутофлюоресценция кожи (АФК), конечные продукты гликирования (КПГ), возрастная макуляр-ная дегенерация (ВМД) влажная форма, катаракта.
Р.А. LEBEDEV1, 1.В. MALOV1, Е.Б. PSHENITSYNA1, L.G. SENNOVM Е.У. BAUKINA1, V.N. GRISHANOV2, D.V. KORNILIN2, AS. CHEBOTAREV2, M.V. KOMAROVА2, V.P. ZAKHAROV2
1Samara State Medical University, 89 Chapaevskaya Str., Samara, Russian Federation, 443099 2Samara National Research University named after S.P. Korolev, 34 Moskovskoe highway, Samara, Russian Federation, 443086
I ОФТАЛЬМОЛОГИЯ
Fluorescence method of advanced glycation
endproduct test in the skin of patients
with age-related macular degeneration and cataract
Contact information:
Lebedev pa — D. Med. Sc., Head of the Therapy Department, tel. +7-927-260-20-24, e-mail: lebedcard@rambler.ru
Malov I.V. — D. Med. Sc., Head of the Department of Eye Diseases, tel. (846) 956-52-44, e-mail: ivmsamara@gmail.com
pshenitsina E.S. — Cand. Med. Sc., Associate Professor of the Department of Eye Diseases, tel. (846) 956-52-44, e-mail: pshenicina@gmail.com
Sennova L.G. — Cand. Med. Sc., Associate Professor of the Department of Eye Diseases, tel. (846) 956-52-44, e-mail: ipokgb@mail.com
Baukina E.V. — Resident Physician of the Department of Internal Medicine, tel. +7-927-260-20-24, e-mail: lebedcard@rambler.ru
Grishanov V.N. — Cand. Tech. Sc., Associate Professor of the Department of Laser and Biotechnical Systems, tel. +7-927-751-16-55,
e-mail: vladgrishanov@yandex.ru
Kornilin D.V. — Cand. Tech. Sc., Associate Professor of the Department of Laser and Biotechnical Systems, tel. (848) 267-45-50, e-mail: vladgrishanov@yandex.ru
Chebotarev A.S. — Master's Degree Student of the Department of Laser and Biotechnical Systems, tel. (848) 267-45-50, e-mail: vladgrishanov@yandex.ru
Komarova M.V. — Cand. Tech. Sc., Associate Professor of the Department of Laser and Biotechnical Systems, tel. (848) 267-45-50, e-mail: vladgrishanov@yandex.ru
Zakharov V.p. — D. Phys. and Math. Sc., Head of the Department of Laser and Biotechnical Systems, tel. (848) 267-45-50, e-mail: vladgrishanov@yandex.ru
The paper is devoted to the study of the relationship between skin autofluorescence caused by the accumulation of advanced glycation endproducts (AGEs) and age-related macular degeneration (ARMD), and cataract. The study revealed a significant increase in the AF parameter in patients with ARMD: 0.154±0.005, p<0.008 in comparison with the control group: 0.125±0,004 and patients with cataract: 0.127±0.009. The authors consider that this method has a perspective as a screening one, the results of which can increase the predictable value of the approach based on the evaluation of ARMD risk factors.
Key words: skin autofluorescence (AF), advanced glycation endproducts (AGEs), age-related macular degeneration (ARMG), wet, cataract.
Введение
Исследование конечных продуктов гликирования (КПГ) имеет непродолжительную историю. В 1980-х годах было обнаружено, что реакции между белками и сахарами (т.н. гликирование) приводит к образованию КПГ практически во всех типах клеток организма. Накопление КПГ считается одним из факторов старения и некоторых хронических заболеваний, связанных со старением. Доказано, что накопление КПГ в тканях имеет связь с развитием атеросклероза, сахарного диабета, поражениями почек [1], глаз [1, 2] и нервной системы. В нашей работе более подробно рассматривается взаимосвязь между КПГ и заболеваниями глаз, такие как возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и катаракта. Изучение данных патологий очень актуально на сегодняшний день, так как ВМД и катаракта являются ведущими причинами снижения зрения среди людей в возрасте 65 лет и старше в развитых странах, а затраты на их реабилитацию составляют значительную сумму бюджета здравоохранения ежегодно [3, 4].
Уже в настоящее время заболеваемость ВМД среди возрастной группы с 45 до 85 лет составила 8,7%, а к 2020 году ожидается еще большее увеличение количества данной патологии [5].
Симптомы влажной формы ВМД варьируют по степени тяжести, достаточно часто приводя пациента к необратимой и значительной потере остроты
зрения, снижению качества жизни и инвалидиза-ции. На ранних стадиях развития ВМД (сухая форма) происходит аномальное накопление протеинов желто-коричневого цвета, известных как друзы. Гистологическое исследование показывает, что друзы находятся между пигментным эпителием сетчатки и мембраной Бруха (базальной мембраной). Методом протеомного анализа было выявлено, что в друзах содержится 129 видов белков, включая кластерин, ^1^3 и альбумин, а также белки с высоким содержанием КПГ [6]. Данные факты подтверждают, что ВМД является заболеванием, ассоциированным с метаболическими процессами, ускоряющими старение.
Белки хрусталика подвергаются многочисленным физико-химическим изменениям при старении и ка-тарактогенезе. Реакция Майяра является одним из механизмов, вовлеченных в эти изменения. Альдегиды и кетоны реагируют с аминокислотными группами белков, без участия ферментов, создавая необратимые терминальные продукты, известные как КПГ. В хрусталике человека обнаружено несколько разных видов КПГ. Также он содержит большое количество аскорбата (витамина С), который, наряду с глюкозой, является основным предшественником КПГ. Различные изменения, происходящие при старении хрусталика и катарактогенезе, таких как пигментация белков хрусталика, формирование флуорофоров, ковалентных поперечных связей и
112 ^tL ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
'3 (114) апрель 2018 г.
образование активных форм кислорода, возникают благодаря КПГ [5].
Поскольку продукты гликирования обладают широкими полосами флюоресценции в спектральной области 420-600 нм, было предложено использовать для оценки содержания кПг в биологических тканях измерение интенсивности автофлюоресценции, величина которой коррелирует с концентрацией КПГ [7, 8]. Возбуждение автофлюоресценции осуществляется либо широкополосным источником (ртутная лампа), либо УФ светодиодом, а диффуз-но рассеянное кожей излучение и флюоресцентное излучение анализируется, как правило, в компактном спектрометре. Такая схема реализована в семействе приборов AGE Reader [2, 9]. Для измерений также используются оригинальные спектрофлюо-риметры [9, 10], однако эксплуатация последних предполагает участие в ней высококвалифицированного персонала. Основной трудностью в реализации данного метода является корректный учет оптических свойств кожи конкретного пациента, которая приводит в вариабельности спектральной интенсивности излучения [11].
Целью данного исследования стала апробация простого и эффективного устройства с встроенным интегратором АФК [12] для определения КПГ с целью ранней диагностики глазных заболеваний, ассоциированных с процессами старения.
Методика проведения исследований
Исследования АФК проводились в условиях офтальмологического стационара на базе Самарской областной клинической больницы им. В.Д. Середа-вина. Обследованы 42 пациента, которые были разделены на 3 группы. Первая группа — пациенты с клиническим диагнозом: незрелая возрастная катаракта (14 человек), острота зрения у данной группы пациентов составила 0,09-0,3. Вторая группа — пациенты с клиническим диагнозом — возрастная макулярная дегенерация сетчатки влажная форма (14 человек), острота зрения — 0,08-02. Третья группа — группа контроля, здоровые лица (14 человек), острота зрения в данной группе составила 0,7-1,0 с коррекцией. Средний возраст пациентов во всех группах составил 65 лет соотношение женщин и мужчин — 70% и 30% соответственно. Группу исключения по сопутствующим заболеваниям составили пациенты с сахарным диабетом, ишемической болезнью сердца. Всем пациентам выполнялось офтальмологическое обследование: визометрия, тонометрия, рефрактометрия, биомикроскопия, прямая офтальмоскопия, тестирование центрального зрения (тест Амслера), оптическая когерентная томография макулярной области сетчатки.
Измерение интенсивности АФК проводилось на портативном измерителе флюоресценции с опорным каналом на обратном рассеянии.
Значения диагностического параметра измерялось со ставшего традиционным участка кожи на внутренней стороне предплечья [7, 12, 13], как наименее подверженного внешним деструктивным факторам. Исследовался участок кожи в форме круга диаметром 10 мм. Для всех пациентов измерения проводились на обеих руках, и результаты усреднялись.
Процедура измерения параметра AUF состояла в записи в файл идентификатора пациента, его возраста, пола, индекса массы тела (ИМТ) и диагноза. Затем внутренняя сторона предплечья прикладывалась к защитному стеклу окна флюориметра и запускалась программа, обеспечивающая запись в файл 1000 пар отсчетов токов фотодиодов и расчет по ним значения AUF, что занимало всего 20 с. Сохраненные файлы результатов подвергались стандартной статистической обработке.
Сформированный массив данных анализировали в среде пакета SPSS 21. Сравнения групп выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), межгрупповые сравнения по критерию Тьюки. В работе приведены средние и их стандартные ошибки (M±m). Критическое значение уровня значимости принимали равным 0,05.
Результаты и их обсуждение
Результаты статистической обработки антропометрических параметров и значений АФК группах контроля, с диагнозами катаракта и влажная форма ВМД представлены в таблице.
В целом, пациенты основных групп были сопоставимы по возрасту между собой и группой контроля. Паспортный возраст является наиболее сильной детерминантой, определяющей АФК. Нами подтверждена связь возраста с параметром АФК в общем массиве: r=0,32, p=0,047, (см. рис.) и более тесная в группе с ВМД: r=0,60, p=0,025.
Другим параметром, связанным с возможным накоплением КПГ вследствие гликирования и пере-кисного окисления протеинов и липидов является избыточный вес и ожирение. Поэтому мы включили параметр ИМТ. В среднем, он был значимо наиболее низким в группе здоровых по отношению к пациентам с ВМД, соответствуя по величине общепринятой градации градации «избыточная масса тела». Мы не подтвердили корреляционной связи АФК с ИМТ ни в одной из групп, и в общей массе участников исследования, очевидно потому, что в пожилом и старческом возрасте оценка нутритивного статуса требует других, более сложных подходов в сравнении с пациентами молодого и среднего возраста.
Таблица.
Основные параметры в обследованных группах
Контроль (1) Катаракта (2) ВМД (3) ^NOVA P (1-2) Р(1-3) P (2-3)
М±т М±т М±т
Возраст, лет 60,86±1,26 65,86±1,46 64,50±1,71 0,061 0,057 0,207 0,797
ИМТ, кг/м2 25,99±0,84 28,69±1,22 29,57±0,84 0,037 0,140 0,036 0,803
AUF, усл. ед. 0,125±0,004 0,127±0,009 0,154±0,005 0,004 0,981 0,008 0,013
Примечание: рАNOVA — уровень значимости различий групп по дисперсионному анализу в целом
Рисунок.
Параметр аутофлюоресценции кожи у пациентов исследованных групп в зависимости от возраста (г=0,32, p=0,047)
Мальнутриция в этом возрасте может иметь более негативное воздействие, являясь фактором дистрофических процессов, чем избыточная масса тела.
Среднее значение АФК в группе пациентов с ВМД было существенно выше параметра в контрольной группе и у пациентов с катарактой. Последние группы по данному параметру достоверных отличий не имели. Это подтверждают данные литературы о накоплении КПГ в мембране Бруха, ретинальном пигментном эпителии, а также в коже пациентов с ВМД [1, 2, 7].
Хрусталик относится к тканям с медленным обменом КПГ, что при наличии предрасполагающих факторов: возраст, ультрафиолетовая экспозиция, сахарный диабет приводит к его помутнению с последующей потерей зрения. При конфокальной микроскопии с определением аутофлюоресценции хрусталика выявлена корреляция этого параметра с АФК у больных сахарным диабетом 1 и 2 типа, а также у здоровых. Соответственно у больных с сахарным диабетом абсолютные значения этих параметров были выше. В нашей работе не выявлено какое-либо увеличение АФК у пациентов с катарактой, что возможно связано с большим вкладом местно действующего повреждающего фактора — ультрафиолетового облучения и большего значения дефицита протекторных механизмов, действующих в большей степени на уровне вещества хрусталика, чем на системном. С другой стороны, активность универсальных механизмов, препятствующих отложению КПГ как в эпителии сетчатки, так и в коже, сосудистой стенке, в паренхиме внутренних органов нарушена, что имеет большее значение в патогенезе ВМД, объясняя установленную нами корреляцию. Подтверждение этого предположения требует дальнейших исследований.
Заключение
Наше исследование показало, что КПГ в коже накапливаются именно у пациентов с влажной формой ВМД, а накопление их у пациентов с катарак-
той и практически здоровых людей с возрастом характерно в меньшей степени.
Учитывая, что влажная форма ВМД и катаракта являются ведущими причинами слепоты, ассоциированной со старением, увеличение продолжительности жизни в популяции позволяет прогнозировать рост распространенности этих болезней. Превентивная стратегия, как наиболее эффективное направление в медицине, требует стратификации риска заболеваний на доклиническом этапе болезни, который может быть идентифицирован с помощью простых, неинвазивных технологий. Имеющиеся данные о патогенезе ВМД и результаты настоящего исследования демонстрируют тесную связь ВМД с накоплением конечных продуктов гликирования как в сетчатке глаза, так и в коже пациентов, чему соответствует увеличение аутофлюоресценции кожи. Авторы считают, что данный метод имеет перспективу как скрининговый, результаты которого могут увеличить предсказующую ценность подхода, основанного на оценке факторов риска ВМД.
Представляет интерес использование данного прибора у пациентов и с другими глазными заболеваниями, связанными с интенсификацией процессов, характеризующих метаболический стресс — гликирование и перекисное окисление, например, у пациентов с диабетической ретинопатией.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ryoji Nagai, Takefumi Mori, Yasuhiko Yamamoto, Yuichi Kaji, Yoshikazu Yonei Significance of Advanced Glycation End Products in Aging-Related Disease // JAAM. — Published online: Sep 16, 2010.
2. Glenn J.V., Mahaffy H., Wu K., et al. Advanced Glycation End Product (AGE) Accumulation on Bruch's Membrane: Links to Age-Related RPE Dysfunction // Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. — 2009. — Vol. 50, №1. — P. 441-51.
3. Jager R.D., Mieler W.F., Miller J.W. Age-related macular degeneration // N. Engl. J. Med. — 2008. — 358 (24). — P. 26062617.
4. Будзинская М.В., Воробьева М.В., Киселева Т.Н., и др. Современные подходы к лечению и профилактике возрастной маку-лярной дегенерации // Клиническая офтальмология. — 2007. — Т. 8, №2. — С. 78-82.
5. Jost B. Jonas, Chui Ming Gemmy Cheung, Songhomitra Panda-Jonas Updates on the Epidemiology of Age-Relatid Macular Degeneration // Asia-Pasific Academy of Ophthalmology. — 2017. — Vol. 6, №6. — P. 493-497.
6. Pius S. Padayatti, Alan S. Ng, Koji Uchida, et al. Argpyrimidine, a Blue Fluorophore in Human Lens Proteins: High Levels in Brunescent Cataractous Lenses // Investigative Ophthalmology & Visual Science.
— May 2001. — Vol. 42. — P. 1299-1304.
7. Mulder D.J., Bieze M., Graaff R., et al. Skin autofluorescence is elevated in neovascular age related macular degeneration // Brit. J. Ophtalmology. — 2010. — Vol. 94-5. — P. 622-25.
8. Dekker M.A., Zwiers M., Heuvel E.R., et al. Skin Autofluorescence, a Non-Invasive Marker for AGE Accumulation, Is Associated with the Degree of Atherosclerosis // PLOS ONE. — dec2013. — Vol. 8, is. 12. — P. e83084.
9. Wu M., Rementer C., Giachelli C.V. Vascular calcification: an update on mechanisms and challenges in treatment // Calcif tissue int.
— 2013. — 93 (4). — P. 365-373. doi:10.1007/s00223-013-9712-z
10. Mulder D.J., van Haelst P.L., Graaff R. et al. Skin autofluorescence is elevated in acute myocardial infarction and is associated with the one-year incidence of major adverse cardiac events // Netherlands Heart Journal. — 2009. — 17 (4). — P. 162-168.
11. Папаян Г.В. Волоконный флуоресцентно-отражательный спектрометр с многоволновым возбуждением / Г.В. Папаян, В.М. Журба, А.А. Кишалов и др. // Оптический журнал. — 2014. — 81 (1). — С. 38-43.
12. Булгакова Н.Н. Спектрально-флуоресцентный кольпоскоп / Н.Н. Булгакова, В.В. Смирнов, В.И. Фабелинский и др. // Биомедицинская радиоэлектроника. — 2013. — 4. — С. 42-49.
13. Dunaev A.V., Dremin V.V., Zherebtsov E.A., et al. Analysis individual variability of parameters of laser fluorescence diagnostics // Biotechnosphere. — 2013. — 2 (26). — P. 39-47.
