CC BY
82
Новые технологии в онкологии
© А.З. Альмяшев, Г.Г. Мельцаев, М.Т. Кулаев, 2015
УДК 616.345-006.6-07-08
ФЛЮОРЕСЦЕНТНАЯ ДИАГНОСТИКА И ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ РАКА ТОЛСТОЙ КИШКИ
А.З. Альмяшев, Г.Г. Мельцаев, М.Т. Кулаев
ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», г. Саранск ГБУЗ Республики Мордовия «Республиканский онкологический диспансер», г. Саранск
FLUORESCENCE DIAGNOSIS AND PHOTODYNAMIC THERAPY COLORECTAL CANCER
A.Z. Almyashev, G.G. Meltsaev, M.T. Kulaev
Ogarev Mordovia State University, Saransk Mordovia Cancer Center, Saransk
Альмяшев Али Закирович — кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» 430032, г. Саранск, ул. Ульянова, д. 26А, тел. +7-927-187-08- 97, e-mail: [email protected], [email protected] Almyashev A.Z. — Cand. Med. Sc., Associate Professor, Head of the Department of oncology with a course of radiation diagnosis and radiotherapy of the Ogarev Mordovia State University
26A Ulyanov St., Saransk, Russian Federation, 430032, tel. +7-927-187-08-97, e-mail: [email protected], [email protected]
Реферат. В настоящее время лазерные технологии стали неотъемлемой частью комплексной диагностики и лечения ряда онкологических и неонкологических заболеваний. Одним из новых «альтернативных» направлений является приоритетная для нашей страны лазерно-спектроскопическая диагностика — т.н. неинвазивная «оптическая биопсия» тканей: «фотодинамическая или флюоресцентная диагностика» (ФД) с применением или без фотосенсибилизаторов (ФС) и фотодинамическая терапия (ФДТ). Подробно рассмотрены экспериментальные и клинические данные, объясняющие биомеханизмы формирования «портрета» опухоли и реализации лечебного эффекта, в т.ч. при предраке и раке толстой кишки. Ключевые слова: флюоресцентная диагностика, фотодинамическая терапия, колоректальный рак.
Abstract. New optical technologies fluorescence detection and photodynamic therapy with exo- and endogenous photosensitizes: basic principles and clinical experience with colorectal cancer we present. Key words: fluorescence diagnosis, photodynamic therapy, colorectal cancer.
Введение
Идея использовать естественный свет для передачи информации и в лечебных целях стара как мир, как само человечество. Дошедшее до нас первое упоминание об осознанном использовании солнечных лучей с целью профилактики и терапии ряда заболеваний относится к временам правления в Древнем Египте фараона Аменхотепа IV (1375-1358 годы до н.э.).
В Древней Руси цепь сигнальных костров использовали для предупреждения о приближении неприятеля.
Россия одна из первых стран мира, применившая оптический квантовый генератор (лазер) в медицине.
По прогнозам международных научно-исследовательских центров медицина первой половины XXI века — это медицина низкоинтенсивных и низкоэнергетических лазеров (The Low Level Laser Therapy — LLLT), т.н. «неповреждающая лазерная терапия», «фотомедицина», основанная на недеструктивной биомодуляции и биостимуляции тканей. Феномен флюоресценции и фосфоресценции основывается на поглощении фотонов света субстратом, с последующим их испусканием при большей длине волны. Флюоресцентный маркер — это обычно химическое соединение, или ФС, который создан специально для того, чтобы избирательно накопиться в опухолевой
ткани. После того как начинает производиться возбуждение маркера с помощью светового излучения определенной длины волны, он начинает светиться, выявляя при этом зоны поражения. На этом именно и основан принцип флюоресцентной диагностики (ФД) и фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований (ЗН). Метод ФДТ активно развивается в Канаде, США, Японии, Франции, Германии, Нидерландах, в странах Юго-Восточной Азии (Сингапуре, Индонезии, Таиланде, Малайзии и др.). Систематическое клиническое изучение ФД и ФДТ при ЗН начались в 1977 г. [2]. ФДТ была одобрена для клинического использования в США в декабре 1998 года. Ткани, через которые проходит свет, имеют сложную гистоморфо-логическую архитектуру (толщина эпителия, мышечной и соединительной ткани, глубина опухолевой инфильтрации), биохимический состав и не могут считаться изотропными — это гетерогенная коллоидная система. Оптические свойства биотканей основаны на: 1) анатомических особенностях строения различных слоев исследуемой ткани; 2) распределении флюорофоров; 3) режимах низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ). Ультрафиолетовое излучение проникает в ткани слабо (микроны), вызывает эритему и является потенциально мутагенным. Синий (400440 нм) и зеленый свет (532 нм), не пенетрируя в глубину ткани, практически полностью абсорбируется поверхностным слоем и гемоглобином. Чем короче длина волны, тем больше энергия излучения. Оптика патологической и здоровой биотканей отличается друг от друга, что обусловлено различным содержанием основных веществ, поглощающих свет в видимом диапазоне спектра: воды, кислорода, липидов, меланина и гемоглобина. Максимум светопропуска-ния (прозрачности) биотканей, т.н. «окно», находится в области длин волн 630-1000 нм (красный и ближний инфракрасный диапазоны спектра). Глубина пенетра-ции света длиной волны около 635 нм колеблется от 4 до 10 мм. На флюоресценцию в данном диапазоне в меньшей степени (в отличие от возбуждения в сине-зеленой области спектра) влияют такие факторы, как несовершенство исследуемой поверхности и изменение ее кровенаполнения, поглощение и отражение света — спектральный профиль ткани. Аутофлюорес-ценция биотканей связана с присутствием в них и биомолекул дыхательной цепи окислительного фос-форилирования на внутренней митохондриальной мембране — NADH (никотинамидадениндинуклио-тид): флюоресцирует в спектральном диапазоне 400500 нм; флавинов (FAD): флюоресцируют в спектраль-
ном диапазоне 500-600 нм; эндогенные порфирины и их дериваты: флюоресцируют в спектральном диапазоне 600-750 нм; ароматические аминокислоты (тирозин, триптофан, фенилаланин), экстрацеллюлярные эластин и коллаген. ЫДРИ флюоресцирует только в восстановленной форме. ЫДРИ-индуцированная ауто-флюоресценция является индикатором гипоксии. Реальные спектральные характеристики ткани обусловлены также и флюоресценцией депозитов перекисного окисления липидов (ПОЛ), продуктов некроза и деградации гемоглобина, зависят от количества кровеносных сосудов, гемоглобина и пигмента в тканях. Необходимо учитывать, что ФС, введенный из вне при фотодинамической терапии (ФДТ), за счет больших коэффициентов поглощения может существенно изменить спектральные характеристики исследуемой биоткани. Транспорт ФС к клетке осуществляется за счет различных компонентов крови, среди которых большое значение имеют комплексы белков с липидами, так называемые липопротеиды низкой плотности. Методами флуоресцентной микроскопии было показано, что сенсибилизаторы первоначально адсорбируются на внешней мембране клетки, в течение нескольких часов проходят через мембрану внутрь клетки и затем адсорбируются на внутренних мембранах органелл, таких, например, как митохондрии. В результате освещения в клетке начинаются фотохимические процессы, в основе которых лежат два механизма. Реакции первого типа включают процессы, в которых образующаяся активная форма ФС непосредственно взаимодействует с молекулой субстрата. При втором механизме (тип II) возбужденная молекула ФС взаимодействует с кислородом, давая активную синглетную форму кислорода 1О2. Новым подходом к ФД и ФДТ стало использование эндогенных порфиринов в 1990 году [7]. Тетрапиррольные пигменты — порфирины, хлорофиллы и кобаламины играют исключительно важную роль в жизни животных, растений и бактерий. В составе гемоглобина, мио-глобина, цитохромов, каталазы и пероксидазы порфирины выступают в виде комплексов с ионами железа — гемов. Порфирины — это необходимый компонент метаболизма живой клетки и промежуточное звено в цепи синтеза гема и цитохромов (ферментов дыхательной цепи). В свою очередь, эндогенным предшественником (прекурсором) гема в цепи синтеза является дельта-аминолевулиновая, или 5-аминолевулиновая кислота (5-АЛК). 5-АЛК — общий предшественник и основа в биосинтезе всех тетра-пиррольных соединений в природе (животных и рас-
тений). 5-АЛК не является ФС per se («сам по себе»). Синтез Протопорфирина IX (Пп IX) из 5-АЛК осуществляется в печени. Затем идет транспортировка его в кровь и периферические ткани, откуда Пп IX и дериваты быстро элиминируются из организма и риск кожной фототоксичности составляет не более 48 часов. Однако известно, что клетки ЗН склонны к повышенному накоплению (до 20 раз выше, чем в нормальной ткани), длительному хранению и медленному выведению его метаболического продукта — фотоактивного циклического тетрапирролапротопорфири-на IX (Пп IX). Причиной этому является извращенный опухолевый метаболизм: повреждение цитохромов, повышение активности порфобилиногендезаминазы, приводящей к накоплению Пп IX в опухолевой клетке, аномальный синтез гема (снижение активности или дефицит феррохелатазы, превращающей Пп IX в гем, путем присоединения Fe2+ и его быстрая деградация). Большой интерес к лазерно-индуцированной ФД в мире в настоящее время вызван новыми технологиями в лечении солидных опухолей — интраопе-рационной или эндоскопической ФД и ФДТ. В эксперименте изучается роль сочетания гипертермии и ФДТ (Henderson B.W. et al., 1985). Обнаружено увеличение оксигенации опухоли во время и после ФДТ, что открывает дополнительные возможности комбинации с другими кислород-зависимыми методами (например, ЛТ). Показана цитокинмодулирующая роль ФДТ. Большое количество порфиринов было исследовано в качестве экзогенных ФС для ФДТ. При изучении феномена флюоресценции слизистой внутренних органов используют две методики: эндоскопическую индуцированную лазером локальную флюоресцентную биоспектроскопию (ИЛФС) и индуцированную светом флюоресцентную панорамную эндоскопию (ИСФЭ), т.н. D-light систему. 5-АЛК-индуцированная флюоресценция показала свою высокую эффективность в диагностике неопластических изменений уротелия при поверхностном раке мочевого пузыря (чувствительность — 100%, специфичность — 68,5%). Флюоресценция при тяжелой диспла-зии и раке in situ бронха в 5,3 раза выше чувствительности обычной бронхоскопии. Отмечена селективность накопления Пп IX в слизистой пищевода при метаплазии (пищеводе Баретта) и в аденокар-циноме в сравнении с подслизистой и мышечным слоем. В США 5-АЛК-индуцированная флюоресценция в настоящее время применяется только в сфере дерматологии (дерматоонкологии). Современные требования, предъявляемые к ФС (т.н. «идельный фо-
тосенсибилизатор») — это химическая чистота, селективность накопления в опухолевой клетке, химическая и физическая стабильность, короткий период (интервал) времени между применением (введением в организм) и его максимальной аккумуляцией в опухолевой ткани, возбуждение при длине волны, проникающей в биоткани на оптимальную глубину, быстрый период клиренса из организма. Среди органов пищеварения большинство исследований 5-АЛК-индуцированнной флюоресценции у человека проводились при изучении ЗН полости рта, пищевода, желудка, in vitro на моделях эпителия толстой кишки. D.M. Harris и J. Werkhaven (1987) [5] обратили внимание на то, что в условиях бактериальной обсеменен-ности (остатков пищи и кала) поверхность биоткани, в т.ч. и ЗН дает активную флюоресценцию в красном диапазоне спектра — микробиологическая идентификация колоний флюоресцирующих бактерий. У человека флюоресценция в опухолях ЖКТ в 2-4 раза выше, чем в нормальной слизистой [8]. Основным хромофором в тканях ЖКТ в области видимых длин волн (400-700 нм) является гемоглобин [1]. Ткани ЖКТ (слизистая оболочка, подслизистая, tunica muscularis propria) содержат флюорохромы в различных концентрациях, сочетаниях, что и определяет различия в спектральных характеристиках.
Аутофлюоресценция предракового поражения и ранних форм рака ЖКТ зависит от следующих факторов: 1) тканевой архитектуры (изменение толщины слизистой и разрушение слоев стенки органа); 2) способность к поглощению (абсорбции) света и отражающих свойств каждого слоя, особенно гемоглобина в капиллярах; 3) распределение и концентрация флюо-рофоров в различных слоях стенки; 4) биохимические особенности ткани; 5) метаболический статус ткани. В ряде работ показано, что ex vivo чувствительность и специфичность ИЛФС в дифференциальной диагностике аденоматозных и гиперпластических полипов толстой кишки составляет 100% и 94%. In vivo аденомы толстой кишки при ИЛФС отличаются от окружающих тканей в 97% всех случаев [4]. C.R. Kapadia, F.W. Cutruzzolz, K.M. O'Breinetal (1990) [6] на 35 резецированных полипах толстой кишки подтвердили гипотезу о возможности детектирования аденоматозной трансформации нормальной слизистой оболочки по спектрам аутофлюоресценции в диапазоне длин волн 350-600 нм. Специфичность и чувствительность метода локальной биоспектроскопии при возбуждении флюоресценции в УФ-диапазоне для аденомы толстой кишки in vivo составляют 100 и 96% соответствен-
но [3]. В пилотном исследовании H. Messmann, F. Kullmann, T. Wildetal (1998) [10] на модели острого и хронического язвенного колита у крыс, вызванного декстраном сульфата натрия, установили, что при возбуждении синим светом в диапазоне длин волн 390-436 нм 5-АЛК-индуцированной флюоресценции метод биоспектроскопии является высочувствитель-ным — 92% (концентрация Пп IX в опухоли была в 6 раз выше, чем в нормальной слизистой и мышечном слое), но слабо специфическим при идентификации дисплазии слизистой на фоне острого колита — 35%. Так как показано, что 5-АЛК аккумулируется в высоких концентрациях и в участках воспаления (при инфекционном и идиопатическом колите) — т.н. «ложнопо-ложительная флюоресценция». В ходе эндоскопических исследований in vivo изучались различия в спектрах аутофлюоресценции нормальной слизистой, гиперпластических и аденоматозных полипов толстой кишки (Prossi R., Gahlen J., 2002) при возбуждении в ультрафиолетовом диапазоне. Результаты спектральных исследований сопоставляли с данными морфологических анализов. Было показано, что различия в форме спектров аутофлюоресценции позволяют дифференцировать гиперпластические и адено-матозные полипы, при этом чувствительность и специфичность разработанной методики при идентификации аденоматозных полипов составила 86 и 80% соответственно. Отмечена высокая специфичность (90-2%) и чувствительность (90-91%) аутофлюорес-центного детектирования диспластических изменений слизистой толстой кишки на длинах волн 400-700 нм. Диагностически значимые различия в интенсивности и форме спектров аутофлюоресценции внешне здоровой слизистой оболочки, аденом и рака толстой кишки были показаны многими авторами как in vivo, так и ex vivo (Marchesini R., Brambilla M., Pigno^ еt al., 1992; Chwirot B.W., Kowalska M., Sypniewska N. еt al., 1999). Отмечено, что клетки недифференцированного и плоскоклеточного раков накапливают Пп IX хуже, в меньших концентрациях. Выявлено, что чувствительность и специфичность методики аутофлюоресцент-ной биоспектроскопии в дифференциальной диагностике — рак/норма и аденома/нормальная слизистая толстой кишки составляют 80,6, 88,2 и 90,5 и 95,2% соответственно. В экспериментах на крысах использование экзогенного флюорофора (деривата гемато-порфирина) позволило выявить ЗН толстой кишки с чувствительностью 95% и специфичностью — 98% [4]. Были исследованы и причины, вызывающие различия в аутофлюоресценции нормальной слизистой, адено-
карциномы, тубулярной и ворсинчатой аденомы толстой кишки (Izuishi K., Tajiri H., Fujii T. et al., 1999). Известно, что наиболее часто спектрометрические различия объясняют наличием таких эндогенных флюорохромов, как флавины, НАДН и коллаген. Проведенное ex vivo исследование флюоресценции замороженных образцов тканей в синем диапазоне спектра (400-440 нм) показало, что 1) флавины и НАДН не влияют на регистрируемую аутофлюоресценцию; 2) главным источником флюоресценции тканей толстой кишки является коллаген подслизистого слоя. Вывод: главной причиной уменьшения интенсивности аутофлюоресценции аденом и аденокарцином толстой кишки является снижение интенсивности ауто-флюоресценции коллагена подслизистого слоя за счет экранирующего эффекта утолщенного слоя аде-номатозной ткани или раковая инфильтрация слизистой. Работ, посвященных изучению метода ФДТ в экспериментальной и клинической онкологии при полипах и раке толстой кишки (РТК), крайне мало и они противоречивы. Исследованы in vitro индо- и фта-лоцианины (включая сульфированный фталоцианин алюминия), 5-АЛК, mTHPC. Отмечено, что при ФДТ неповрежденным остается коллагеновый слой стенки кишки, что выгодно отличает этот метод от обычного термического воздействия, уменьшая риск перфорации полого органа после лечения. C.S. Loh, P. Bliss, S.G. Bown et al. (1994) у 8 больных после нерадикального удаления ворсинчатой опухоли ободочной или прямой кишки с помощью YAG-ниодимого лазера применили ФДТ с производными гематопорфирина (sodiumporfimer или Фотофрин). Световое воздействие осуществлялось в дозе 50 Дж/см2. Положительный ответ, заключающийся в полной резорбции опухоли, был зарегистрирован у 6 (75 %) пациентов. P. Milkvy, H. Messmann, J. Regulaetal (1998) использовали для ФДТ РТК mTHPC и sodiumporfimer, но результаты его противоречивы. Только у одного пациента удалось получить полный ответ при лечении поверхностного рака 8 мм в диаметре, используя sodiumporfimer (Фотофрин). Имеется всего несколько сообщений об использовании 5-АЛК для ФДТ РТК у человека. D. Fromm (1996) описал случай рецидивирующей аденокарциномы толстой кишки у 60-летнего пациента, который уже перенес несколько хирургических вмешательств, прежде чем была опробована вышеописанная технология. Больной перо-рально получил 60 мг/кг массы тела 5-АЛК и через 6 часов, что соответствовало максимуму накопления Пп IX в плазме, опухоль была локально облучена све-
том с помощью лазера и волоконной оптики. Чтобы избежать ожогов, была откалибрована выверенная опытным путем безопасная сила света в 200 мВт на 1 см2. Общая доза светового облучения, которую больной получил в два приема по 13 мин., составила 50 Дж на 1 см2. Гистологические исследования, проведенные до лечения и на 9-й день после терапии, показали некроз опухоли. Поскольку через 6 мес. при проведении сигмоскопии был обнаружен рецидив, процедуру повторили. Различие было только в силе и дозе света: однократно 100 Дж на 1 см2. Через 48 ч. при сигмоскопии был виден очаг локального воспаления, не затрагивающий здоровые ткани. Через неделю облученная область некротизировалась. Ни в первый, ни во второй раз не отмечалось никаких побочных явлений. Не было ни температуры, ни кровотечения, ни изменений моторики толстой кишки. Изменений функции печени или фототоксических реакций также не наблюдалось. Обсуждая полученные результаты, автор отмечает, что нерешенными остаются еще множество вопросов. Оптимальная доза 5-АЛК, сила света и оптимальное время облучения пока неизвестны. Также неясно, как соотносится пик концентрации Пп IX в плазме с его накоплением в опухолевых тканях. Глубина некроза опухоли также неясна. Надо также иметь в виду, что теоретически введение 5-АЛК per se может вызывать три вида токсических реакций: солнечные ожоги в течение 48 ч., умеренное преходящее нарушение функции печени и умеренную тошноту, реже рвоту тотчас после приема препарата. Это первый документированный случай использования 5-АЛК-индуцированного Пп IX для ФДТ РТК, который можно смело назвать «биохимической хирургией» для лечения колоректальных новообразований показал, что при некоторых обстоятельствах данная технология имеет право на применение. Работ, посвященных изучению лазерно-индуцирован-ной флюоресценции регионарных лимфоузлов при РТК, в доступной нам литературе мы не нашли. Применение эндоскопической ФДТ позволяет воздействовать на относительно большие участки слизистой толстой кишки без необходимости их непосредственной визуализации. Одной из проблем ФДТ на современном этапе является повышение селективности накопления ФС в опухоли, так как следствием низкой аккумуляции является невысокая эффективность лечения и повышенная чувствительность кожи к дневному свету. С целью повышения этой селективности использовались такие приемы, как химическая модификация периферических заместителей ФС — акту-
альное и бурно развивающееся направление химии тетрапиррольных соединений, по которому ежегодное количество публикаций составляет несколько сотен. Другим направлением является ковалентное присоединение (конъюгация) ФС с декстранами (альбумином), с моноклональным антителам против опухолеассоциированных антигенов или образование нековалентных комплексов ФС с липопротеина-ми (липосомами), комбинация с пенетрантами (диме-тилсульфоксидом) для усиления липофильности. 5-АЛК-индуцированная ФД становится одной из самых популярных методик визуализации ЗН в мире (для эндогенных соединений резко снижены требования органов фармакологического надзора). Основной проблемой ФД и ФДТ остаются: 1) непосредственная доставка ФС в очаг опухолевого поражения;
2) создание в нем максимальной концентрации (градиент опухоль/нормальная слизистая) — т.н. «селективность»; 3) снижение фототоксичности ФС для здоровых тканей за пределами опухолевого очага. Преимущества ФД и ФДТ: 1) отсутствие перекрестной резистентности и возможное применение нескольких курсов лечения; 2) низкая острая, «темновая» и кумулятивная токсичность (гематологическая, желудочно-кишечная и др.); 3) новые возможности для комбинированного и комплексного лечения ЗН; 4) возможность амбулаторного обследования и лечения пациентов. Очевидные недостатки лазерной терапии — это 1) необходимость специальной дорогостоящей аппаратуры; 2) высокая стоимость ФС;
3) фармакодинамика некоторых ФС (продолжительная экспозиция в тканях, прежде всего в коже, с развитием фототоксических эффектов). Экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о влиянии внутри- и надсосудистого низкоинтенсивного лазерного воздействия на процессы гипокоагуляции, активации фи-бринолиза и дезагрегации форменных элементов крови.
Литература
1. Dacosta R.S. New optical technologies for earlier endoscopic gastrointestinal lesions / R.S. Dacosta, B.C. Wilson, N.E. Marcon // J. Gastroent. Hepatol. — 2002. — Vol. 17 (Suppl.). — P. 85-104.
2. Dougherty T.J. Photoradiation therapy for the treatment of malignant tumors / T.J. Dougherty, J.E. Kaufman, A. Goldfarb et al. // Cancer Res. — 1978. — Vol. 38. — P. 2628-2635.
3. Eker C., Montan S., Jaramillo E. et al. // Gut. — 1999, Apr. — Vol. 44 (4). — P. 511-518.
4. Haringsma J. The value of fluorescence technique in gastrointestinal endoscopy: Better than the? / J. Haringsma, G.N.J. Tytgat // Endoscopy. — 1998. — № 4. — P. 416-418.
5. Harris D.M. Endogenous porphyrin fluorescence in tumors / D.M. Harris, J. Werkhaven // Laser Surg. Med. — 1987. — Vol. 7. — P. 467-472.
6. Kapadia C.R., Cutruzzolz F.W., O'Brein K.M. et al. // Gastroenterology. — 1990, Jul. — Vol. 99 (1). — P. 150-157.
7. Kennedy J.C. Photodynamic therapy with endogenous protoporphyrin IX: basic principles and present clinical experience / J.C. Kennedy, R.H. Pottier, D.C. Pross // J. Photochem. Photobiol.B. — 1990. — Vol. 6. — P. 143-148.
8. Orth K. Fluorescence detection of small gastrointestinal tumours: principles, technique, first clinical experience / K. Orth, D. Russ, R. Steiner, H.D. Berger // Langenbeck's Arch. Surg. — 2000. — Vol. 385. — P. 488-494.
9. Gahlen J. Experimentelle Validierung der laser lichtin duzierten Fluoreszenz diagnostik von Dyspasien und Friihkarzinomen des Kolons / J. Gahlen, J. Stern, J. Preßmar et al. // Langenbeck's Arch. — 1997.—Supp. 1. — P 141-144.
10. Messmann H. Photodynamic diagnosis of gastrointestinal precancerous lesions after sensitization with 5-aminolevulinic acid. A pilot study / H. Messmann, R. Knuechel, E. Endlicher et al. // Dtsch. Med. Wochenschr. — 19 98. — Vol. 123. — P. 515-521.
