CC BY
34
НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ Серия Медицина. Фармация. 2012. № 22 (141). Выпуск 20/2 65
УДК 616.34:616.22
ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ 1№1Ти ГИБРИДИЗАЦИЯ В РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ РЕЦИДИВА РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ В ПЕРВЫЕ 12 МЕСЯЦЕВ ПОСЛЕ ТРАНСУРЕТРАЛЬНОЙ РЕЗЕКЦИИ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ У ЛИЦ СТАРЧЕСКОГО И ПОЖИЛОГО ВОЗРАСТА
Г.Д. РЫ9КДК A.C. ПУШКИН
Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗОРАМН
e-mail: pushkindoc@mail.ru
В статье изложены результаты опыта применения методики флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) в ранней диагностике рецидивов поверхностного рака мочевого пузыря у 103 пациентов среднего, пожилого и старческого возраста, перенёсших трансуретральную резекцию мочевого пузыря.
Ключевые слова: гериатрия, рак мочевого пузыря, флуоресцентная in situ гибридизация, трансуретральная резекция, пожилой и старческий возраст.
Во многих развитых странах за последнее время значительно возросла численность пожилого населения. В результате сокращения рождаемости и увеличения продолжительности жизни население все большего числа стран будет стремительно стареть. В период с 2005 по 2050 годы половина прироста численности населения в мире будет являться результатом роста численности населения в возрасте старше 6о лет. Таким образом, население в возрасте старше 6о лет увеличится практически в два раза (с 245 миллионов человек в 2005 году до 406 миллионов в 2050 году). Например, в Российской Федерации в 2000 г. в возрасте старше 65 лет было около 18 миллионов человек, а в 2020 г., по прогнозам, их будет уже 21 миллион человек [1]. В Германии на 82 миллиона населения приходится 17% людей в возрасте старше 6о лет, а к 2020 г. их численность повысится до 22% от ожидаемой общей численности населения. В США к 2020 г. ожидается увеличение численности людей старших возрастных групп на 5 миллионов человек [2].
В структуре онкологических заболеваний населения России рак мочевого пузыря (РМП) занимает 8-е место среди мужчин и 18-е место среди женщин. Ежегодно в России регистрируется 11267 больных с впервые выявленным диагнозом РМП [3]. РМП занимает седьмое место в мире среди общего количества онкологических заболеваний [4] и четвёртое среди общего количества злокачественных новообразований, диагностируемых у мужчин в Соединённых Штатах и европейских странах [5]. Опухоли мочевого пузыря превалируют среди новообразований мочевого тракта и составляют 70% от их числа. Около 8о% пациентов относятся к возрастной группе 50-80 лет, а пик заболеваемости приходится на 7-е десятилетие жизни. Уровень смертности от этого заболевания во многих индустриально развитых странах составляет от 3% до 8,5% [6].
Лечение поверхностного РМП начинают с трансуретральной резекции (ТУР) мочевого пузыря (за исключением больных с тотальным поражением мочевого пузыря, им показана цистэкто-мия). В 40-80% случаев после ТУР в течение 6-12 месяцев развивается рецидив, а у 10-25% больных инвазивный рак. После ТУР мочевого пузыря пациентам рекомендуется проходить динамическое наблюдение, включающее ряд регулярных диагностических исследований, в том числе: цистоско-пическое исследование с цитологическим анализом мочи, ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза в первые 2 года 1 раз в 3 месяца [7].
Генетические нарушения появляются уже на начальных стадиях развития опухоли и являются основными определяющими факторами малигнизации. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) является цитогенетической технологией, которая используется для анализа хромосомных нарушений в исследуемых клетках. FISH использует флуоресцентные метки в исследовании ДНК, которые крепятся к центромерам хромосом или уникальным участкам для обнаружения клетки с числовыми, структурными нарушениями, показательными для злокачественного развития [8]. В настоящее время становится широко популярна FISH-методика с высокой чувствительностью и специфичностью для обнаружения РМП, использующая четыре флуоресцентные метки, выявляющие цитогенетические транслокации в хромосомах 17, 3 и 7 и локус-специфический ген 9р21 - ген из семейства опухолевых супрессоров, в 9-й хромосоме [9, ю, и].
В приказе Минздравсоцразвития РФ от 07.12.2004 г. № 303 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным злокачественным новообразованием мочевого пузыря» не упоминается о цитогенетическом исследовании клеток эпителия мочевого пузыря. Ввиду роста популярности данной методики как в Российской Федерации, так и в мировой практике возникает вопрос о цел е-
66
НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ Г 1 Серия Медицина. Фармация. 2012. №22(141). Выпуск 20/2
сообразности включения её в стандарт диагностики РМП, в частности для лиц пожилого и старческого возраста.
Цель данного исследования заключалась в определении целесообразности включения методики флуоресцентной in situ гибридизации в стандартный алгоритм диагностики рецидива рака мочевого пузыря после ТУР мочевого пузыря применительно к лицам пожилого и старческого возраста.
Материалы и методы. Проведено обследование 103 человек, проходящих диспансерное наблюдение по поводу поверхностного рака мочевого пузыря после ТУР. Обследуемые лица по результатам наблюдения в течение 12 месяцев после ТУР мочевого пузыря были разделены на 3 группы: i группа - пациенты в возрасте от 35 до 59 лет (средний возраст), 31 человек; 2 группа -60-74 года (пожилой возраст), 37 человек; 3 группа - 75-86 лет (старческий возраст), 35 человек. Всем пациентам в течение 12 месяцев после ТУР мочевого пузыря каждые 3 месяца было проведено однотипное обследование, включающее цистоскопию с последующей гистологией и FISH-методикой.
Методика FISH осуществлялась на реагентах компании ABBOTT (США). Набор UroVysion™ Multi-color FISH Probe Mixture включал флуоресцентные ДНК-зонды для определения анеуплоидии хромосом з, 7 и 17 и утраты локуса 9Р21 в образцах мочи больных раком мочевого пузыря (СЕР 3 SpectrumRed™, СЕР 7 SpectrumGreen, СЕР 17 SpectrumAqua, LSI 9p2i (pió) SpectrumGold™). Производился забор утренней мочи (первая, около 7 ч. 30 мин.) в стеклянную емкость (объем 50 мл). После сбора 33 мл мочи добавляли в пробирку, содержащую 17 мл CarboWax, и перемешивали, переворачивая пробирку. Хранились образцы при t 40С, пока продолжался процесс подготовки. Далее из полученной смеси выделяли клеточную суспензию путем центрифугирования при юоо об./мин. (600 g) согласно протоколу. Для приготовления препаратов использовали стекла с 3 лунками, количество клеточной суспензии от 10-30 мкл в зависимости от осадка, хранение препаратов -200С; предварительная обработка препаратов - согласно лабораторному протоколу для прямомеченных зондов; денатурация и гибридизация - прибор «Thermobrite» (Abbott Molecular, США); постгибри-дизационная обработка - по протоколу. Анализ готовых препаратов производился на микроскопе ZEISS АХЮ Imager.M2, Германия, с использованием световых фильтров компании ABBOTT Vysis®, США: SpectrumRed, SpectrumGreen, SpectrumAqua, SpectrumGold. Препараты анализировались сканирующим методом. Критерии отбора морфологически аномальных (предположительно злокачественных) клеток: большой размер ядра; неправильная форма ядра; «пятнистость» DAPI окраски. Клеточные кластеры: клетки в кластере при наложении клеток друг на друга не учитывались. Результат считался FISH-положительным, если в 4 из 25 аномальных клеток обнаруживалось увеличение количества сигналов по 2 и более хромосомам (3, 7 или 17) в одной и той же клетке, или более чем в 12 из 25 аномальных клетках отсутствует сигнал 9р21. Если это условие не соблюдалось, то препарат анализировали до тех пор, пока не было обнаружено 4 клетки с увеличенным количеством сигналов по
3,7 и 17 хромосомам или 12 клеток с отсутствием сигнала 9Р21-
Результаты. Согласно гистологическому исследованию из общей группы (103 человека) выявлен рецидив заболевания у 17 пациентов, однако результаты методики FISH оказались выше, согласно её результатам рецидив возможен у 34 человек. Общее количество рецидивов во всей выборке (103 человека) на срок 12 месяцев после ТУР мочевого пузыря соответствует данным отечественной и зарубежной литературы. При ретроспективном анализе через 12 месяцев после начала исследования выявлено 15 пациентов, у которых диагноз рецидива рака мочевого пузыря подтверждён гистологически и методикой FISH, при этом средний срок обнаруженного рецидива составил 9,6 месяцев при проведении гистологического исследования и 8,5 при проведении FISH-диагностики. Таким образом, FISH-диагностика позволила обнаружить рецидив РМП на i месяц раньше (р<0,05).
Данные исследования, проведенного в трех группах, представлены в таблице. В первой группе FISH-диагностика позволила обнаружить рецидив в среднем через 8,6 месяца, в то время как при проведении стандартного гистологического метода исследования этот временной период составил 9,6 мес. Во второй группе были определены следующие сроки возникновения рецидива: 7,9 и 9,4 мес. при проведении FISH-диагностики и стандартного гистологического исследования, соответственно. В третьей группе рецидив был обнаружен через 8,5 мес. (данные FISH-диагностики) и 9,6 мес. (результаты гистологического исследования).
В первой группе (пациенты среднего возраста) выявлено наименьшее количество пациентов с рецидивами.
Во второй группе (пожилой возраст) максимальная разница в сроках обнаружения рецидива при проведении данных методик составила 1,45 месяца (р<0,05). Проведение FISH-диагностики рецидива РМП было наиболее оправдано именно у лиц пожилого возраста.
НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ I ] Серия Медицина. Фармация. 2012. № 22 (141). Выпуск 20/2
Поскольку высокий риск возникновения рецидива РМП сохраняется на протяжении второго года, мы сочли целесообразным продолжать данное исследование, о результатах которого мы доложим позже.
Таблица
Результаты обследования пациентов, перенесших трансуретральную резекцию мочевого пузыря
Метод исследования Сроки после ТУР мочевого пузыря, мес. Всего Средний срок возникновения рецидива, мес.
3 6 9 12
Группа 1. 35-59 лет, 11=31
FISH (+) 1 2 2 3 8 8,6±0,5
FISH (-) 23
Гистологическое исследование (+) 0 1 2 2 5 9,6±О,75
Гистологическое исследование (-) 0 0 0 0 26
Группа 2. 60-74 лет, 11=37
FISH (+) 2 4 5 3 14 7>9±1
FISH (-) 23
Гистологическое исследование (+) 0 2 3 3 8 9,4±1
Гистологическое исследование (-) 29
Группа 3. 75-86 лет, 11=35
FISH (+) 1 2 5 4 12 8,5±1,5
FISH (-) 23
Гистологическое исследование (+) 0 1 1 2 4 9,6±о,5
Гистологическое исследование (-) 31
Примечание:FISH (+) - количество пациентов, у которых по результатам FISH методики выявлен положительный результат; FISH (-) - количество пациентов, у которых по результатам FISH методики выявлен отрицательный результат; гистологическое исследование (+) - количество пациентов, у которых по результатам гистологического исследования выявлен рецидив рака мочевого пузыря; гистологическое исследование (-) - количество пациентов, у которых по результатам гистологического исследования не выявлен рецидив рака мочевого пузыря.
Заключение. Внедрение молекулярно-цитогенетических методов в урологическую практику будет способствовать ранней диагностике рака мочевого пузыря, окажет существенную помощь при мониторинге заболевания, значительно повысит эффективность выявления рецидивов РМП, особенно у лиц пожилого возраста. Использование молекулярно-цитогенетических маркеров позволяет расширить общепринятую систему клинико-морфологических маркеров прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря.
Литература
1. World population prospects. The 2000 revision. - New York : United Nations, Department of Economic and Social Affairs, 2001. - 13 p.
2. Millions walk as WHO launches a global movement for active ageing World Health Organization. - Geneva : World Health Organization, Office of Press and Public Relations, 1999. - 3 p.
3. Чиссов, В.И. Злокачественные новообразования в России в 2006 году (заболеваемость и смертность) / В.И. Чиссов, В.В. Старинский, Г.В. Петрова. - М. : МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий, 2008. - 248 с.
68
НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ
Серия Медицина. Фармация. 2012. № 22(141). Выпуск 20/2
4. In World Health Organization Classification of Tumors, Volume 7 (Third Edition) IARC Press / J.N. Eble, G. Sauter, J.I. Epstein, I.A. Sesterhenn // Pathology and genetics of tumors of the urinary system and male genital organs. - 2004. - P. 90-157.
5. IARC Cancer Base no. 5. IARC Press / J. Ferlay, F. Bray, P. Pisani, D.M. Parkin. - GLOBOCAN, 2002: Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide, Version 2.0.
6. Чиссов, В.И. Злокачественные новообразования в России: статистика, научные достижения, проблемы / В.И. Чиссов, Б.Н. Ковалев и др. // Казан, мед. журн. - 2000. - Т. 81, №4. - С. 241-248.
7. Чиссов, В.И.Клинические рекомендации. Онкология. 2-е издание / В.И. Чиссов, С.Л. Дарьялова. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 925 с.
8. Julia, A. Cushman-Vokoun (2011) Molecular Diagnostics of Soft Tissue Tumors / A.Julia, Bridge and M.Allison //Archives of Pathology & Laboratory Medicine. - 2011. - May. - Vol. 135, № 5. - P. 588-601.
9. Clinical evaluationofMnulti-largeffluorescentiiisituhybridizationassayfordetectionof bladder cancer / M.F. Sarosdy,P. Schellhammer, G. Bokinsky, P. Kahn, R. Chao, L. Yore, J. Zadra, D. Burzon,G.Osher, JA. Bridge, S. nderson, S.L. Johansson, M. Lieber, M. Soloway, K.Flom // J. Urol. - 2002. - V. 168, № 5. - P. 1950-1954.
10. I lulling, K.C. Bladder cancer detection using FISH (UroVysion assay) / K.C.I lulling, B.R.Kipp // Adv. Anat. Pathol. - 2008. - Sep. - Vol. 15(5). - P. 279-286.
11. Quantitative fluorescence in situ hybridization and its ability to predict bladder cancer recurrence and progression to muscle-invasive bladder cancer / B.R. Kipp, M. Tanasescu, T.A. Else, S.C. Bryant, R.J. Karnes, T.J. Sebo, K.C. Hailing // J. Mol. Diagn - 2009. - Mar. - Vol. 11(2). - P. 148-154.
FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION IN EARLY DIAGNOSTICS OF RELAPSE OF A DLADDER CANCER IN THE FIRST 12 MONTHS AFTER A TRANSURETHRAL RESECTION OF A DLADDER AT OLD AND ELDERLY PEOPLE
G.A.RYZHAK A.S. PUSHKIN
The article presents the results of application experience of a fluorescent technique in situ hybridization (FISH) in early diagnostics of relapses of a superficial bladder cancer at 103 middle, old and elderly people who have transurethral resection of the bladder (TURB).
St. Petersburg institute ofbioregulation and gerontology of northwest branch of the Russian academy of medical sciences
Key words: a bladder cancer, fluorescence in situ hybridization, transurethral resection of the bladder, old and elderly people
e-mail: pushkindoc@mail.ru
