CC BY
29
3 ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕРАБОТКИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ УДК 561.284.579.61
ФЛАВОНОИДЫ ГЛУБИННОЙ КУЛЬТУРЫ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ РОДА PLEUROTUS
А.Е. Васюк, В.В. Тарнопольская, Е.В. Алаудинова, П.В. Миронов
ФГБОУ ВО «Сибирский государственный технологический университет» 660049 Красноярск, пр. Мира, 82; е-mail:[email protected]
Мицелий представителей рода Pleurotus, выращиваемый в условиях глубинного культивирования, является источником ряда биологически активных веществ. Впервые в глубинных культурах Pleurotus обнаружены биофлавоноиды. Данный факт представляет безусловный интерес, поскольку наличие последних в составе пищевых и кормовых продуктов существенно повышает их ценность. Необходимо подчеркнуть, что о наличии биофлавоноидов в плодовых телах или мицелии базидиомицетов в литературе до настоящего времени не упоминалось.
Важнейшая особенность биофлавоноидов, связанная с наличием в структуре гидроксильных групп, способных нейтрализовать активные формы молекул кислорода (активные радикалы), придает им свойства универсальных антиокси-дантов. Установлено, что суммарное содержание этих соединений у Pleurotus ostreatus и Pleurotus citrinopileatus достигает 2,4 ± 0,1 и 4,1 ± 0,2 % в расчете на абсолютно сухую биомассу соответственно.
В составе биофлавоноидов с помощью методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и инфракрасной спектроскопии (ИКС) идентифицирован дигидрокверцетин. В качестве стандарта использовали дигидрокверце-тин, выделенный из Larix sibirica L. Характеристические частоты колебаний структурных элементов и связей ИК-спектров стандартного дигидрокверцетина соответствуют его строению и полностью совпадают с ИК-спектрами индивидуального вещества глубинных культур, определенного как дигидрокверцетин. Содержание дигидрокверцетина у Pleurotus ostreatus и Pleurotus citrinopileatus близко и составляет в сухой биомассе 0,6-0,7 %.
Ключевые слова: биофлавоноиды, дигидрокверцетин, базидиомицеты, Pleurotus, глубинный мицелий, высокоэффективная жидкостная хроматография, инфракрасная спектроскопия.
The mycelium of the genus of Pleurotus, grown in submerged cultivation, is the source of a number of biologically active substances. For the first time in the submerged culture Pleurotus found bioflavonoids. This fact provides an unconditional interest because its presence in food and feed products greatly enhances their value. It must be emphasized that the presence of bioflavo-noids in the fruit bodies or mycelia of basidiomycetes in the literature so far not been mentioned.
The most important feature of bioflavonoids associated with the presence of hydroxyl groups in the structure, capable of neutralizing reactive oxygen molecules (active radicals), gives them properties of universal antioxidants. It is found that the total content of these compounds in Pleurotus ostreatus and Pleurotus citrinopileatus reaches 2.4 ± 0.1 and 4.1 ± 0.2% in counting on absolutely dry biomass respectively.
Among bioflavonoids by methods of high performance liquid chromatography (HPLC) and infrared spectroscopy (IR) identified dihydroquercetin. Dihydroquercetin extracted from Larix sibirica L. was used as a standard. The characteristic oscillation frequency of structural elements and connections of the IR spectra of the standard dihydroquercetin correspond its structure and fully coincide with the IR spectra of individual substance of submerged culture, defined as dihydroquercetin. The contents of dihydroquercetin in Pleurotus ostreatus and Pleurotus citrinopileatus close and is 0.6-0.7% of dry biomass.
Keywords: bioflavonoids, dihydroquercetin, basidiomycetes, Pleurotus, submerged mycelium, high-performance liquid chromatography, infrared spectroscopy.
ВВЕДЕНИЕ
Биофлавоноиды - большая группа биологически активных соединений растительного происхождения, относящихся к классу полифенолов (Кнунянц [и др.], 1990). В настоящее время описано более 6000 таких соединений. Важнейшая особенность биофлавоно-идов - наличие в структуре гидроксильных групп, способных нейтрализовать активные формы молекул кислорода (активные радикалы), превращает их в универсальные антиоксиданты. Помимо этого биофлавоноиды обладают ярко выраженным противоаллергическим, противоопухолевым, антибактериальным, противогрибковым и др. эффектами (Машковский, 2005). Интерес к этим соединениям, ввиду присущего им широкого спектра биологического действия и фармакологических свойств, неуклонно возрастает.
Известно, что биофлавоноиды широко распространены в растениях: содержатся в листьях, цветах и плодах. В 40-х годах прошлого столетия биофлавоноиды обнаружены в древесине дугласовой пихты (Pew, 1948.). В 60-х годах российскими учеными ИрИХ СО РАН был открыт еще один растительный источник биофлавоноидов - лиственницы сибирская и даурская, а позднее разработана промышленная технология получения из древесины этих пород дигидрокверцетина (международное название таксифолин; 2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-(3,4-дигидроксифенил)-4Н-1-бензопиран-4-он), являющегося эталонным антиокси-дантом (Патент РФ № 2158598, 2000).
В рамках разработки технологии получения кормовых продуктов методом глубинного культивирования базидиомицетов на различных растительных субстратах, в биомассе глубинных культур этих гри-
Хвойные бореальной зош>1, XXXIV, № 1 - 2, 2016
бов нами были обнаружены биофлавоноиды. Данный факт для нас представляет безусловный интерес, поскольку наличие последних в составе пищевых и кормовых продуктов существенно повышает их ценность. Необходимо подчеркнуть, что о наличии био-флавоноидов в плодовых телах или мицелии бази-диомицетов в литературе до настоящего времени не упоминалось. В этой связи целью настоящей работы являлось изучение состава биофлавоноидов глубинных культур базидиальных грибов рода Р1еога^.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлись штаммы: РО-4.1 Р1еогаи (Р. ostreatus) - вешенка обыкновен-
ная и РС-1.2 Р1е-гоО аМпарИеа— (Р. citrinopileatus) -вешенка лимонная, чистые культуры которых были выделены из коммерческих плодовых тел.
Условия получения глубинной биомассы Р. ostreatus и Р. сНппарНеаШ изложены в (Тарнополь-ская [и др.], 2014).
Определение содержания биофлавоноидов в биомассе Р. ostreatus и Р. сНппарНеаШ проводили по известной методике (Адихотдаев, 1977).
Биофлавоноиды из глубинной биомассы экстрагировали 60 % этиловым спиртом. Для разделения и идентификации биофлавоноидов применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Перри, 1974; Шатц, 1988; Хенке, 2009). Анализ проводили на жидкостном хроматографе с У детектором с использованием комплекса «ФЛЮОРАТ-02-ПАН0РАМА» с ВЭЖХ-приставкой «ПИТОН» (С,-Пб, «Люмэкс»). Для анализа применяли обращенно-фазную колонку 16*250 мм, сорбент - диасорб 130 С16 / Т 6ц, температура колонки 24 0С, подвижная фаза -5 % уксусная кислота, скорость потока подвижной фазы - 1,7 мл/мин. Детектирование проводили при длине волны - 270 нм. В качестве стандарта использовали чистый препарат дигидрокверцетина.
Для дополнительной идентификации разделенных в препаративном варианте ВЭЖХ компонентов применяли метод инфракрасной спектроскопии (ИКС) (Прикладная ИК-спектроскопия..., 1982; Наканиси, 1965). ИК-спектры дигидрокверцетина и полученных индивидуальных соединений снимали на приборе ИК-Фурье-спектрометр «ИНФРАЛЮМ ФТ 02».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате определения биофлавоноидов в биомассе глубинных культур установлено, что суммарное содержание этих соединений у Р. ostreatus и Р. сНппарНеаШ составляет соответственно 2,4 ± 0,1 и 4,1 ± 0,2 % от абсолютно сухой биомассы.
Для анализа состава биофлавоноидов были получе -ны спиртовые экстракты глубинных культур, которые затем исследовали методом ВЭЖХ. Аналогичным образом исследовали и стандартный дигидрокверцетин.
На рисунке 1 представлена хроматограмма 60 % спиртового раствора стандартного дигидрокверцети-на. Выход вещества наблюдается на 13,6 минуте.
Время, мин
Рисунок 1 - Хроматограмма стандартного дигидрокверцетина
На хроматограмме 60 % спиртового экстракта глубинной культуры Р. ostreatus (рисунок 2) присутствуют восемь пиков индивидуальных соединений. Хорошо ввдно , чтопик 4 совпадаетповремени удерживания с иииом сиандартногодигидрокверцетина.
Время, мин
Рисунок 2 - Хроматограмма спиртового экстракта Р. <Мгеа1ш
На рисунке 3 приведена хроматограмма 60 % спиртового экстракта глубинной культуры Р. сИгторИеМив, на которой присутствуют 9 пиков, также имеется пик 4, ещенгичеый по вромени удержиоания пику стандартного дигидрокверцетина.
1 2 4 6 0 10 12 14 16 1Э 20 22 24 26 28
Время, сир
Рисунок 3 - Хроматограммаспиртовогоэкстракта Р. скгторИвШт
Таким образом, время выхода четвертого компонента обоих исследуемых образцов совпадает со временем выхода эталонного образца - дигидрокверцетина.
С целью подтверждения идентификации четвертого компонента использовали метод добавки. При добавлении стандартного дигидрокверцетина в исследуемые экстракты на хроматограммах наблюдалось увеличение площади 4-го пика, свидетельствующее о том, что данный пик принадлежит дигидрокверце-тину.
На следующем этапе по хроматограммам спиртовых экстрактов глубинных культур, а также стандартного дигидрокверцетина, полученным методом ВЭЖХ, рассчитано его количество у Р. ostreatus и Р. сИтторНеа^, которое составило 0,68 ± 0,03 и 0,60 ± 0,02 % от абсолютно сухой биомассы соответственно.
Для исследования состава функциональных групп четвертого компонента, выделенного с помощью препаративной ВЭЖХ, использовали метод ИКС. Индивидуальные соединения, соответствующие 4-му пику (см. рисунки 2 и 3) на хроматограммах, собирали на выходе из колонки. Инфракрасный спектр вещества содержит полосы поглощения, соответствующие валентным и деформационным колебаниям различных функциональных групп, иных фрагментов молекул и химических связей (Прикладная ИК-спектроскопия..., 1982; Наканиси, 1965). Полученные инфракрасные спектры пиков 4-х компонентов экстрактов
ВЫВОД
Впервые в глубинных культурах P. ostreatus и P citrinopileatus - ксилотрофных базидиомицетов рода Pleurotus обнаружены биофлавоноиды. Установлено, что суммарное содержание этих соединений у P ostreatus и P citrinopileatus достигает 2,4 ± 0,1 и 4,1 ± 0,2 % в расчете на абсолютно сухую биомассу соответственно.
В составе биофлавоноидов с помощью современных физико-химических методов - высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и инфракрасной спектроскопии (ИКС) идентифицирован дигидрокверцетин. Определено, что его содержание в исследованных культурах близко и составляет в сухой биомассе 0,6-0,7 %.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Флавоноиды / И. Л. Кнунянц [и др.] // Химическая энциклопедия. - М. : Советская энциклопедия, 1990, - 673 с. Машковский, М. Д. Лекарственные средства / М. Д. Маш-
ковский. - М. : Новая Волна, 2005. - С. 629-630. Pew, J. C. A Flavonon from Douglas-Fir Heartwood / J. C. Pew // J. Am. Chem. Soc. 1948. - V. 70. - N 9. - P. 3031-3034. Патент РФ № 2158598. Способ получения дигидроквер-
Р ostreatus и Р аМпорНеаи сравнивали со спектром эталонного образца дигидрокверцетина.
В таблице приведены характеристические частоты колебаний структурных элементов и углерод-углеродных связей стандартного дигидрокверцетина и индивидуального вещества 4-го пика глубинных культур в инфракрасной области.
Структура дигидрокверцитина представляет собой конденсированную систему двух колец (бензольного с двумя гидроксильными группами и гетероциклического с одной карбонильной и одной гидроксильной группами), а также фенильный заместитель с двумя гидроксильными группами (Исследование методов синтеза..., 2012). Как видно из таблицы характеристические частоты колебаний структурных элементов и связей стандартного дигидрокверцетина соответствуют его строению и полностью совпадают со спектрами индивидуального вещества 4-го пика глубинных культур в инфракрасной области.
Pleurotus citrinopileatus
2938 1640...1716 1610 1380 720...850
цетина / В. А. Бабкин, Л .А. Остроухова, Д. В. Бабкин, Ю. А. Малков // Б.И. 2000 г. № 31.
Химический состав глубинной культуры ксилотрофных базидиомицетов рода Р1еигоЫз / В. В. Тарнопольская [и др.] // Хвойные бореальной зоны, 2014. - № 1-2. - С. 79-81.
Адихотдаев, К. Б. Определение флавоноидов в растительном сырье / К. Б. Адихотдаев, А. И. Баньковский, В. И. Глызин // Фармация. - 1977. - № 3. - С. 3-27.
Перри, С. Практическое руководство по жидкостной хроматографии / С. Перри, Р. Амос, П. Брюер. - М. : Мир, 1974. - 260 с.
Шатц, В. Д. Высокоэффективная жидкостная хроматография / В. Д. Шатц, О. В. Сахар-това. - Рига : Зинатне, 1988. - 390 с.
Хенке, Х. Жидкостная хроматография / Х. Хенке. - М. : Техносфера, 2009. - 264 с.
Прикладная ИК-спектроскопия: основы, техника, аналитическое применение / Под ред. А. А. Мальцева. - М. : Мир, 1982. - 328 с.
Наканиси, К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений / К. Нака-ниси. - М. : Мир, 1965. - 216 с.
Исследование методов синтеза, строения и свойств комплексов флавоноидов с иона-ми металлов. Сообщение 1. Синтез и установление строения комплексов и солей дигидро-кверцетина с цинком, медью (II) и кальцием в водных растворах / Н. Н. Трофимова и [др.] // Химия растительного сырья. - 2012. - № 2. - С.51-62.
Таблица - Характеристические частоты колебаний структурных элементов и связей
Тип колебания, структурный элемент, _волновое число, см-1[10]_
Дигидрокверцетин Pleurotus ostreatus
Валентное, - О - Н, 2500...3300 Валентное, - С = О, 1600...1900 С - С связи в ароматическом кольце, 1480..
Деформационное, - ОН, 1340... 1420 _Деформационное, = С - Н, 725...900
1610
2850...2959 1615 1590 1380 720...850
2930 1716 1600 1380 720...850
Поступила в редакцию 25.12.15 Принята к печати 10.05.16
