CC BY
47
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КРАСНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА ММТ1
Фадеев В.В.1, Банишев A.A.1, Вржещ Е.П.2, Вржещ П.В.2, Дмитриенко Д.В.2, Маслов Д.В1, Ширшин Е.А.1
1 Физический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, E-mail: fadeev&Jid.phys.msu.su 2 Международный учебно-научный биотехнологический центр МГУ, E-mail: biocentr(a>,list.m
For investigating of the mrfpl-protein, the complex of methods of fluorescence and absorption spectroscopy has been used. The comparative analysis of measured characteristics has been carried out. A hypothesis on the mechanism of fluorescence response formation at different regimes of excitation has been proposed.
Белки из семейства флуоресцентных привлекают внимание благодаря наличию окраски и флуоресценции, что позволяет использовать их для решения проблемы визуализации процессов, происходящих в живых биологических системах. Отличительным свойством белков этого семейства является наличие флуорофора - фрагмента белковой цепи, отвечающего за окраску и флуоресценцию в видимом диапазоне. Флуоресцентные белки как объект изучения в настоящее время очень популярны, поскольку на их основе создают сенсоры, датчики и таймеры для биологических систем. Многие исследователи методами сайт-направленного и случайного мутагенеза генов ведут работы по получению новых флуоресцентных белков с целью улучшения их свойств: изменение окраски, увеличение квантового выхода, коэффициента экстинкции, фото- и рН-стабильности и т.д.
Одной из задач, которую решают исследователи, являются поиски новых модификаций белков, которые, при сохранении биохимических свойств, обладали бы более высокой удельной яркостью флуоресценции (т.е. более высоким значением сечения флуоресценции Gfl=Gabs*T|fi, где <^abs - сечение поглощения, г|я -квантовый выход флуоресценции), но отсутствуют литературные данные о механизме возникновения флуоресценции и нет четкой схемы процессов, проходящих в таких белках.
В данной работе впервые к исследованию белков вообще и белка mRFPl в частности, применен комплекс методов классической и лазерной спектроскопии:
- измерение спектров поглощения на спектрофотометре Сагу 100 и определение из них сечений поглощения флуорофора;
- измерение спектров флуоресценции (на спектрофлуориметре Сагу Eclipse и на лазерном флуориметре) и определение из них квантового выхода флуоресценции Пя;
- измерение спектров возбуждения флуоресценции на спектрофлуориметре Сагу Eclipse;
- измерение на наносекундном лазерном флуорометре кривых насыщения и кинетики флуоресценции; определение из них фотофизических параметров aabs, т и Kst, отнесенных к истинному флуорофору (при этом не требуется знание концентрации флуорофора); т - время жизни возбужденного состояния, Kst -скорость интеркомбинационной конверсии;
- измерение т на традиционном пикосекундном лазерном флуорометре.
Выполнен сравнительный анализ полученных характеристик; сформулированы гипотезы о механизмах формирования флуоресцентного отклика красного белка mRFPl при его возбуждении излучением с разными временными и энергетическими характеристиками.
Развитая в работе техника комплексного флуоресцентного анализа будет применена в исследованиях мутантов данного и других белков.
