CC BY
65
№ 3 - 2014 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 577.112.824:57.083.34
ФЛУОРЕСЦЕНТНОЕ МЕЧЕНИЕ ГОМОЦИСТЕИНИЛИРОВАННОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА
А. И. Чертенков
ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава
России (г. Новосибирск)
Содержание гомоцистеина в плазме крови является важным физиологическим параметром, и его повышение относительно нормы может указывать на развитие заболевания. Наиболее актуально определение гомоцистеина для диагностики сердечно-сосудистых и некоторых онкологических заболеваний. Известно, что гомоцистеинилированные белки образуются при повышении уровня гомоцистеина и могут служить индукторами онкологических процессов. В данной работе предлагается методика получения чувствительного флуоресцентного зонда из сывороточного альбумина человека, модифицированного in vitro тиолактоном гомоцистеина. Такой зонд может быть использован для диагностики новообразований на ранней стадии заболевания.
Ключевые слова: сывороточный альбумин человека, тиолактон гомоцистеина, флуоресцентный зонд.
Чертенков Александр Игоревич — студент 2-го курса лечебного факультета ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: t.o.c.h.c.a.r.u@yandex.ru
Введение. В организмах животных, в том числе человека, подавляющее число процессов метилирования осуществляется 5-аденозилметионином с образованием 5 -аденозилгомоцистеина [1]. Последний гидролизуется ферментом аденозилгомоцистеиназой до аденозина и гомоцистеина. Активность гомоцистеина, как правило, опосредована через его естественные метаболиты. Ниже (рис. 1) приведена краткая схема метаболизма гомоцистеина.
Рис. 1. Схема метаболизма гомоцистеина в организме человека (^у — гомоцистеин)
Концентрация гомоцистеина в плазме крови является важным физиологическим параметром и отклонение ее от нормы (выше 15 мкмоль/л) свидетельствует о риске развития заболевания или об уже наступившей необходимости принимать меры по излечению. Со стороны центральной нервной системы повышенный уровень гомоцистеина — фактор риска по нейродегенеративным расстройствам (деменция, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, шизофрения и т.д.). Во время беременности повышенные уровни гомоцистеина могут быть причиной таких осложнений, как спонтанные аборты, преэклампсия и эклампсия, венозная тромбоэмболия.
В настоящее время определение гомоцистеина наиболее актуально для диагностики сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний.
Повышение концентрации гомоцистеина цитоксично в силу его превращения в реакционноспособный тиолактон гомоцистеина. Тиолактон гомоцистеина является ацилирующим агентом и при нормальных условиях предпочтительнее реагирует с e-аминогруппой бокового радикала лизина [2], в результате чего образуются N -гомоцистеинилированные белки (рис. 2).
Рис. 2. ^гомоцистеинилирование белка в организме (^^у-белок) [2]
N-Hcy-белки могут служить индукторами онкологических процессов [2]. Для диагностики новообразований на ранней стадии заболевания необходима разработка высокочувствительных молекулярных зондов. Одним из таких является N-Hcy-белок, содержащий флуоресцентную метку, что позволит не только визуализировать в живом организме места скопления определенных белков в новообразованиях, но и оценивать активность протекающих в них процессов. В качестве белка нами был выбран сывороточный альбумин человека из-за его небольшой молярной массы 66,5 кДа и доступности. Немаловажно, что в крови человека около 55 % всех белков представлено альбумином, и его концентрация в норме довольно высокая — около 40 г/л [1].
Материалы и методы. В работе использовали центрифугу, шейкер и термостат фирмы «Eppendorf»; весы аналитические ВЛР-200 (Россия). Свободный от глобулинов и жирных кислот человеческий сывороточный альбумин, 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная) кислота, ацетамид тиолактона гомоцистеина, малеимид флуоресцеина были фирмы «Merck» (Германия). Диализные мешки с размером пор 6-8 кДа фирмы «Биолот» (Россия), Сефадекс CBB G-250 («ДиаМ», Россия), EDTA «Alfa Aesar» (США), Трис-HCl («Fluka», Швейцария), SDS, бромфеноловый синий («Serva», Германия). Другие реактивы были отечественного производства степени чистоты о.с.ч. Для измерения рН использовали рН-метр N-5170 (Польша). Концентрирование белковых образцов проводили на вакуумном ротационном испарителе «SpeedVac» («Thermo Fisher Scientific Inc.», США) при 30 °С. Регистрацию электронных спектров поглощения и измерение оптической плотности растворов проводили на спектрофотометре «Shimadzu» UV-2100 («Shimadzu», Япония). Значение молярного коэффициента поглощения препаратов альбумина принимали равным £294 = 44400 М"1см"1, À = 294 нм.
На первом этапе нашей работы проводили гомоцистеинилирование альбумина in vitro (рис. 2, последняя стадия) путем инкубации его раствора с концентрацией 4 мг/мл в 0,5 М фосфатном буфере (рН 8,0), содержащем 1 мМ NaN3, 1 мМ EDTA и 0,05 М раствор тиолактона гомоцистеина согласно [3].
Аналогичный раствор инкубировали в тех же условиях, но без добавления ацилирующего агента и использовали его как контроль. Инкубацию проводили при температуре 37 °С в течение 36 ч. На протяжении этого времени проводился отбор проб из реакционной смеси с целью контроля наличия свободных SH-групп в белке с помощью реактива Эллмана [4]. После инкубации белки из реакционной смеси и контроля очищали диализом. Затем образцы контрольного и гомоцистеинилированного альбуминов раскапывали по пробиркам порциями по 200 мкл, упаривали досуха на вакуумной центрифуге при 30 °С и хранили при -20 °С.
На следующем этапе проводили введение остатка флуоресциина в N -гомоцистеинилированный альбумин. Реакцию осуществляли путем инкубации раствора N -гомоцистеинилированного альбумина с концентрацией 1 мг/мл в 0,5 М фосфатном буфере (рН 7,8) с 3-кратным избытком малеимида флуоресцеина. Инкубацию проводили в темноте при температуре 37 °С в течение 12 ч. Аналогичный раствор инкубировали в тех же условиях, но без добавления малеимидного агента и использовали его как контроль. В течение этого времени проводился отбор проб из реакционной смеси с целью контроля изменения количества свободных SH-групп в белке с помощью реактива Эллмана. После инкубации опытный образец и контроль очищали диализом. Затем препараты контрольного и меченого флуоресцеином альбуминов раскапывали по пробиркам порциями по 200 мкл, упаривали досуха на вакуумной центрифуге при 30 °С и хранили при -20 °С.
Результаты исследования и их обсуждение. При анализе растворов модифицированного гомоцистеином альбумина с помощью реактива Эллмана было обнаружено, что полученный препарат белка содержал на две SH-группы больше, чем немодифицированный альбумин (контроль), в котором изначально содержалась всего одна свободная SH-группа. Это свидетельствует о введении 2-х остатков гомоцистеина в молекулу белка.
На ковалентное присоединение флуоресцентной метки к альбумину указывают данные электронной спектроскопии (рис. 3). Флуоресцеин — ароматическое соединение, содержащее хромофорную группу, ответственную за поглощение на длине волны 495 нм.
Flu-MCA
250 300 350 d00 450 500 550
длина волны, нм
Рис. 3. УФ-спектр N-Нсу-альбумина с ковалентно связанным флуоресцеином (Fly-ЧСА, флуоресцеинсодержащий человеческий сывороточный альбумин, сплошная линия [5]; немодифицированный альбумин — пунктирная линия; А — оптическая плотность
раствора, о.е./мл)
Из анализа спектров модифицированного и немодифицированного альбумина, представленного на рис. 3, можно сделать вывод, что нами получен белок, содержащий в своей структуре остаток флуоресцеина, так как в контрольном препарате немодифицированного альбумина отсутствует поглощение в области 400-550 нм. Таким образом, разработана методика введения in vitro гомоцистеина в альбумин человека — диагностически значимый сывороточный белок, а также получен N-Нсу-альбумин человека, содержащий флуоресцентную метку, способный служить зондом для изучения патологических процессов, в том числе, опухолевых.
Автор выражает благодарность научным руководителям: д-ру хим. наук, доценту
Т. С. Годовиковой (главный научный сотрудник лаб. модификации биополимеров ФГБУН
«Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН) за руководство
экспериментом; д-ру биол. наук, доценту кафедры медицинской химии ГБОУ ВПО НГМУ
0. И. Гимаутдиновой за помощь в работе с научной литературой и написании статьи.
Список литературы
1. Северин Е. С. Биохимия / Е. С. Северин. — М. : Гэотар-Медиа, 2005. — 779 с.
2. Medina M. A. Roles of homocysteine in cell metabolism. Old and new functions (Review article) / М. А. Medina, J. L. Urdíales, M. I. Amores-Sánchez // Eur. J. Biochem. — 2001.
3. Jakubowsky H. Pathophysiological consequences of homocysteine excess / Н. Jakubowsky // J. Nutr. — 2006. — Vol. 136. — P. 1741S—1749S.
4. Janatova J. The heterogeneity of bovine albumin with respect to sulfhydryl and dimer content / J. Janatova, J. K. Fuller, M. J. Hunter // J. Biol. Chem. — 1968. — Vol. 243. — P. 3612-3622.
5. Чертенков А. И. Введение флуоресцентной метки в N-гомоцистеинилированный человеческий сывороточный альбумин / А. И. Чертенков // Сб. тезисов V Всероссийской конф. обучающихся «Национальное достояние России» НС «Интеграция». — М. : Ноосфера. 2011.
FLUORESCENT MARKING OF HUMAN HOMOCYSTEINING ALBUMIN
A. I. Chertenkov
SBEIHPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health» (c. Novosibirsk)
The contents homocysteine in blood plasma is important physiological parameter, and its rising over the norm can indicate disease development. Definition homocysteine is most actual for diagnostics of cardiovascular and some oncologic diseases. It is known that homocysteining proteins are formed at rising of homocysteine level and can serve as inductors of oncologic processes. The technique of receiving a sensitive fluorescent probe from human seralbumin modified in vitro with thiolactone homocysteine is offered in the presented research. Such probe can be used for diagnostics of neoplasms at an early stage of a disease.
Keywords: seralbumin of the human, thiolactone of homocysteine, fluorescent probe.
About authors:
Chertenkov Alexander Igorevich — student of the 2nd course at SBEI HPE «Novosibirsk
State Medical University of Ministry of Health», e-mail: t.o.c.h.c.a.r.u@yandex.ru
List of the Literature:
1. Severin E. S. Biochemistry / E. S. Severin. — M.: Geotar-media, 2005. — 779 P.
2. Medina M. A. Roles of homocysteine in cell metabolism. Old and new functions (Review article) / M. A. Medina, J. L. Urdiales, M. I. Amores-Sánchez // Eur. J. Biochem. — 2001.
3. Jakubowsky H. Pathophysiological consequences of homocysteine excess / H. Jakubowsky // J. Nutr. — 2006. — Vol. 136. — P. 1741S—1749S.
4. Janatova J. The heterogeneity of bovine albumin with respect to sulfhydryl and dimer content / J. Janatova, J. K. Fuller, M. J. Hunter // J. Biol. Chem. — 1968. — Vol. 243. — P. 3612-3622.
5. Chertenkov A. I. Introduction of fluorescent tag in N- homocysteining human seralbumin / A. I. Chertenkov // Theses of the V All-Russian conf. of students «National property of Russia» SC «Integration». — M.: Noosphere. 2011.
