CC BY
195
Химия растительного сырья. 2012. №2. С. 85-88.
УДК 615.32:547.972+543.544 ФЛАВОНОИДЫ ЛИСТЬЕВ ГИНКГО ДВУЛОПАСТНОГО (GINKGO BILOBA L.)
© В.А. Куркин1, Д.Г. Буланкин1, Е.Д. Даева2, В.И. Каденцев2
1 Самарский государственный медицинский университет, ул. Чапаевская, 89,
Самара 443099 (Россия), e-mail [email protected]
2Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Ленинский просп.,
47, Москва, 119991 (Россия), e-mail: [email protected]; [email protected]
Из листьев гинкго двулопастного (Ginkgo biloba L.) выделены и охарактеризованы с использованием 1Н-ЯМР-, УФ-спекгроскопии, масс-спектрометрии и различных химических превращений флавоноиды гинкгетин (7,41-диметил-аментофлавон), никотифлорин (3-О-рутинозид кемпферола) и нарциссин (3-О-рутинозид изорамнетина). В сырье данного растения обнаружены также изогинкгетин (41,4111-диметиламентофлавон) и рутин. Гинкгетин, никотифлорин и нарциссин впервые описаны для листьев гинкго двулопастного, культивируемого в Российской Федерации и странах СНГ.
Ключевые слова: гинкго двулопастный, Ginkgo biloba L., листья, флавоноиды, гинкгетин, изогинкгетин, никотифлорин, нарциссин, рутин.
Работа выполнена при поддержке проекта 02.740.11.0650 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
Гинкго двулопастный (Ginkgo biloba L.) - единственный реликтовый вид типа Гинкговых (семейство Ginkgoaceae), который сохранился до нашего времени с пермского периода палеозойской эры (286-245 млн. лет назад) [1-4]. Гинкго двулопастный произрастает в странах с субтропическим климатом, однако возможности к адаптации этого растения очень высоки, о чем свидетельствует его успешное культивирование в Российской Федерации, в частности, в Краснодарском и Ставропольском краях [1, 2].
Листья гинкго двулопастного входят в Европейскую и Американскую фармакопеи [5-7]. На основе субстанций из листьев гинкго двулопастного в Российской Федерации применяются такие препараты, как танакан, билобил, мемоплант, гинкор форт, гинкор гель [8], однако они производятся за рубежом и являются дорогостоящими. Фармакологическое действие листьев гинкго обусловлено содержанием различных классов биологически активных соединений, включая флавоноиды (флавоноловые гликозиды, бифлаво-ноиды и др.), а также дитерпены и сесквитерпены [1-4].
Введение
Куркин Владимир Александрович - заведующий кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, доктор фармацевтических наук, профессор, e-mail: [email protected]
Буланкин ДенисГеоргиееич - аспирант, e-mail: [email protected]
Даева Елена Дмитриевна - заведующая лабораторией, доктор химических наук, e-mail: [email protected]
Каденцев Валентин Иванович - заведующий лабораторией, доктор химических наук, e-mail: [email protected]
На данный момент в Российской Федерации отсутствуют какие-либо виды нормативной документа -ции на сырье «Гинкго двулопастного листья», причем до сих пор не решены в полной мере вопросы стандартизации сырья и препаратов гинкго, хотя определенный опыт в этом отношении имеется [5-7, 9, 10].
На наш взгляд, успешное решение проблемы стандартизации сырья и препаратов гинкго двулопастного возможно лишь на основе глубокого исследования химического состава сырья данного растения.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Цель настоящей работы - исследование флавоноидного состава листьев гинкго дву лопастного, культивируемого в Краснодарском крае как одном из потенциальных регионов для создания промышленной сырьевой базы данного растения.
Экспериментальная часть
Объектами исследования служили листья гинкго двулопастного, культивируемого в Ботаническом саду Краснодара (июль 2009 г.). Воздушно-сухие листья гинкго двулопастного (200 г) исчерпывающе экстрагировали 70% этиловым спиртом, полученные водно-спиртовые экстракты упаривали под вакуумом до густого остатка (около 50 мл). Сгущенный экстракт высушивали на силикагеле L 40/100 и полученный порошок (экстракт+силикагель) наносили на слой силикагеля, сформированный в хлороформе. Хроматографическую колонку элюировали хлороформом и смесью хлороформ - этанол в различных соотношениях (99 : 1, 98 : 2, 97 : 3; 95 : 5; 93 : 7; 90 : 10; 88 : 12; 85 : 15; 80 : 20; 70 : 30). Фракции, содержащие вещества 1-3, подвергали дальнейшей рехроматографии на полиамиде, осуществляя при этом элюирование водой, водно-спиртовыми смесями (20, 30, 40, 70%) и 96% этиловым спиртом. В результате проведенной очистки на колонках с полиамидом были получены вещество 1 (элюент - 96% этиловый спирт), вещество 2 (элюент - 40% этиловый спирт) и вещество 3 (элюент - 30% этиловый спирт), дополнительную очистку которых удалось провести путем перекристаллизации из водного спирта. Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ-анализа на пластинках «Silufol UV 254» и «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системах хлороформ - спирт (6 : 1), а также хлороформ - метанол - вода (26 : 14 : 3).
Спектры ЯМР 'Н получали на приборе «Bruker AM 300» (300 МГц), масс-спектры снимали на масс-спектрометре «Kratos MS-30», регистрацию УФ-спектров проводили с помощью спектрофотометра «Spe-cord 40» (Analytik Jena).
Соединение 1 (гинкгетин). Кристаллы светло-желтого цвета, состава Сз2Н220щ Масс-спектр (70 eV, 200 °С, m/z, %): М+ 566 (100). УФ-спектр (EtOH, Xmax, нм): 271, 330; +AlCl3, 279, 330, 348, 385; +AlCl3+HCl 279, 330, 348, 385. Спектр ЯМР (300 МГц, ДМСО-de, 5, м.д., J/Гц): 3,77 (3Н, с, 41-ОСН3), 3,84 (3Н, с, 7-ОСН3), 6,43 (1Н, с. Н-611), (1Н, д, J = 2,5, Н-6), 6,48 (1H, д, J = 2,5, Н-8), 6,72 (1H, д, J = 9, Н-31), 6,80 (1H, с, Н-3), 6,90 (1H, с, Н-311), 6,94 (2H, д, J = 9, Н-3111 и Н-5111), 7,50 (1H, д, J = 9, Н-31), 7,62 (2Н, д, J = 9, Н-2111 и Н-6111), 8,10 (1Н, д, J = 2,5, Н-61), 8,18 (1Н, дд, J = 2,5 и J = 9,0, Н-21), 12,93 (1H, с, 5-ОН группы), 13,05 (1H, с, 511-ОН группы).
Соединение 2 (никотифлорин). Кристаллы светло-желтого цвета, состава С27Н30О15, т.пл. 182-186 °С (водный спирт). УФ-спектр (ЕЮН, Хтах, нм): 266, 355; +№ОАс 272, 304, 365; +А1С13, 274, 304, 345, 394; +А1С13+НС1 275, 304, 345, 394; + №ОМе 275, 326, 400. Спектр ЯМР 1Н (300 МГц, ДМСО-а6, 5, м.д., 1/Гц):
0,98 (3Н, д, I = 6,0, СН3 рамнозы), 3,00-3,85 (10Н сахарной части), 4,38 (1Н, д, I = 2,0, Н-1111 рамнозы), 5,31 (1Н, д, 1=7,0, Н-111 глюкозы), 6,20 (1Н, д, I = 2,5, Н-6), 6,30 (1Н, д, I = 2,5, Н-8), 6,88 (2Н, д, I =9, Н-31 и Н-51), 7,97 (2Н, д, I = 9, Н-21 и Н-61), 12,56 (1Н, с, 5-ОН группы). Масс-спектр (70 еУ, 200 °С, т/7, %): М+ аг-ликона 286 (100).
Соединение 3 (нарциссин). Кристаллы желтого цвета из этанола, состава С28Н32016, т. пл. 173-175 °С (водный спирт). УФ-спектр (ЕЮН, Хтах, нм): 257, 268 пл., 358; +А1С13 268, 276 пл., 403. Спектр ЯМР 1Н (300 МГц, дейтероацетон + Б2О, 5, м.д., .Т/Гц): 1,03 (д, I = 6,0, СН3 рамнозы), 3,2-3,8 (10Н сахаров), 3,94 (с, 3Н, СН30), 4,50 (д, 2 Гц, Н-1111 рамнопиранозы), 5,23 (д, I = 7,0, Н-111 глюкопиранозы), 6,24 (д, I = 2,0, Н-6), 6,50 (д, I = 2,0, Н-8), 6,96 (д, 8,5, Н-51), 7,66 (дд, I = 2,0 и I = 8,5, Н-61), 7,97 (д, I = 2,0, Н-21), 12,20 (1Н, с, 5-ОН группы). Масс-спектр (70 еУ, 200 °С, т^, %): М+ агликона 316 (100).
Обсуждениерезулътатов
Гинкгетин (1) на основе физико-химических констант, данных УФ- и ЯМР- и масс-спектров идентифицирован нами как 7,41-диметиламентофлавон [11 ].
В условиях кислотного гидролиза флавоноиды 2 и 3 расщепляются с образованием кемпферола (3,5,7,41-тетрагидроксифлавон) и изорамнетина (3,5,7,41-тетрагидрокси-3-метоксифлавон) соответственно. Углеводная часть данных гликозидов представлена одинаковыми сахарами - глюкозой и рамнозой. Совокупность физико-химических констант, данных УФ- и ЯМР- и масс-спектров, а также результатов кислотного гидролиза позволила идентифицировать выделенные флавоноиды как никотифлорин (3-О-рутинозид кемпферола) (2) и нарциссин (3-О-рутинозид изорамнетина) (3).
Доминирующими флавоноидами листьев гинкго двулопастного, культивируемого в Краснодарском крае, являются гинкгетин и никотифлорин, в несколько меньших количествах содержится нарциссин. Изо-гингетин обнаружен нами в качестве примеси в образце гинкгетина, что соответствует данным зарубежных ученых, которые получили эти соединения в виде смеси [11]. Примечательно, что и в другой зарубежной работе гинкгетин (7,41-диметиламентофлавон) и изогинкгетин (41,4111-диметиламентофлавон), будучи близкими по химической структуре, обнаруживаются в виде одного пятна [9]. На наш взгляд, выделение гинкгетина как одного из доминирующих и характерных флавоноидов листьев гинкго двулопастного имеет принципиальное значение. Во-первых, для гинкгетина нами выявлена ноотропная активность, свойственная препаратам гинкго [1-4], а во-вторых, имеются примеры, когда стандартизацию сырья данного растения осуществляют без учета наличия гинкгетина: методом ВЭЖХ обнаруживаются лишь продукты кислотного гидролизата - кемпферол, кверцетин и изорамнетин [5-7, 10], что, на наш взгляд, является ошибочным подходом. Что касается рутина, описанного в литературе для данного растения, то он относится к минорным компонентам и едва обнаруживается на хроматограммах (ТСХ). Интересно, что в исследуемых зарубежных образцах листьев гинкго двулопастного рутин относительно четко обнаруживается методом ТСХ лишь в сырье из Италии [11].
Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать для определения подлинности сырья гинкго двулопастного ТСХ («Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ», система растворителей: хлороформ - метанол - вода, 26 : 14 : 3). В предложенных условиях хроматографирования после проявления хроматограммы щелочным раствором диазобензолсульфокислоты гинкгетин и изогинкгетин обнаруживаются в виде одного доминирующего пятна желто-оранжевого цвета с величиной Rf около 0,9, никотифлорин (второе доминирующее пятно), нарциссин и рутин - в виде желтых пятен с Rf около 0,6, 0,5 и 0,4 соответственно. На наш взгляд, в данной методике целесообразно использовать стандартный образец рутина, близкий по физико-химическим и спектральным свойствам к основным флавоноидам листьев гинкго двулопастного, так как расчет величины RS позволит повысить объективность методики анализа.
Список литературы
1. Куркин В.А. Фармакогнозия. Самара, 2007. 1239 с.
2. Куркин В.А. Основы фитотерапии. Самара, 2009. 963 с.
3. Wagner H. Pharmazeutische Biologie. Drogen und ihre Inhaltsstoffe. Stuttgar; New York, 1993. 522 s.
4. Sasakia K. Chemistry and biological activities of Ginkgo biloba. Hokkaido, 2007. 177 p.
5. British Pharmacopoeia. Incorporating the Requirements of the 5 Edition of the European Pharmacopoeia 1997 as amended by Supplement 2007. System Simulation Ltd., 2007. 1680 p.
6. United States Pharmacopeia. 31-th Ed., Rockville: United States Pharmacopoeial Convention, Inc., 2008. 2105 p.
7. Фармакопея США, USP 29. Национальный формуляр, NF 24: 2 т. M., 2009. T. 1. 1720 с.
8. Государственный реестр лекарственных средств. Официальное издание. М., 2008, Т. 1. 1238 с.
9. Wagner H., Bladt S. Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas. Berlin; Heidelberg; New York, 1996. 384 p.
10. Юрьев Д.В., Эллер К.И., Арзамасцев А.П. Анализ флавонолгликозидов в препаратах и БАД на основе гинкго билоба // Фармация. 2003. Т. 51, №2. С. 7-10.
11. Hanrahan J.R., Chebib M., Davucheron N.L.M., Belinda H.J., Johnstonb G.A.R. Semisynthetic Preparation of Amento-flavone: A Negative Modulator at GABAA Receptors // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003. Vol. 13. Pp. 2281-2284.
Поступило в редакцию 25 февраля 2011 г.
Kurkin V.A.1*, Bulankin D. G.I, Daeva E.D.2, Kadentsev V.I.2 THE FLAVONOIDS FROM LEAVES OF GINKGO BILOBA
ISamara State Medical University, ul. Chapaevskaia, 89, Samara, 443099 (Russia), e-mail [email protected] 2N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Leninskii prosp., 47, Moscow, II999I (Russia), e-mail: [email protected]; [email protected]
From the Ginkgo biloba L. leaves there were isolated the flavonoids ginkgetin (7,4*- dimethylamentoflavon), nicotiflorin (3-O-rutinoside of kaempferol) and narcissin (3-O-rutinoside of isorhamnetin) which were identified by means of 1H-NMR-, UV-spectroscopy, mass spectrometry and several chemical transformations. In the drug of this plant there were observed also isoginkgetin (4 *,411'-dimethylamentoflavon) and rutin. Flavonoids ginkgetin, nicotiflorin and narcissin for the first time were isolated from the leaves of Ginkgo biloba L., cultivated in Russian Federation and other countries of CIS.
Keywords: Ginkgo biloba L., leaves, flavonoids, ginkgetin, isoginkgetin, nicotiflorin, narcissin, rutin.
References
1. Kurkin V.A. Farmakognoziia. [Pharmacognosy]. Samara, 2007, 1239 p. (in Russ.)
2. Kurkin V.A. Osnovy fitoterapii. [Fundamentals of phytotherapy]. Samara, 2009. 963 p. (in Russ.)
3. Wagner H. Pharmazeutische Biologie. Drogen und ihre Inhaltsstoffe. Stuttgart; New York, 1993, 522 p.
4. Sasakia K. Chemistry and biological activities of Ginkgo biloba. Hokkaido, 2007, 177 p.
5. British Pharmacopoeia. Incorporating the Requirements of the 5 Edition of the European Pharmacopoeia 1997 as amended by Supplement 2007. System Simulation Ltd., 2007. 1680 p.
6. United States Pharmacopeia, 31-th Ed., Rockville: United States Pharmacopoeial Convention, Inc., 2008. 2105 p.
7. Farmakopeia SShA, USP 29. Natsional’nyi formuliar, NF 24. [United States Pharmacopoeia, USP 29. National Formulary, NF 24] Moscow, vol. 1, 1720 p. (in Russ.)
8. Gosudarstvennyi reestr lekarstvennykh sredstv. Ofitsial'noe izdanie. [State register of medicines. Official edition] Moscow, 2008, vol. 1. 1238 p. (in Russ.)
9. Wagner H., Bladt S. Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas. Berlin; Heidelberg; New York, 1996. 384 p.
10. Iur'ev D.V., Eller K.I., Arzamastsev A.P. Farmatsiia, 2003, vol. 51, no. 2, pp. 7-10.
11. Hanrahan J.R., Chebib M., Davucheron N.L.M., Belinda HJ., Johnstonb G.A.R. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, vol. 13, pp. 2281-2284.
Received February 25, 20II
* Corresponding author.
