CC BY
17
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
АКУСТИКА И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЗИКА УДК 535.37; 532:541.64
ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ РАСТВОРОВ АЛЬБУМИНА, СОДЕРЖАЩИХ
ИОНЫ РЬ2+ И Na+
Г. П. Петрова, Н. В. Сокол
(.кафедра молекулярной физики) E-mail: [email protected]
С помощью методов флуоресцентного анализа в видимом и ультрафиолетовом диапазонах длин волн проведено исследование растворов сывороточного альбумина с ионами металлов Na+, Pb2+ при изменении ряда параметров среды, тажих жаж жондентрадия мажромолежул, рН и ионная сила растворов. С помощью метода поляризации флуоресценции обнаружено образование наночастиц — белжовых жластеров в водных растворах альбумина, содержащих ионы тяжелого металла — свинца. Данное исследование имеет пражтичесжое значение для решения задач эжологии и медицины.
Несомненный интерес для современной науки представляет изучение влияния токсичных металлов на белковые системы. Поведение молекул белков в растворах определяется электростатическими (ку-лоновскими) взаимодействиями поверхностных зарядов. В работах [1, 2] было показано, что ионы тяжелых металлов (обладающие большими ионными радиусами) прочно связываются с зарядами на поверхности белковой макромолекулы. В этом случае существенную роль начинают играть силы диполь-дипольного взаимодействия. Макромолекулы белка сближаются на предельно допустимые расстояния, что приводит к образованию так называемых белковых нанокластеров.
В данной работе проведено сравнительное исследование растворов сывороточного альбумина (БСА), содержащих ионы металлов с различными ионными радиусами — РЬ2+ и Ка 1 — с помощью методов флуоресцентной спектроскопии и поляризации флуоресценции.
Метод флуоресцентного анализа является наиболее чувствительным для определения количественного содержания вещества в биологических образцах, кроме того исследование вращательной подвижности молекул в растворах может быть проведено с помощью метода поляризации флуоресценции. Вращательная подвижность частиц в растворах белка при добавлении токсичных ионов будет изменяться вследствие образования нанокластеров. Исследуя поляризацию флуоресценции белковых растворов, содержащих токсичные ионы, можно определить времена корреляции вращательной подвижности, которые напрямую связаны с массами и раз-
мерами частиц — нанокластеров, а также условия их образования в зависимости от параметров среды.
Согласно теории вращательной деполяризации люминесценции Левшина-Перрена [3], при поляризованном возбуждении справедливо соотношение
±-±м{±-}.\ЛL _Vrl_MrL
Р^Р0 \Р0 3/ rrot' Trot ^ kT ^ pkT' Ш
где Р — наблюдаемая степень поляризации флуоресценции; Ро ее предельное значение в отсутствие деполяризации; V,M — объем и масса вращающейся молекулы; р — ее плотность; тц — время жизни возбужденного состояния; тгоt — время корреляции вращательной подвижности (переориентации) молекулы; rj — вязкость раствора.
С помощью спектрофлуориметра «Perkin Elmer» было проведено исследование растворов альбумина с различными концентрациями ионов РЬ2+ и Na + при возбуждении в ультрафиолетовом диапазоне длин волн. Зависимости интенсивности флуоресценции растворов приведены на рис. 1 ,а.
Как можно видеть из рис. 1, а, наличие в растворе белка ионов свинца приводит к уменьшению относительной интенсивности флуоресценции по сравнению с интенсивностью флуоресценции в чистом растворе белка и в растворе БСА с ионами натрия. Эффект уменьшения значения интенсивности можно объяснить тушением флуоресценции в результате связывания ионов свинца с белком, при этом происходит также и агрегация частиц. Поляризация флуоресценции определялась по формуле
BSA (6.4 • 10" 10"
6 М) + Na+(5.6 -10 3 М)
•10 6 М)+ РЬ2+(8.3 -10 10 М) М)+ Pb2+(1.7 -10~7 М)
М)+РЬ2+(6.3-10 3М)
,-5 7
В8А (6.4-10"
\ М) + Na+(5.6 -10 3М)
В8А (6.4-10
BSA (6.4 -10 6 М)+ РЬ2+(8.3 -10 10 М) В SA (6.4 -10~6 М)+ РЬ2+(1.7 -10~7 М)
'М)+РЬ2+(6.3
10 5М)
8 рН
Рис. 1. Интенсивность флуоресценции в растворах БСА, содержащих ионы металлов, при возбуждении на 270 нм (а) и зависимости от рН времени корреляции вращательной подвижности частиц в растворах БСА, содержащих ионы свинца и натрия (б)
М/М0 Cl
Рис. 2. Зависимость М/М0 от ^(Срь/Сбба) , рассчитанная из параметров флуоресценции растворов БСА + ацетат РЬ (а) и зависимость времени корреляции вращательной подвижности от логарифма концентрации ацетата свинца в растворах БСА при разных рН (б)
где /ц и /_|_ — интенсивности флуоресценции горизонтально и вертикально поляризованного испускания в случае возбуждения образца вертикально поляризованным светом.
Экспериментально определенные по формуле (1) времена корреляции вращательной подвижности частиц в растворах альбумина, содержащих ионы свинца, увеличиваются в 4-8 раз по сравнению с соответствующим значением тТ0\ в растворе белка с ионами натрия (рис. 1,6). Максимальные величи-
ны времени корреляции вращательной подвижности наблюдаются в изоэлектрической точке белка, что связано с образованием дипольных кластеров. Силы диполь-дипольных взаимодействий между частицами в этой области рН максимальны, это приводит к росту массы кластеров и согласуется с результатами, полученными другими методами [2, 4].
На рис. 2, а приведен расчетный график зависимости отношения массы наночастиц к массе молекулы альбумина М/М^ от логарифма отношения
Trot, НС
рН5
рН4.5 рН5.5 рН6.5 рН7 рН3.5
"4 lgCPb
молярных концентраций белка и ацетата свинца Срь/СвэА ПРИ рН 5. Из графика видно, что отношение М/Мо растет с ростом относительной концентрации свинца в растворах. На рис. 2, б показана зависимость времен 1Т0\ корреляции вращательной подвижности частиц в растворах белка с ацетатом свинца, определенных по рис. 1,6, от логарифма концентрации свинца для различных значений рН.
Выводы
Исследование особенностей флуоресценции растворов сывороточного альбумина (БСА) с солями металлов 1Ма+ и РЬ2+ в ультрафиолетовом диапазоне длин волн при изменении ряда параметров среды, таких как концентрация макромолекул, рН и ионная сила растворов, показало, что
1) наличие в растворах белка ионов легкого металла (1Ма + ) не приводит к увеличению времени корреляции вращательной подвижности и массы частиц;
2) наличие в растворах БСА ионов тяжелого металла (РЬ2+) приводит к увеличению времени корреляции вращательной подвижности частиц, что связано с образованием наноструктур — белковых кластеров;
3) значения времен корреляции вращательной подвижности частиц в растворах БСА, содержащих ионы РЬ2+, растут при увеличении ионной силы раствора и имеют максимумы в изоэлектрической точке белка.
Авторы признательны проф. А. С. Салецкому за предоставленную возможность провести измерения на спектрофлуориметре «Perkin Eimer».
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 05-02-17838).
Литература
1. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N. // Gen. Physiol. Biophys. 1998. N 17. C. 97.
2. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Тен Д.И. // Квант, электроника. 2002. № 32. С. 1.
3. Левшин J1.В., Салецкий A.M. Оптические методы исследования молекулярных систем. М., 1994.
4. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева А.П. и др. // Вестн. Моск. ун-та. Физ. Астрон. 2003. № 2. С. 42 (Moscow University Phys. Bull. 2003. N 2. P. 49).
Поступила в редакцию 14.04.06
