CC BY
26Фгзика живого, Т. 21, No1-2, 2014.С.24-28. © Чиста С.В., Корнелюк О.1.
УДК577.152.611
ФЛУОРЕСЦЕНЦ1Я I ДИНАМ1КА М1КРООТОЧЕННЯ ТРИПТОФАНОВИХ ЗАЛИШК1В
EBKAPIOTHOÏ ТИРОЗИЛ-тРНК СИНТЕТАЗИ
Чиста С.В., Корнелюк O.I.
1нститут молекулярноХ бгологИ'i генетики НАН Украти e-mail: chistayasofiia@gmail. com
Надшшла до редакци 23.06.2014
Методом флуоресцентно! спектроскот! дослщжена внутршньомолекулярна динамка N-кiнцевого каталггичного модуля (мiнi-TyrRS) тирозил-тРНК синтетази в розчинi. На основi даних флуоресцентно! спекгроскопi! та комп'ютерного моделювання охарактеризовано мжрооточення залишюв триптофану та ступiнь доступностi поверхш Тгр40, Тгр87 i Тгр283 молекулам розчинника. Швидку конформацiйну динамжу мшьТугИБ в наносекундному часовому iнтервалi визначено за допомогою гасiння флуоресценцi! мш-ТугИБ нейтральним гасником акриламщом, iонами I" та Cs+.
Ключое1 слова: Mim-TyrRS, флуоресценщя, динамка бшка.
ВСТУП
Тирозил-тРНК синетаза (TyrRS) ссавцiв складаеться з двох структурних модул1в: N-шнцевого каталггичного (мЫ-TyrRS) i С-юнцгвого некаталпичного [1]. N-шнцевий модуль (бiля 360 а. з.) в1дповщае вкороченй форм1 фермешу Мг 2 х 39 кДа, йому пригаманна повна ферментативна активнсть в експериментах in vitro [2]. Зпдно з сучасними уявленнями, функцюнальн властивосп ферменпв можуть бути адекватно описан з точки зору кньо! динамки в розчим. Механзм дй' ферменпв визначаеться ix здатнстю до флуктуацш конформавд макромолекули, скоректованих у час! Отже, для розумшня i побудови механзму функцюнування ARS необхщн вивчення i опис к динашчних властивостей у розчим. Розробка ще! проблеми особливо актуальна для ARS еукарют, у котрих останн схож1 за сво'ми структурою i властивостями з ARS людського органiзму. TyrRS B. taurus виявляе спорiдненiсть до високомолекулярних РНК [3-5] аналогiчно багатьом шшим ARS ссавцiв. Важливо пiдкреслити, що протеолпично модифкована функцiонально-активна форма мiнi-TyrRS B. taurus також частково зберегкае РНК-зв'язуючу здатнсть [2], однак ii' активнiсть, на вiдмiну вiд основно! форми ензиму, не iнгiбуеться рибосомальною РНК [4]. Вiдповiдно сучасним уявленням впiзнавання тРНК ARS е динашчним процгсом, пiд час якого, як правило, ввдбуваеться конформац1йна адаптацiя партнерш комплексу з
наступним утворенням продукту реаквд -амшоацил-тРНК [1, 5].
Одним i3 найбтьш шформативних методш дослгдження конформацiйних особливостей i внутршньомолекулярно! динамiки бiлкiв е флуоресцентна спектроскогаях [6-8]. Власна флуорeсцeнцiя бiлкiв обумовлена, в основному, залишками трипюфану, як е своервдними зондами в просторовш структурi бiлка. Завдяки цим зондам можна отримати шформащю про властивосп мкрооточення флуорофора, про динамку бтка в розчинi, здшсниги монпоринг конформащйних змш бiлка, як мають функцюнальне значення.
Для дослвдження конформащйних змш мшг-TyrRS в розчин, в данй робот охарактеризована власна флуоресценцш цього бiлка i проаналiзована його внутршньомолекулярна динамка методами флуоресцентно! спектроскопа, також проведений аналiз властивостей мкрооточення i особливостей локалiзацii триптофанових залишюв,
ввдповвдальних за власну флуорeсцeнuiю мiнi-TyrRS.
МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ
Об'ект дослвджень - N-модуль тирозил-тРНК синтетази - був експресований у клiтинах Escherichia coli i очищений до гомогенного стану (~95%) за допомогою металхелатуючо! хроматэграфц згщно [9].
Спектри флуоресценвд реестрували на спeктрофлуоримeтрi Hitachi M850 (Японя), який був обладнаний термостатованим
кюветотримачем. Температуру у кювет! визначали з точнстю ±0,2°С. Вимiрювання проводили у
ФЛУО РЕС ЦЕНЦ1Я I ДИ НАМ1КА М1КРО ОТОЧЕНН Я ТРИПТОФАНОВИХ ЗАЛИШК1В ЕВКАРЮ ТНО1 ТИРОЗИЛ-тРНК СИНТЕТАЗИ
кварцовiй кювет з довжиною оптичного шляху 0,5 см. Спектральна ширина щiлин для монохроматора збуджуючого свпла та рееструючо! системи становила 5-10 нм. Довжина хвилi збуджуючого свпла дорiвнювала 280 та 296 нм, штврвал довжини хвиль для спектр1в флуоресценвд становив 300-400 нм, реестрацю флуоресценвд проводили пiд кутом 90о до напрямку пучка збуджуючого свила при температурi 25оС. Для зниження впливу випадкових фактор1в спектри визначали не менше трьох раз1в. Ввдтворювашсть спектр1в флуоресценвд по штвнсивносп в максимумi була не меншою 98-99%.
Вимiрювання спектрiв флуоресценвд
К-шнцевого каталпичного модуля TyrRS проводили в 20 мМ трис-HCl, 500 мМ NaCl. Використовуваний буфер перевiряли на ввдсутшсть флуоресцiюючих домшшв, записуючи спектр флуоресценвд Будь-яких домшшв, флуоресцiюючих в дослвджуваному спектральному дiапазонi 300-400 нм, в буферних розчинах не виявлено.
Перед вишрюванням спектрiв флуоресценц)! дослвджуваного бтка записували його спектри поглинання на спектрофотометрi BioMate 5 (Велика Британя) у кварцовiй кювет з довжиною оптичного шляху 1,0 см, об'ем дослвджуваного зразка складав 150-200 мкл. Спектри поглинання записували в УФ-областг Концентрацию бтка визначали спектрофотометричним способом по поглинанню свiтла на довжин хвилi 280 нм з урахуванням довжини оптичного шляху i молярного коефщента екстинкцп бтка (£280 °дуль=77950 М-1см-1).
В експериментах по гасшню трипгофаново! флуоресценц)! мiнi-TyrRS вимiрюванi значення штвнсивносп флуоресценц1! бтка з гасниками корегували на коефiцieнт розведення i екранування додаваних в розчин реагентв [10].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Спектри флуоресценвд мiнi-TyrRS при температур) 25оС i довжинах хвиль збудження 280 та 296 нм представлен на рис. 1. Флуоресценця бтка обумовлена випромгнюванням як трипгофанових, так i тирозинових залишюв при збудженнi в максимум спектра поглинання (280 нм). При збудженн на довжин хвил) 296 нм в спектрi флуоресценвд ферменту присутня т1льки трипгофанова компонента.
В первиннм структур) субодинищ мономеру мшъТутВ^ мютиться три трипгофанових залишки (Trp40, Trp87 i Trp283) (рис. 2), а також п'ятнадцять залишюв тирозину (Tyr39, Tyr52, Tyr79, Tyr96, Tyr97, Tyr123, Tyr129 Tyr134, Tyr166, Tyr176, Tyr198, Tyr204, Tyr289, Tyr292, Tyr341).
if 4
till 2
—I—
—i—
ж
ж
? VTjiri_ ll'J
Рис. 1. Спектри флуоресценцй мiнi-TyrRS при довжинах хвиль збудження 280 нм (1) та 296 нм (2).
Рис. 2. Локатзащя триптофанових залишюв в просторовш структур) димеру мш-ТугИБ B. taurus.
Форма спектр)в флуоресценвд окремих триптофанових залишкiв залежить в)д полярност !х мiкроот°чення i його здатност релаксувати за час життя збудженого стану трипгофашвого залишку. Необхiдно враховувати, що полярность мжрооточення трипгофанового залишку
визначаеться не тльки його доступистю для молекул розчинника, але i власними полярними трупами бглка, як) входять до складу мжрооточення В робот) в)зуал)зовано i проанал)зовано оточення залишшв Trp40, Trp87 i Trp283 мiнi-TyrRS в сфер) з рад)усом 5 А (в центр) яко! в)дповщно розмщеш щ залишки) за допомогою програми PyMOL 1.3 (рис. 3). Обчислювальний анал)з показав, що в заданй област навколо Trp40 знаходиться 9 амгнокислотних залишюв: 5 пдрофобних (Val38, Tyr39, Ile71, Leu72, Phe183), 2 гвдрофтьних (Thr42, Thr70) та 2 нейтральних (Gly41, Gly184); 8 залишкв в оточенш Trp87: 5 пдрофобних (Tyr79, Ala85, Leu89, Leu90, Leu131), 2 негативно заряджених залишки (Glu88, Glu91) та нейтральний Pro86; 8 залишюв в оточенш Trp283: 3 позитивно заряджених залишки (Arg279, Lys282, His305), 3 негативно заряджених залишки (Asp280, Glu281, Asp308), та 2 нейтральних (Gly284, Gly285). Звичайно приймаеться, що флуоресцентш
Чиста С.В., Корнелюк О.1.
характеристики триптофанових залишюв залежать в1д к доступности для розчинника. Доступнють триптофанових залишюв для молекул розчинника залежить не тальки в1д щ!льносп упаковки м!крооточення триптофанового залишку, але також в1д його локалтзац!' в макромолекул! бглка. Доступнсть триптофанового залишку залежить ввд того, розташований в!н в центр! макромолекули б!лка чи на И перифер!!. В!дпов1дно до нашого анал!зу, триптофанов! залишки мiнi-TyrRS частково доступн! розчиннику. Проведений розрахунок експонованост! залишкiв Тгр40, Тгр87 i Тгр283 в К-юнцевому каталпичному модул1 ТутВ^ за допомогою веб-серверу GetArea (http://curie.utmb. edu/getarea.html). Розрахунок вказуе на 8,8% експоноватстъ Тгр40; 62,1% експонованiсть Тгр87 1 56,6% експонованiстъ Тгр283 в субодинищ А; та на 7,3% експонованють Тгр40, 46,1% експонован1сть Тгр87 1 58,1% експонованють Тгр283 в субодинищ В, що свщчить про асиметричнють субодиниць А 1 В мiнi-TyrRS.
а
Визначено вщстат до найближчих амiнокислотних залишюв (в!д Са в!дпов!дного атома Тгр до Са атома в!дпов!дного залишку), як потрапляють в сфери радiусом 5 А з центром для залишюв Тгр40, Тгр87, Тгр283. Отриманi результати вим1рювань наведено в таблиц 1.
Для дослвдження доступности залишюв Тгр40, Тгр87 i Тгр283 в б!лковш глобул! мiнi-TyrRS ми використовували метод гасшня флуоресценвд бглка зовнинми гасниками (акриламщ, Cs , I-). Визначено, що при додаванш акриламiду або юн!в Cs та I- до розчинв дослiджуваного бглка вiдбуваeтъся гасгння триптофаново! флуоресценвд. Отриманi крив! гас!ння флуоресценвд мiнi-TyrRS акриламвдом, iонами Cs та I- представлен на рис. 3 в вигляд1 залежносп в1дносно! штвнсивносп флуоресценвд 1о/1 в1д концентрац!! гасника (акриламщу, Cs , або I-) (10 та I - гнтенсивносп флуоресценвд за вщсутносп та присутносп гасника, в1дпов!дно).
Рис. 3. Елекгростатичне оточення триптофанових залишюв Тф40 (а), Тгр87 (б), Тф283 (в).
Рис. 4. Графж Штерна-Фольмера гас!ння флуоресценци мш!-ТуЖ8 акриламщом (1), iонами I- (2) та Cs+ (3) при 25 оС.
Константи гасiння флуоресценuii (К^у) мiнi-TyrRS визначенi на основ! нахилу прямо! Штерна-Фольмера, значення К -у становлять: 13.22±0.5 М-1 , 6.26±0.2 М-1, 3.75±0.2 М-1 для акриламвду, I- та Cs+ в!дпов!дно; тод1 як для L-Trp К-у дорiвнююгь: 16.37±0.01 М-1, 12.94±0.01 М-1, 2.87±0.01 М-1. Ефекгивнiсгъ гасгння триптофаново! флуоресценвд мiнi-TyrRS iонами I-, Cs+ та нейтральним акриламвдом в1дносно до гасгння флуоресценвд L-Trp становить 48%, 129%, 80%, ввдповщно.
Внутршт област! 6!лк!в звичайно розглядають як неполярн! Так як, зг!дно наведених вище даних, тгр40 лише на 8,8% експонований молекулам розчинника в структур! б!лка, сл!д оч!кувати, що цей залишок буде майже недоступний гасникам зовн!шньо! воднево! фази. Це припущення
б
в
ФЛУО РЕС ЦЕНЦ1Я I ДИ НАМ1КА М1КРО ОТОЧЕНН Я ТРИПТОФАНОВИХ ЗАЛИШК1В ЕВКАР1О ТНО1 ТИРОЗИЛ-тРНК СИНТЕТАЗИ
перев1рене за допомогою порiвняльного анал1зу гасiння триптофаново! флуоресценцд
дослвджуваного бтка нейтрадьним гасником акридамщом та юнами С8+ та I". Вщомо, що акриламщ гасить переважно експоноваш залишки триптофану, але разом з цим, може проникати 1 в бтков1 матрицу за рахунок !хнк коливань в наносекундному часовому штгрвад! Лiнiйний характер наведених кривих гасшня (рис. 4) сввдчитъ про динам1чний характер гасшня триптофаново!' флуоресценцд. Динам1чне гасшня флуоресценцд визначаеться частотою зпкненя м1ж флуорофором та гасником. Для пояснення тако! дифуз^ можна припустити, що бткова матрица флуктуюе в наносекундному часовому д1апазон1, таким чином, щоб забезпечити проникнення молекули гасника до флуорофора.
Отримаш дан по гасшню флуоресценц)! мшь TyrRS сввдчать про те, що триптофанов1 залишки доступн для всiх трьох гасникш, що також пiдтверджуеться комп'ютерним аналiзом площ1
достопно! поверхм. Покращену ефективнють гасiння триптофаново! флуоресценвд мiнi"TyrRS юнами С8+ порiвняно з iонами I" можна пояснити негативно зарядженим оточенням деяких триптофанових задишкiв в структурi бiдка, що може притягувати катюнн i вiдштовхувати анiоннi гасники. Це припущення пiдтверджуе наш обчислювадьний аналiз даних, який показуе, що мкрооточення як мшмум з двох залишюв Тгр мiстить електронегативнi залишки в оточеннг Тгр87 (Glu88, Glu91) i Тгр283 (Asp280, Glu281, Asp308). Цкаво, що залишки в статичнiй структурi бiдка щiдьно упакованi, однак вщносна ефективнiсть гасiння акриламiду висока, i становить 80%. Величина вiдносно! ефективност гасiння флуоресценц)! свiдчить про здатнють молекул акриламiду проникати глибоко в структуру бтка, що може бути результатом досить великого динамiчного коливання структури мшъ TyrRS.
Таблиця 1
Вщсташ вiд Trp40, Trp87 i Trp283 до найближчих амiнокислотних залишюв
Залишок, до якого вимрювалася ввдстань ввд Trp40 Вщстань м1ж атомами, A Залишок, до якого вимрювалася ввдстань ввд Trp87 Ввдстань м1ж атомами, A Залишок, до якого вимрювалася ввдстань ввд Trp283 Ввдстань м1ж атомами, A
Val38 6,9 Tyr79 7,6 Arg279 6,3
Tyr39 3,8 Ala85 6,2 Asp280 5,0
Gly41 3,8 Pro86 3,7 Glu281 5,1
Thr42 6,7 Glu88 3,8 Lys282 3,8
Thr70 6,6 Leu89 5,7 Gly284 3,8
Ile71 5,1 Leu90 5,5 Gly285 5,8
Leu72 6,2 Glu91 6,7 His305 9,4
Phe183 5,3 Leu131 25,9 Asp308 10,2
Gly184 6,4
ВИСНОВКИ
Проведено комп'ютерний анадiз локального оточення флуорофорш: Тгр40, Тгр87, Тгр283 в структурнй моделi тирозил-тРНК синтетази. Розрахунок експонованосп триптофанових задишкiв вказуе на екранований характер Тгр40 (8,8% експоновашсть), та експонований характер Тгр87 (62,1%), та Тгр283 (56,6%). Проведено дослвдження гасiння триптофаново! флуоресценцд тирозил-тРНК синтетази iонами С8 , I" та нейтральним гасником акриламiдом. Константи Штерна-Фольмера для мшь TyrRS становлять 3,75±0,2 М-1, 6,26±0,2 М-1, 13,22±0,5 М-1 у випадку гасiння iонами С8+, I- та акриламщу, в)дповщно. Аналiз отриманих даних сввдчитъ про те, що вс1 три трипroфановi задишки
гасяться ус1ма гасниками. Висока eфeктивнiсть гасшня екранованого залишку Trp40 сввдчить про дифузда гасника кр!зь бткову матрицю завдяки флуктуацiям бiлка в наносекундному часовому штервалг
ПОДЯКА
Автори висловлюють подяку Драгану А.1. за обговорення результата.
Лiтература
1. Корнелюк А.И. Структурно-функциональное исследование тирозил-тРНК синтетазы
млекопитающих // Biopolym. Cell. - 1998. - Т. 14, № 4. - С. 349-359.
Чиста С.В., Корнелюк О.1.
2. Гнатенко Д.В., Корнелюк А.И., Курочкин И.В., Рибкинска Т.А.; Мацука ГХ.Выделение и характеристика функционально активной протеолитически модифицированной формы тирозил-тРНК синтетазы з печени быка // Укр. биохим. журн. - 1991. - Т. 63, № 4 - С. 61-67.
3. Корнелюк А.И., КурочкинИ.В.,МацукаГ.Х. Тирозил -тРНК синтетаза из печени быка. Выделение и физико-химические свойства // Мол. биол. - 1988. - Т. 22, №.1 - С. 176-186.
4. Гнатенко Д.В., Корнелюк А.И., Курочкин И.В., Рыбкинская Т.А., Мацука ГХ.Выделение и характеристика функционально активной протеолитически модифицированной формы тирозил-тРНК синтетазы з печени быка // Укр. биохим. журн. - 1991. - Т. 63, №.4 - С. 61-67.
5. Курочкин И.В., Корнелюк А.И., Мацука Г.Х. Взаимодействие еукариотической тирозил-тРНК синтетазы с высокомолекулярными тРНК // Мол. биол. - 1991. - Т. 25, №.3 - С. 779-785.
6. Francklyn C., Perona J.J., Puetz J., Hou Y.M. Aminoacyl-tRNA synthetases: versatile players in the changing theater of translation // RNA. - 2002. - Vol. 8, № 11. - P. 1363-1372.
7. ДемченкоА.П. Люминесценция и динамика белков. -Киев: Наукова думка, - 1988. - 418 с.
8. Демченко А.П. Равновесная внутримолекулярная подвижность в белках // Укр. биохимич. журн. -1981. - 53, №4. - C. 114-128.
9. Демченко О.П., Воловик З.М. Внутршньомолекулярна динамка i функщя бшкв // Вюник АН УРСР. - 1988. - №2. - C. 34-41.
10. Дубровский А.Л., Савинская Л.А., Корнелюк А.И. Клонирование и бактериальная экспрессия цитокинпо добного некаталитич еского домена бычьей тирозил-тРНК синтетазы // Biopolym. Cell. - 1998. -Т. 14, № 5. - С. 449-452.
11. Favicchio R., Dragan A., Kneale G, Read C. Fluorescence spectroscopy and Anisotropy in the Analysis of DNA-Protein interaction // Methods in Molecular Biology. - 2009. - Vol. 543. - P. 589-611.
FLUORESCENCE AND DYNAMICS OF THE MICROENVIRONMENT OF TRYPTOPHAN RESIDUES OF EUKARYOTIC TYROSYL-tRNA SYNTHETASE
Chysta S.V., A.I Kornelyuk
The intramolecular dynamics of N-terminal catalytic module (mini-TyrRS) tyrosyl-tRNA synthetase in solution was studied using the methods of fluorescence spectroscopy. The microenvironment of tryptophan residues and accessibility of Trp40, Trp87 and Trp283 has been characterized using the fluorescence spectroscopy and computer analysis. The rapid conformational dynamics of mini-TyrRS in nanosecond time scale is revealed using the fluorescence quenching with neutral quencher acrylamide, I- and Cs+ ions.
Key words: mini-TyrRS, fluorescence, protein dynamics.
ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ И ДИНАМИКА МИКРООКРУЖЕНИЯ ТРИПТОФ АНОВЫХ ОСТАТКОВ ЭВКАРИОТНОЙ ТИРОЗИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ
Чиста С.В., Корнелюк А.И.
Методом флуоресцентной спектроскопии изучена внутримолекулярная динамика N-концевого каталитического модуля (мини-TyrRS) тирозил-тРНК синтетазы в растворе. На основании данных флуоресцентной спектроскопии и компьютерного моделирования охарактеризовано микроокружение остатков триптофана и степень доступности поверхности Trp40, Trp87 i Trp283 молекулам растворителя. Быстрая ¡информационная динамика мини-TyrRS в наносекундном временном интервале определена с помощью тушения флуоресценции мини-TyrRS нейтральным тушителем акриламидом, ионами I- и Cs+.
Ключевые слова: мини-TyrRS, флуоресценция, динамика белка.
