CC BY
55
ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ УДК 535.372
ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ НАНОЧАСТИЦ РАСТВОРЕННОГО ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА В ПРИРОДНОЙ ВОДЕ
A.C. Милюков, C.B. Пацаева, В.И. Южаков, О.М. Горшкова*',
Е. М. Пращи кина*>
(.кафедра общей физики) E-mail: spatsaeva@mail.ru
Проведено исследование флуоресценции наночастиц растворенного органического вещества (РОВ) для различных фракций при следующих длинах волн возбуждения флуоресценции: 270, 310 и 355 нм. Получены значения квантового выхода флуоресценции коллоидной (с размером молекул от 5 до 200 нм) и низкомолекулярной (с размером молекул менее 5 нм) фракций. Показано, что положение максимума спектра испускания зависит от размера молекул РОВ и от длины волны возбуждения.
Под растворенным органическим веществом (РОВ) понимают смесь высокомолекулярных и низкомолекулярных органических соединений различной химической природы, находящихся в природной воде и участвующих в биогеохимических процессах. В состав РОВ входят белки, полипептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, гуминовые и фульвовые кислоты, низкомолекулярные органические кислоты и их соли, спирты, альдегиды, кетоны и многие другие органические вещества [1]. Все они имеют разное химическое строение, молекулярную массу и размер молекулы (от 5 до 1000 нм).
РОВ природного происхождения флуоресцирует [2-5], поэтому применение флуоресцентного анализа для диагностики природных вод является эффективным методом, отличающимся высокой чувствительностью, дистанционностью и экспрессностью.
Необходимость исследования спектральных характеристик РОВ обусловлена целым рядом современных научных и практических проблем. Экологический мониторинг природных вод, перераспределение и концентрирование загрязняющих веществ на геохимических барьерах (например, при смешении пресных и соленых вод, вод с различной температурой, в придонных слоях на границе раздела поверхностных вод с атмосферой), перенос вещества между океаном, атмосферой и литосферой, эвтро-фикация природных вод, проведение оптических измерений в воде, оценка качества воды в процессе водоподготовки и обеззараживания на водопроводных станциях — все эти проблемы требуют изучения флуоресценции РОВ природной воды и его характеристик.
Целью настоящей работы стало применение спектральных методов к изучению наночастиц РОВ
Географический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова.
в природной воде, компоненты которого являются неотъемлемыми звеньями природной трофической цепи. Было проведено исследование спектральных особенностей наночастиц РОВ в коллоидной и низкомолекулярной формах. Последовательно были осуществлены микро- и ультрафильтрации отобранных проб — разделение РОВ на фракции в зависимости от молекулярной массы частиц, измерение оптической плотности и спектров испускания флуоресценции фракций РОВ, анализ полученных спектров, расчет величины квантового выхода флуоресценции РОВ и выявление спектральных свойств и закономерностей для выделенных фракций. Разделение РОВ на фракции необходимо для последующего установления групп флуорофоров, определяющих его спектральные свойства, и выяснения характера их физико-химического взаимодействия.
Материалы и методы исследования
молекулярных фракций РОВ
Пробы воды были отобраны в октябре 2005 г. в р. Москве по ходу ее течения в четырех различных точках, расположенных в следующем порядке:
• проба № 1 (д. Барсуки, верховье р. Москвы, фоновый створ);
• проба № 2 (после прохождения реки через г. Москву и ее окрестности, 0.2 км выше г. Вое-кресенска);
• проба № 3 (1.0 км ниже г. Воскресенска, после техногенного геохимического барьера);
• проба № 4 (г. Коломна, 0.1 км выше устья р. Москвы).
Фильтрация водных проб была осуществлена в два этапа по схеме, представленной на рис. 1. Сначала из проб была удалена органическая взвесь при помощи лавсанового мембранного фильтра МФ-200
Рис. 1. Схема микро- и ультрафильтрации проб воды р. Москвы
(Дубна, Россия) с диаметром пор 200 нм. После фильтрации на МФ-200 пробы были распределены по трем идентичным системам стаканной ультрафильтрации, представляющими собой второй этап. Для ультрафильтрации использовался ацетил-целлюлозный фильтр УАМ-50 (Владипор, Россия) с номинальным диаметром пор 5 нм. Коэффициент удержания по раствору рафинозы (молекулярный вес около 600 дальтон) в воде составлял в среднем по трем фильтрам 96.5±1.0% для трех ультрафильтрационных ячеек.
Молекулярные комплексы РОВ размером менее 5 нм, образующие низкомолекулярную (НМ) фракцию РОВ, проникли через мембрану. Над фильтром были удержаны наночастицы РОВ, которые составили так называемую коллоидную фракцию РОВ (КОВ) с размером молекул от 5 до 200 нм.
Спектральные измерения
Спектры испускания флуоресценции были измерены с использованием спектрофлуориметра Perkin Elmer LS55 при возбуждении на длинах волн 270, 310 и 355 нм. Выбор длин волн возбуждения учитывает накопленный экспериментальный опыт научных групп, изучающих РОВ [2-7], и во многом определяется длинами волн возбуждения основных компонент РОВ. Спектры поглощения и значения оптической плотности были получены на спектрофотометрах Specord М40 и Perkin Elmer Lambda 35. Все измерения были выполнены при комнатной температуре в стандартных кварцевых кюветах толщиной 1 см.
Были проведены исследования растворов гуми-новой кислоты Aldrich в пяти различных концентрациях: 0.495; 0.99; 1.99; 3.96 и 7.92 мг/л -и растворов сульфата хинина в воде с добавлением серной кислоты H2SO4, взятой в концентрации 0.05 моль/л (четыре различные концентрации кра-
сителя порядка 10 7 моль/л каждая, а также четыре его эталонных концентрации: 4- 10^6, 8- 10^6, 2 • 10^5 и 4 • 10^4 моль/л).
Растворы сульфата хинина использовались для расчета абсолютных значений квантового выхода флуоресценции методом эталонного красителя [8] для фракций РОВ и гуминовой кислоты. Во-первых, выбор в качестве эталонного красителя сульфата хинина обусловлен тем, что его полоса испускания флуоресценции близка по форме, ширине и положению максимума к тем же спектральным характеристикам изучаемых водных проб. Во-вторых, квантовый выход сульфата хинина в водном растворе серной кислоты неоднократно был измерен многими исследователями, известен с хорошей точностью и рекомендован в качестве эталонного [9]. Квантовый выход флуоресценции водных растворов сульфата хинина зависит от типа добавляемой кислоты, ее концентрации и температуры. Он не зависит от длины волны возбуждения в диапазоне 290-360 нм и концентрации красителя при концентрациях меньших 10^6 моль/л.
Расчет величины квантового выхода флуоресценции изучаемых растворов производился по следующей схеме:
• рассчитывались значения интегральной интенсивности испускания флуоресценции для каждого раствора (с вычитанием сигнала комбинационного рассеяния воды в тех случаях, где это было необходимо);
• определялись значения оптической плотности D\ на длине волны возбуждения спектров флуоресценции (для растворов хинина, имеющих относительно высокий квантовый выход, задача усложнялась малыми величинами оптической плотности); значения оптической плотности на 310 и 355 нм для растворов сульфата хинина рассчитывались путем экстраполяции значений оптической плотности на этих длинах волн для эталонных концентраций в область меньших концентраций (концентрации разведенных растворов (порядка 10^7 моль/л) рассчитывались по значениям оптической плотности в максимуме спектра поглощения на 250 нм, при этом для растворов сульфата хинина форма спектра поглощения считалась неизменной во всем исследованном диапазоне);
• значения оптической плотности на длине волны возбуждения флуоресценции и интегральной интенсивности испускания флуоресценции для каждой из полученных концентраций раствора хинина сульфата использовались для построения зависимостей Aiuo(A\) эталонного красителя (рис. 2), а линейная аппроксимация полученных зависимостей /¡|U0(A\) для растворов различной концентрации использовалась для определения тангенса угла наклона KsVdm\ соответствующих прямых;
• для водных проб РОВ в качестве соответствующей величины тангенса угла наклона К исполь-
I, отн. ед. 60
0
0.001
0.002
0.003
0.004 Б 0.005
Рис. 2. Зависимость интегральной интенсивности флуоресценции от оптической плотности /лш,(А\) для растворов сульфата хинина
зовали отношение интегральной интенсивности флуоресценции к оптической плотности на длине волны возбуждения (310 или 355 нм);
• значение квантового выхода изучаемого раствора Ф рассчитывалось по формуле Ф = = Фяхтй^/Кяхжй) * гДе ^ат! значение квантового выхода флуоресценции эталонного красителя. При расчетах для сульфата хинина в водном растворе серной кислоты концентрации 0.05 моль/л за известное значение квантового выхода принималось Ф = 0.508 [9].
Испускание флуоресценции фракций РОВ
Типичный спектр люминесценции фракций РОВ при возбуждении УФ-светом имеет широкую полосу испускания с максимумом в районе 410-440 нм. Длина волны максимума спектра испускания зависит от длины волны возбуждения и от типа фракции РОВ.
У коллоидной фракции (КОВ) положение максимума спектра флуоресценции сдвинуто в длинно-
Интенсивность, отн. ед.
100
^ N
\
\
XX Х.\
ков
\
\
Хх
ч
волновую область относительно максимума спектра флуоресценции исходной пробы РОВ. Максимум испускания НМ фракции, наоборот, сдвинут в направлении малых длин волн относительно максимума испускания исходной пробы РОВ (рис. 3). Это явление может быть объяснено тем, что, как правило, более крупные молекулярные агрегаты имеют спектр испускания, сдвинутый в длинноволновую область по сравнению со спектрами мономеров и меньших молекулярных комплексов [10].
Положение максимума полосы испускания флуоресценции различных фракций РОВ зависит от длины волны возбуждения, что видно на рис. 4. При возбуждении на 270 и 355 нм положение максимума приходится на 430-440 нм. При возбуждении на 310 нм происходит так называемый «синий сдвиг>> максимума в сторону более коротких волн. Положение максимума испускания при этой длине волны возбуждения приходится на диапазон 417-427 нм в зависимости от типа пробы. Такой «синий сдвиг>> впервые был зафиксирован при изучении морских и эстуарных водных проб. Этот сдвиг обусловлен возбуждением на 310 нм дополнительных групп флуорофоров и хромофоров [5, 6].
Значения оптической плотности и абсолютные значения квантового выхода фракций РОВ приведены в таблице. (Каждая из исследуемых проб РОВ распределялась по трем независимым идентичным фильтрационным системам в целях повышения статистической значимости полученных экспериментальных значений для выделенных фракций.)
Усреднение по четырем пробам РОВ, трем коллоидным и трем низкомолекулярным фракциям дало следующие значения квантового выхода при возбуждении на 355 нм:
• образцы РОВ: Ф = (1.75 ± 0.25) • 10"
• НМ-фракция: Ф = (2.07 ± 0.40) • 10^2 (приблизительно на 20% больше, чем у фракции РОВ);
Интенсивность, отн. ед.
30
-2 .
20
10
0
Пробы РОВ (май 2005)
А // -Г ••X ....... Хл Х\ 2 3 4 Дистиллированная вода
" ^ А # \ / \ | 1 ч НМ фракция РОВ
—1--1--1-1— ----- —|- |
450 500 550 600
Длина волны, нм
400 450 500 550 600
Длина волны, нм
Рис. 3. Спектры флуоресценции фракций РОВ с различным размером частиц при возбуждении на
355 нм
60 50 40 30 20 10
НМ фракция РОВ
Интенсивность, отн. ед. 70
Интенсивность, отн. ед.
Пробы РОВ (май 2005) Возбуждение на
- 270 нм
------310 нм
----- 355 нм
300 350 400 450 500 550 600
Длина волны, нм
500 550 600 Длина волны, нм
30 25 20 15 10 5
Рис. 4. Спектры флуоресценции фракций РОВ
270, 3
Значения оптической плотности и квантового выхода флуоресценции фракций РОВ
Место забора пробы № фильтра Дз.5.5 $355
Фракция РОВ
д. Барсуки 0.018 1.64 • Ю-2
г. Воскресенск (верх) 0.028 2.00 • Ю-2
г. Воскресенск (низ) 0.039 1.34 • Ю-2
г. Коломна 0.013 2.00 • Ю-2
Фракция НМ
д. Барсуки 1 0.012 1.98 • Ю-2
2 0.011 2.05 • Ю-*
3 0.008 2.18 • Ю-*
г. Воскресенск (верх) 1 0.028 1.62 • Ю-2
2 0.026 1.72- 10"2
3 0.015 1.71 • 10"*
г. Воскресенск (низ) 1 0.030 1.60- 10"2
2 0.024 1.80- 10"2
3 0.019 2.00 • Ю-*
г. Коломна 1 0.010 2.20 • Ю-2
2 0.007 2.85- 10"2
3 0.006 3.10- ю-*
Фракция КОВ
д. Барсуки 1 0.028 1.43 • Ю-2
2 0.030 1.36- 10"2
3 0.037 1.13- 10"2
г. Воскресенск (верх) 1 0.040 1.37 • Ю-2
2 0.042 1.32 • Ю-*
3 0.040 1.37- 10"2
г. Воскресенск (низ) 1 0.054 1.16- 10"2
2 0.046 1.36- 10-*
3 0.049 1.23- 10"2
г. Коломна 1 0.016 2.00 • Ю-2
2 0.020 1.83 • Ю-*
3 0.020 1.55- 10"2
различным размером частиц при возбуждении на и 355 нм
• фракция КОВ: Ф = (1.43±0.25)- 1СГ2 (приблизительно на 20% меньше, чем у фракции РОВ).
НМ фракция РОВ имеет большие значения квантового выхода по сравнению с коллоидной фракцией, что коррелирует с соответствующими результатами, полученными при изучении флуоресценции фракций фульвовых кислот [11]. По данным работы [11], у фульвовых кислот, входящих в состав РОВ, при возбуждении на длине волны 337 нм низкомолекулярные компоненты обладают в два раза более высокими квантовыми выходами флуоресценции по сравнению с высокомолекулярными.
Рассчитанные нами значения квантового выхода по порядку величины находятся в хорошем согласии с подобными значениями для фракций РОВ, полученных в работе [12] методом тангенциальной ультрафильтрации, при возбуждении на длине волны 313 нм. Сопоставление данных для всех представленных проб и невысокая погрешность (менее 20%) рассчитанных средних значений позволяет сделать вывод о высокой чувствительности используемого метода и его приемлемости для дальнейших более детальных исследований наночастиц РОВ.
Заключение
При возбуждении светом с длиной волны Л = 310 нм для всех фракций РОВ наблюдается «синий» сдвиг максимума флуоресценции относительно соответствующих максимумов при возбуждении на Л = 270 нм и Л = 355 нм. Наблюдается сдвиг максимума флуоресценции КОВ в более длинноволновую область спектра на 5-12 нм относительно максимума флуоресценции низкомолекулярных фракций.
Проведен расчет абсолютных значений квантового выхода флуоресценции Ф (под которым мы понимаем квантовый выход флуоресценции суммы компонентов РОВ или его фракции). Для фракций
РОВ значение Ф лежит в диапазоне от 1.1-10 2 до 3.1 • 10^2 при возбуждении на 355 нм. У гуми-новых кислот значение Ф составило 2.5- 10^3. На-ночаетицы РОВ большего размера имеют меньший квантовый выход флуоресценции. При возбуждении на Л = 355 нм квантовый выход флуоресценции КОВ уменьшается на 20% в сравнении с квантовым выходом исходного РОВ, в то время как соответствующее значение квантового выхода для низкомолекулярных фракций увеличивается на 20%.
Авторы выражают благодарность сотруднику химического факультета МГУ В. И. Бекетову за предоставленные растворы сульфата хинина.
Литература
1. Leenher J., Сгоиё J. 11 Environmental Science & Technology. 2003. January. P. 19.
2. Пацаева С.В., Фадеев В.В., Южаков В.И. и др. // Вестн. Моск. ун-та. Физ. Астрон. 1992. № 5. С. 38.
3. Пацаева С.В., Фадеев Е.М., Южаков В.И. и др. // Вестн. Моск. ун-та. Физ. Астрон. 1991. № 6. С. 71.
4. Пацаева С.В., Филиппова Е.М., Южаков В.И. и др. // Вестн. Моск. ун-та. Физ. Астрон. 1991. № 4. С. 76.
5. Милюков А.С., Горшкова О.М., Пацаева C.B., Южаков В.И. // Всеросс. научн. конф. студентов-физиков и молодых ученых ВНКСФ-12. Секция «Биофизика». Новосибирск, 2006. С. 534.
6. Parlanti Е., Worz К., Geoffroy L., Lamotte M. Ц Org. Geochem. 2000. P. 1765.
7. De Souza Sierra MM., Donard O.F.X., Lamotte M. et al. // Marine Chemistry. 1994. P. 127.
8. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. M., 1986.
9. Velapoldi R.A., Mielenz K.D. Standard Reference Materials: a fluorescence standard reference material: quinine sulfate dehydrate. National Bureau of Standards, January 1980.
10. Южаков В.И. Ц Успехи химии. 1979. 48, № 11. С. 2007.
11. Першина И.В., Вермул В.М., Аброскин А.Г. и др. // Вестн. Моск. ун-та. Химия. 1989. № 4. С. 368.
12. Belin С., Quellec С., Lamotte M. et al. 11 Environmental Technology. 1993. 14. P. 1131.
Поступила в редакцию 22.11.06
