CC BY
123
Фармация и фармакология. № 2 (9), 2015
УДК 615.322:582.746.11:543.544.32
ФЛАВОНОИДЫ В ТРАВЕ ЯКОРЦЕВ СТЕЛЮЩИХСЯ
П.Е. Худенко, С.Л. Морохина, Д.М. Попов, Н.С. Терешина
Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова,
г. Москва
FLAVONOIDS IN THE GRASS OF TRIBULUS TERRESTRIS L.
P.E. Khudenko, S.L. Morokhina, D.M. Popov, N.S. Tereshina
I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow E-mail: pavel_khudenki@mail.ru
В данной статье представлено сырье якорцев стелющихся как перспективный образец для изучения. Приведен пример обнаружения флавоноидов методом ультраэффективной жидкостной хроматографии / МС на хроматографе Waters Acquility с тандемным квадрупольным MC-детектором TQD (Waters).
Ключевые слова: ацетонитрил, якорцы стелющиеся - Tribulus terrestris L., MC-детектор TQD (Waters), анализ исследованного образца сырья, хроматограммы и спектры
The article presents active parts of Tribulus terrestris L. as a perspective sample for study. We have provided an example of flavo-noids determination with high-performance liquid chromatography / MS at the Waters Acquility chromatographer with tandem quad-rupolar MS-detector TQD (Waters).
Keywords: acetonitrile, Tribulus terrestris L., MS-detector TQD (Waters), analysis of the active parts sample under study, chromatograms and spectrums
Якорцы стелющиеся (Tribulus terrestris L.), семейства парнолистниковые (Zygophyl-laceae) - однолетнее коротко опушенное травянистое растение. Стебли простерты по земле, от основания ветвистые, длиной 10120 (300) см. Листья супротивные, парноперистосложные, длиной 3-8 см, с 6-8 парами мелких продолговатых листочков. Цветки правильные желтые, диаметром до 1,2 см, одиночные, расположены в пазухах листьев. Околоцветник пентамерный, тычинок 10, гинецей ценокарпный из 5 сросшихся плодолистиков. Плод - ценокарпий, распадающийся при созревании на 5 звездчаторасположенных угловатых «плодиков», несущих на спинке 4 длинных, твердых и острых шипа, а также многочисленные бугорки.
В южной части ареала якорцы цветут в апреле-мае, близ северной границы - в июне-июле. В благоприятных условиях
цветение продолжается все лето и в начале осени. Растение плодоносит с июня-июля до заморозков [1].
Якорцы стелющиеся произрастают обычно в сухих степях на юге европейской части России и стран СНГ (низовья Дона и Волги, Украина, Молдова), а также в полупустынях Средней Азии, в Казахстане, на Кавказе, Алтае, в Восточной Сибири (Даурия). Растения особенно часто встречаются в Сурхандарьинской, Самаркандской и Кашкадарьинской областях Узбекистана, Курган-Тюбинской и Кулябской областях Таджикистана, Чимкентской области Казахстана и в центральных районах республики Тува. В Туве, как и в других районах Сибири, а также в Дагестане якор-цы растут в основном вдоль дорог и на сбитых выпасом песчаных почвах в пределах степного пояса. В Чимкентской обла-
18
Фармация и фармакология. № 2 (9), 2015
сти и в других районах Южного Казахстана, а также в Узбекистане, Туркмении и Таджикистане якорцы стелющиеся растут преимущественно как сорное растение поливных культур (огурцов, бахчевых культур, помидоров, винограда, хлопчатника и др.). На неполивных землях они отмечены на стойбищах и как рудеральное растение. В высокогорных районах встречаются редко, но в Таджикистане иногда поднимаются до 2800 м над уровнем моря [1].
В траве якорцев стелющихся содержится около 2,8% стероидных сапонинов, таких как протодиосцин и гликозиды диос-генина, тигогенина, рускогенина. Одними из сопутствующих соединений травы якор-цев стелющихся являются стерины: стиг-мастерин, кампестерин, р-ситостерин и стероиды диосгенин, тигогенин, неотиго-генин, ямогенин и согласно исследованиям Tian-Shung Wu, Li-Shian Shi, Shang-Chu Ku (Китай) алкалоиды террестрибисамид, три-булустерин, обнаруженные методом масс-спектрометрии [5]. Известно, что в траве якорцев стелющихся также имеются вещества флавоноидной структуры. Для определения данной группы БАВ используют методы ТСХ анализа [4], а также методы УФ-, ПМР-, С-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии [3].
Объектом исследования являлась трава якорцев стелющихся, собранная в различных районах Болгарии, в период плодоношения. Сырье представляет собой смесь бороздчатых стеблей с продолговатыми отдельными листочками сложного парноперистого листа с беловатым опушением, плодов 5-звездчатой формы, с морщинистой оболочкой и острыми твердыми шипами; реже встречаются отдельные сложные плоды с 2 и 4 шипами, цвет стеблей зеленовато-желтый, плодов светлозеленый, листьев зеленый, запах сырья слабый, специфический.
Около 2 грамм сырья (точная навеска), измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещали в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 60 мл 70% спирта этилового, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на ки-
пящей водяной бане в течение 45 минут. После охлаждения до комнатной температуры фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл так, чтобы сырье не попало на фильтр, фильтр промывали 10 мл 70% спиртом этиловым и доводили объем раствора в колбе тем же растворителем до метки.
Для предварительного обнаружения флавоноидов к спиртовому извлечению в пробирку добавляли спиртовый раствор алюминия хлорида и отмечали, что раствор окрашивался в зеленовато-желтый цвет.
Флавоноиды в траве якорцев стелющихся определяли методом ультраэффективной жидкостной хроматографии / МС на хроматографе Waters Acquility с тандемным квадрупольным MC-детектором TQD (Waters).
Подвижная фаза А (ПФ А). Смесь вода - ацетонитрил (95:5) с муравьиной кислотой.
Подвижная фаза В (ПФ В). Ацетонитрил с муравьиной кислотой.
Хроматографировали испытуемый раствор и растворы стандартов в следующих условиях:
-объем пробы 5 мкл;
-колонка 0,21 х 15,0 см Acuility UPLC BEH C18 (1,7 мкм);
-температура колонки 35 °С;
-скорость потока 0,3 мл/мин; -градиентный режим хроматографирования формируется путем смешивания подвижных фаз А и В по следующей схеме:
Время, мин ПФ А, % ПФ В, %
0 95 5
30 50 50
32 0 100
33 95 5
36 95 5
УФ-детектирование проводили в диапазоне 220-500 нм.
Масс-спектрометрическую детекцию (МС) проводили в двух режимах:
-МС детекция в режиме позитивных ионов (параметры детектора: напряжение на капилляре - +3 кВ; напряжение на конусе - 50 В; температура капилляра 450°С;
19
Фармация и фармакология. № 2 (9), 2015
температура источника 120°С; скорость потока осушающего газа 800 л/ч, скорость потока газа в конусе 50 л/ч и сканирование в диапазоне масс от 100 до 1500 ед.);
-МС детекция в режиме негативных ионов (параметры детектора: напряжение на капилляре - -3 кВ; напряжение на конусе —30 В; температура капилляра 350°С; температура источника 120°С; скорость потока осушающего газа 500 л/ч, скорость потока газа в конусе 50 л/ч и сканирование в диапазоне масс от 100 до 1500 ед.).
В результате анализа исследуемых образцов экстракта якорцев стелющихся получены следующие результаты.
На хроматограмме при 360 нм наблюдаются только 3 достаточно интенсивных пика с массами молекулярных ионов в режиме регистрации позитивных ионов, равными 611, 595 и 625, в режиме регистрации негативных ионов - 609, 593 и 623 и с временами удерживания 7,4, 8,8 и 9,1 мин. Пик с временем удерживания 7,4 мин массой 610 является рутином,
(1)
так как совпадает по спектрам и времени удерживания со стандартом. Пик с временем удерживания 8,8 мин имеет предположительно структуру кемпферол-3-рутинозида, так как в спектре в режиме ре-
гистрации позитивных ионов имеет фрагменты с 287 (Кемпферол) и 449, с потерей масс 148 и 162, аналогичных фрагментации рутина (611 до 303 и 465).
(2)
20
Фармация и фармакология. № 2 (9), 2015
Пик с временем удерживания 9,1 мин может иметь одну из структур (3-6):
(4)
(6)
Молекулярный ион 625 фрагментируется на 479 и 317 (кверцетин, метилированный в одно из 4-х положений:
рамнетин, изорамнетин, тамараксетин или азалеатин), что также аналогично фрагментации рутина.
250 500 750 1000 1250
Рисунок 1 - Хроматограммы и спектры смеси стандартов в режиме регистрации позитивных ионов
21
Фармация и фармакология. № 2 (9), 2015
QBA127 17-Dec-2014 12:37:29 Yakortsi
Yakortsi
DMP-161214-8 1006 (9.162) Cm (1000:1011-(978:993+1017:1029)) DMp 161214 8 625 33 1.34e6
100
1076.30 1375.09
DMP-161214-8 971 (8.844) Cm (964:975-(981:1001+939:959))
595 38 1.07e6
0-
2 05 5 21
100,
287.19
937 28
0.00
DMP-161214-8
100-,
QBA127 17-Dec-2014 12:37:29
1: Scan ES+
9.16 625
2.60e7
19.93
15.43 | 23 86 27.79
10.00 8 83
20.00
1345.69
DMP-161214-8 815 (7.422) Cm (811:820-(779:799+826:855))
611.19 7.08e6
303 08
100,
3 56 7.50
,.
1: Scan ES+ 595
25.61 2.26e7
465.14
, 756.42 1040.25 1274 35
0.00
DMP-161214-8
100-1
10.67 14,0l 1754 22.35
28.32
Rutin
7.43
10.00
20.00
DMP-161214-8 10949 (9.124) Cm (10901:10991-(11041:11149+10719:10839)) 254 80 1 095e-2
3
<
1.0e-2d
00
1: Scan ES+ 611 1.02e8
14.17 17 32 '■■T'Jk-k,'-rr
0.00
DMP-161214-8
10.00
20.00
Rutin 7 39
DMP-161214-8 10559 (8.799) Cm (10512:10614-(10676:10809+10311:10432)) 265.80 6 957e-3
5.0e-2
3
<
5.0e-3
00
0.0
2: Diode Array 360
Range: 6.527e-2
^9.12
0.00
DMP-161214-8
DMP-161214-8 8872 (7.393) Cm (8821 8936-(8572:8705+9083:9179)) 256.80 4.137e-2
2.5e-2
00
10.00 20.00 14.79
17.66
1: Scan ES+ TIC 2.49e9
Time
• m/z
250 500 750 1000 1250
Рисунок 2 — Хроматограммы и спектры экстракта якорцев стелющихся в режиме регистрации позитивных ионов
Yakortsi QBA127 17-Dec-2014 13:14:21
DMP-161214-9 1007 (9.171) Cm (1001:1011-(1022:1048+958:991))
DMP-161214-9 973 (8.861) Cm (964:976-(983:999+936:956))
DMP-161214-9 817 (7.440) Cm (810:821-(834:855+772:799))
10„ 609.24 1.11e6
212.81
V+w
493.06
824 52
f#t+
122023 1470.38
',vi m/z
Yakortsi
DMP-161214-9
100-
0
QBA127 17-Dec-2014 13:14:21
1: Scan ES-
9.15 623
6.28e6
0.00
DMP-161214-9
100-,
3.67 7.70 11.3014.4317.53
И'Л.'Г, .L,..,!,1,(114, |ll,f4.
10.00
8.83
20.00
23.98 27.32
0.00
DMP-161214-9 100-
5.24
1: Scan ES-593 5.18e6
14.03
12.351 17.47
24.15 27.94
10.00
20.00
7.43
1: Scan ES-609 1.76e7
5.0e-2
Z>
<
0.00.00
DMP-161214-9
00 '• о о о 20.00
7.40 2: Diode Array 360
1.28 1 9.13 kJ-pr-n ..I Range: 6.421e-2 1 1 1 1 1 1 -1 1 1 ■' r "1
10.00 20.00 15.38
0 0.00
2.06 744 11 29 I
1: Scan ES-TIC 3.35e8
17.63 21 27 27.56
. Time
10.00
20.00
200 400 600 800 1000 1200 1400
Рисунок 3 — Хроматограммы и спектры экстракта якорцев стелющихся в режиме регистрации негативных ионов
0
27.53
1 28
0.00
0
22
Фармация и фармакология. № 2 (9), 2015
Вывод
Якорцы стелющиеся - перспективное лекарственное растение, для определения доброкачественности лекарственного растительного сырья которого разработана методика определения флавоноидов. Оптимальным условием экстракции флавоноидов из травы якорцев стелющихся является 70% спирт этиловый с соотношением сырья и экстрагента 1:50, измельченность сырья - 2 мм, температурный режим - кипящая водяная баня с обратным холодильником и временем экстракции 45 минут. Флавоноиды в траве якорцев стелющихся определяли и идентифицировали их структуру методом ультраэффективной жидкостной хроматографии / МС на хроматографе Waters Acquility.Установили, что трава якорцев стелющихся содержит флавоноиды: кемпферол, кверцетин, рамнетин, изорам-нетин, амараксетин, азалеатин.
Библиографический список
1. Худенко П.Е. Сравнительный анализ нормативной документации на сырье якорцев стелющихся / П.Е. Худенко, С.Л. Морохина // Медицинская Весна: материалы итоговой Всерос. науч. конф. с междунар. уч. 30 апреля 2014 г. М., 2014. С. 217
2. Наумов, А.В. Количественное определение флавоноидов в траве звездчатки средней / А.В. Наумов, Д.М. Попов // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2014. №4. С. 132-137.
3. Тожибоев, М.М. Ксантоны и флавоноиды Gentiana Algida Pall / М.М. Тожибоев,
Э.Х. Ботиров, Г.А. Усманова // Химия растит, сырья. 2010. №3. С. 129-133.
4. Флавоноиды травы эхинацеи пурпурной / В.А. Куркин, А.С. Акушская, Е.В. Авдеева [и др.] // Химия растит, сырья. - 2010. - №4. - С.87-89.
5. Tian-Shung Wu, Li-Shian Shi, Shan-Chu Kuo. Alkaloids and other constituents from Tribulus terrestris // Phytochemistry. 1999. Vol. 50. P. 1411-1415.
Худенко Павел Евгеньевич - студент Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова Область научных интересов: исследования по разработке методов получения и стандартизации лекарственных растительных средств; изучение состава и стандартизация лекарственного растительного сырья. Е-mai!: pavel_khudenki@mail. ги.
Морохина Светлана Львовна - кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармакогнозии Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова. Область научных интересов: исследования по разработке методов получения и стандартизации лекарственных раститечьных средств; изучение состава и стандартизация лекарственного растительного сырья. E-mail: morohinas@mail.ru.
Попов Дмитрий Матвеевич - главный научный сотрудник, доктор фармацевтических наук Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова. Область научных интересов: исследования по развитию современных физикохимических методов анализа действующих веществ в растительном сырье и фитопрепаратах. E-mail: Popovdm-niiJ@mail.ru.
Терешина Наталья Сергеевна - доктор фармацевтических наук, заведующий лабораторией Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова. Область научных интересов: исследования по разработке методов получения и стандартизации гомеопатических лекарственных средств; изучение состава и стандартизация лекарственного растительного сырья. E-mail: tereshinan@mail.ru.
23
